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摘要

果蝇幼虫能联想到刺激气味，味觉奖励。在这里，我们描述了一个简单的行为范式，使食欲关联嗅觉学习分析。

摘要

在下面，我们将介绍的食欲联想在果蝇嗅觉学习方法的细节。的设置，与遗传干扰的组合，提供了一个手柄来分析在一个简单的幼虫脑特异性关联学习的神经细胞和分子的基本面。

生物可以用过去的经验来调整现在的行为。这种行为的潜在的收购可以定义为学习，这些记忆痕迹的潜力，1-4的物理基础。神经科学家试图了解这些过程是如何组织的分子和神经元在大脑中的变化，通过使用各种方法模式生物，从昆虫到脊椎动物5,6。对于这样的努力是有帮助的使用是简单和实验模型系统，。 果蝇幼虫已被证明是满足这些需求的基础上提供强大的行为分析，存在的各种转基因技术的基本组织的神经系统，包括约10000个神经元（虽然与一些让步：认知的限制，一些行为的选择，和丰富的经验可疑）7-10 。

果蝇幼虫可以形成协会气味和食欲的味觉增强，如糖​​11-14之间。在一个标准的检测，在实验室中成立B.格柏，动物收到两气味的倒数培训：第一组的幼虫接触到的气味，连同与味觉增强剂（白糖奖励），随后接触到的气味B没有加固9。同时接收倒数第二组的幼虫经历气味A的训练，而没有加固，随后暴露于气味乙加固（糖的奖励）。在下面的两个群体是工商业污水附加费特德自己的喜好两者之间的气味。相对较高的奖励气味的偏好反映联想学习 - 的性能指数（PI）。有关的各项性能指标的关联性的结论是令人信服的，因为除了从应急的气味和促味剂，其它参数，如气味和奖励曝光，通过时间和处理没有显着差异，两组9。

研究方案

1。准备

  1. 果蝇野生型幼虫被提出，在25°C和60％-80％的湿度在14/10光/暗周期。对于控制的确切年龄的幼虫始终成一小瓶（6厘米的高度和直径2.5 cm），其中包括约6毫升的标飞的食物，男10例，女20例。苍蝇产卵12小时，并在第二天被转移到一个新的小瓶。 5-6天后产蛋幼虫达到馈送第三龄期，如果在25℃引发，现在可以被用于行为实验。然而，一个具有确保只幼虫，仍然是在食品和不是从侧面的小瓶的幼虫。这些幼虫已经达到了“流浪3龄阶段” -在短期内化蛹前-和它们的用法的解释复杂化的结果。
  2. 制备的2.5％琼脂的培养皿中（其他实验室用1％的琼脂浓度在整个实验过程中，如何越来越低的浓度可能允许投喂3 龄幼虫挖底物）：称取2.5 g琼脂糖凝胶在100毫升DDH 2 O烧热在微波炉中的溶液，直到它开始沸腾。小心地搅拌溶液，将它放入微波炉加热，直到所有的琼脂糖溶解。倒入热的琼脂糖溶液倒入培养皿的陪替氏培养皿的底部，使得被完全覆盖的琼脂糖溶液形成光滑的表面。让溶液冷却至室温，并关闭盖子。不要马上关闭盖子，因为这将允许冷凝水的盖子。
  3. 2M果糖培养皿的制备：称取2.5 g琼脂糖在100毫升DDH 2 O（再次，使用1％的琼脂浓度是可能的，但它可能会允许饲养3龄幼虫挖成的底物）。烧热在微波炉中的溶液，直到它开始沸腾。仔细搅拌解决方案，并把它放回微波，直到所有的琼脂糖溶解。小心热溶液中加入35克的果糖，，慢慢搅拌混合物，直到糖溶解，避免沸腾迟缓。倒入热的果糖琼脂糖溶液倒入陪替氏培养皿的底部，使得被完全覆盖和果糖的琼脂糖溶液形成光滑的表面。让溶液冷却至室温，并关闭盖子。不要马上关闭盖子，因为这将允许冷凝水的盖子。
  4. 制备的1 - 辛醇（OCT）的气味容器：填写10微升纯十月到一个定制特氟隆气味容器和关闭它的盖，有几个小的孔，以允许蒸发的气味。容器的详细描述给定的格柏和施托克尔2007中。准备三个气味容器10月。气味容器允许插入的化学品的蒸发，但避免幼虫可以直接联系他们。因此，在这里描述的实验的具体解决嗅觉学习，幼虫不会扰动味觉的副作用。
  5. 戊酯（AM）的气味容器的制备：取AM 1:50石蜡油。填充到一个自定义自制特氟隆气味容器的稀释液的10微升，并关闭它的盖，有几个小的孔，以允许蒸发的气味。准备三个气味的容器AM。的稀释是很重要的现实的原因，即避免强烈的气味比其他可能掩盖了学习相关的变化，两者之间的相对偏好气味的偏好。两个气味的平等的吸引力可能需要将之前的实验中，通过施加与天真动物的稍后描述的测试（2.5）在实验室中证实。这里介绍的值是基于一些出版物的Gerber实验室最近被复制我们的实验室9,15,16。
  6. 标签的培养皿中的行为学实验之前，所有的培养皿中进行编码。这意味着，果糖含有培养皿有被标记为与一个“X”或一个“A”和琼脂糖只培养皿与​​一个“Y”或“B”的例子。此代码应该被揭露出来后，所有数据都被记录的实验者。通过执行实验“盲”，因此不可能的实验者的预期可能会影响性能的幼虫。为了简化理解为广大的读者，下面我们将谈论的气味作为条件刺激（CS1，CS2），奖励时，果糖培养皿（+）或无报酬时，仅琼脂糖陪替氏培养皿（ - ）。

2。糖奖励培训和测试

  1. 收集30投喂3 龄幼虫的食品瓶。转入他们的第一个培养皿中，包含了一些滴自来水，小心地向前和向后移动，用刷子。将它们传输到第二个培养皿中，也包含了一些滴自来水华盛顿，以检查，没有食物糊仍然幼虫的体壁，，否则幼虫将能够在实验过程中体验到食物的气味。这可能会掩盖在学习过程中，他们的表现在测试的情况。
  2. 培训：培训幼虫相关联的气味，食欲糖提示下制度。沽上的左和右侧的一个“X”标记的OCT气味容器-因此，含果糖奖励的陪替氏培养皿（+）（“盲”实验中，详细信息，请参阅1.6）。组30投喂3 龄幼虫上的培养皿中，盖上盖子，等待5分钟，而动物暴露华侨城。确保幼虫被困在里面的水滴，可以克服表面张力的。 ，幼虫可以自由移动培养皿上，体验嗅觉和/或味觉的刺激。
  3. 培训：从培养皿中取出幼虫用湿刷和转移米到第二培养皿]是与一个“Y”标记-因此，琼脂糖只（ - ）含有培养皿-和位于它的左侧和右侧的容器具有的AM气味。盖上盖子，等待5​​分钟，而动物暴露于AM。
  4. 培训：重复2.2）和2.3）的两倍，所有30个幼虫经历了三个训练周期：CS1 /（+） - CS2 /（ - ），（+） - CS1 / CS2 /（ - ）; CS1 /（+） - CS2 /（ - ）。在这个实验中，，CS1表示OCT和CS2代码为AM。
  5. 测试：将一个AM和一个OCT气味，容器的网站的琼脂糖只的培养皿上的反对。受过训练的动物转移到测试培养皿中间。盖上盖子，等待5​​分钟。随后的幼虫的数目进行计数的左侧，中间和右侧的侧的测试培养皿。
  6. 重复步骤2.1）2.5），第二组30投喂3 龄幼虫，但交换实验的角色的AM和华侨城等，这些动物会收到以下培训：CS2/（+） - CS1 /（ - ）; CS2 /（+） - CS1 /（ - ）; CS2 /（+） - （ - ）CS1 /。在这个实验中，，CS1表示OCT和CS2代码为AM。
  7. 可能安排的培训。以上我们提出了一个培训存在的三个培训试验或OCT /（+） - AM /（ - ）/（ - ）或在对等组的三个培训试验的AM /（+） - OCT。然而，为了避免在训练序列依赖性的影响，重要的是不同的序列的以下重复完整的实验中的刺激。通过改变CS1或CS2顺序和奖励文稿在所述第一或第二呈现板，四个不同的序列的训练试验是可能的：
第一组 CS1 /（+） - CS2 /（ - ） 交换组 CS2 /（+） - CS1 /（ - ）
CS1 /（ - ） - CS2 /（+） CS2 /（ - ） - CS-1 /（+）
CS2 /（+） - CS2 /（ - ） CS1 /（+） - CS2 /（ - ）
CS2 /（ - ）（+） - CS1 / CS1 /（ - ） - CS2 /（+）

为了防止系统的周边的实验环境刺激的影响，应该执行其中之一的测试中的二分之一的情况下的条件，使得OCT提出，在左边和AM到右侧。在其他的情况下的一半AM应呈现在左侧和OCT在右边。

3。测试任务相关的感官电机学院

上述实验的设计允许在野生型馈送3龄幼虫，在其自己的分析臭味糖学习。然而，在日常的实验室生活研究者通常使用两个或更多个不同的实验组的幼虫的比较，如果嗅觉学习取决于看齐在开发过程中添加满足特殊基因，一组特定的神经细胞，突变体的股票，一种特殊的食品的饮食，不同的饲养条件下，有毒化学品，等等。因此，在所有情况下，当两个或多个测试实验组的幼虫做了强制控制实验来测试，如果不同群体的幼虫显示正确的感觉运动视力。这将成为强制性的，并不一定是由于潜在的表型是减少或取消的能力，联营公司与糖的气味。相反，可以根据潜在的学习缺陷的缺陷，在感官电机电路的任何步骤中的处理中的气味和/或糖。或者换句话说，如果一个突变的幼虫是无法感测糖，它不能建立一个糖存储器。但是，这并不让得出的结论是，幼虫不能学习。详细的对照实验，测试OCT，AM和果糖，适当处理的转基因幼虫，有许多工作要做。

1。测试天真OCT preference

收集30投喂3 龄幼虫的食品瓶。仔细地把它们洗干净的自来水2.1。琼脂糖培养皿中的一个侧面上，提出一个单一的的的OCT气味容器的幼虫上的培养皿中，盖上盖子，等待5​​分钟，这样，幼虫可抓取的培养皿东方对OCT气味源。随后幼虫的数目进行计数的左侧，中间和测试的陪替氏培养皿上的右侧。

2。为天真AM偏好测试

收集30投喂3 龄幼虫的食品瓶。仔细地把它们洗干净的自来水2.1。琼脂糖培养皿中的一个侧面上，提出一个单一的AM气味容器的幼虫上的培养皿中，盖上盖子，等待5​​分钟，这样，幼虫可抓取的培养皿东方对AM气味源。随后数一数升arvae的左侧，中间和测试的陪替氏培养皿上的右侧。

3。测试幼稚糖偏好

收集30投喂3 龄幼虫的食品瓶。仔细地把它们洗干净的自来水2.1。准备陪替氏培养皿在一个一半和2M果糖琼脂糖混合物中的另一半，包含2.5％的琼脂糖。添加到培养皿中的幼虫，盖上盖子，等待5​​分钟，这样，幼虫可抓取的的培养皿东方向的果糖含侧。随后幼虫的数目进行计数的左侧，中间和测试的陪替氏培养皿上的右侧。

制备的一半半培养皿：准备上述1.2节中的普通琼脂糖平板。当琼脂糖填充培养皿被冷却下来，仔细切断琼脂糖用手术刀沿垂直轴。删除一半的琼脂糖从陪替氏培养皿中。一西元一个热果糖的琼脂糖溶液（制备见1.3）的陪替氏培养皿的空半。要特别小心，两个半匹配，并没有形成一个定义的边缘-这会影响幼虫的选择行为，使行为分析相当困难的。4。

深培训

尽管测试，如果转基因投喂3 龄幼虫最近一直在野生型水平之间的OCT和空气（3.1），AM和空气（3.2）和糖和纯琼脂糖（3.3），一组额外的测试实验能够区分介绍（讨论Gerber和斯托克，2007年）。这些实验的基本原理如下。在培训期间幼虫进行大量的处理和连续的气味和糖刺激。因此，这是非常可能的，所观察到的学习表型是误导性的（虽然天真气味和糖感知试验上的野生型水平！）。事实上，它是可能的转基因动物ðiffer从野生型幼虫的抗应激能力，动机，疲劳，感觉适应，情境学习和饱腹感的变化。因此，米歇尔斯等人 （2005）提出控制测试是否一个给定的突变体能够：（1）检测AM与一个空气味容器中的幼虫，如果你把在训练中完全一样，除非你省略的奖励，而只是暴露在两个气味;（4（2）检测后，同样的制度，OCT（3）检测与一个空气味容器上午，如果你对幼虫的培训方式，除非你忽略的气味，仅仅暴露的奖励; ）检测到十月后，相同的方案。对于一个全面的讨论和方法的进一步详细信息，请参阅米歇尔斯等人 （2005年）和Gerber和储（2007）。

4。数据分析糖悬赏学习

  1. 为了评估糖奖励学习协议的数据计算出OCT偏好指数（PREF OCT）的每个的两个往复运动美云的训练组：
    第一组接受OCT /（+） - AM /（ - ）培训：
    PREF华侨城（OCT + / AM）=（的幼虫在OCT侧的 - ＃幼虫AM侧）/所有的幼虫在左，右，中区
    对于第二组，AM /（+） - OCT /（ - ）培训：
    PREF调幅（AM + / OCT）=（＃AM侧 - ＃幼虫幼虫在OCT侧）/＃的所有幼虫在左，右，中区
  1. 计算性能指数（PI）两个PREF值4.1）。的PI联想学习的气味和惩罚暴露的时间和处理，通过消除扰动的影响：
    PI =（PREF华侨城（OCT + / AM）+：PREF AM（AM + / OCT））/ 2
    因此，督察范围从-1到1之间。显着的负值代表厌恶学习，而显着的正面的价值观描述食欲的学习。一个完整的实验通常包括10个或更多的督察。数据可视化的箱线图includin克的所有值给定的实验组。位于内盒的50％的值被表示为粗线内的箱形图的性能指标中位数。

5。数据分析任务相关的感官电机学院

  1. 评估数据进行测试时，适当的的OCT气味处理计算OCT气味的偏好指标如下：
    气味PREF华侨城（OCT侧的幼虫 - 幼虫的另一边）= /＃的所有幼虫在左，右，中区
  2. 评估数据进行测试时，进行适当的AM的气味感知计算AM气味的偏好指标如下：
    气味PREF AM =（AM侧的幼虫 - 幼虫的另一边）/左，右和中间区域内的所有幼虫
  3. 评估时的数据测试适当的果糖感知的计算的果糖偏好指数如下：
    PREF果糖=（＃幼虫的另一边的幼虫果糖侧 -）/＃内的左，右和中间区的所有幼虫
  4. 假培训详情米歇尔斯等人，2005年中给出。

结果

图1A示出了概述幼虫嗅觉联想学习的实验程序。通过配对两个气味之一与糖奖励幼虫获得表达朝向比较风范气味的奖励的气味中的一个有吸引力的响应潜在的行为。两组的幼虫始终的培训，通过配对的气味OCT或AM的增强剂。性能指数（PI）测量的相关功能之间的相互培训的群体偏好的差异。

在相关功能进行了分析，在转基因幼虫，基本感觉运动能力的测试是必需?...

讨论

在果蝇幼虫所描述的设置允许关联嗅觉学习的同等小学大脑内的调查。方法很简单，价格便宜，易于在实验室建立的，并不需要高科技设备9。我们提出了一个版本的实验中，研究食欲联想学习，加强果糖奖励11。所描述的设置是根据一系列的参数化的全面的调查研究，训练试验的数目的变化的，单一的检测与质量测定，保留时间，使用的气味和气味的浓度和性别9,15...

披露声明

没有利益冲突的声明。

致谢

我们要特别感谢他们的实验装置和意见的手稿上的技术指导，的格柏实验室的成员。我们也感谢柳博芙·Pankevych飞的维修保养及野生型各州股票。这项工作是支持的DFG授予，的SNF授予31003A_132812 / 1和康斯坦茨大学的Zukunftskolleg（TH1584/1-1所有的AST）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
的试剂的名称 公司 目录编号 CAS号
果糖西格玛 47740 57-48-7
氯化钠 Fluka公司 71350 7647-14-5
琼脂糖西格玛 A5093 9012-36-6
1 - 辛醇西格玛 12012 111-87-5
乙酸戊酯西格玛 46022 628-63-7
灯油西格玛 18512 8012-95-1

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