에 Appetitive 연관 강한 학습<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

요약

Drosophila의 애벌레는 gustatory 보상과 냄새 자극을 연결 할 수 있습니다. 여기 appetitive 연관 후각 학습의 분석을 할 수있는 간단한 행동 패러다임을 설명합니다.

초록

다음에 우리는 Drosophila의 애벌레에 appetitive 연관 후각 학습의 방법론 자세한 내용을 설명합니다. 설정은, 유전자 간섭와 함께, 간단한 애벌레의 뇌에 구체적으로 연관 학습의 neuronal와 분자 기초를 분석 할 수있는 핸들을 제공합니다.

생물은 현재 동작을 조정하는 과거의 경험을 사용할 수 있습니다. 행동 잠재력 이러한 인수는 학습으로 정의하고, 메모리 트레이스 ^1-4 이러한 가능성의 물리적 기반. 할 수 있습니다 Neuroscientists이 프로세스가 곤충에서 vertebrates ^5,6에 이르기까지 다양한 모델 생물의 다양한 방법을 사용하여 뇌의 분자와 neuronal 변화의 관점에서 구성하는 방법을 이해하려고합니다. 이러한 노력에 대한 간단하고 실험적으로 액세스 할 수 있습니다 모델 시스템을 사용하는 도움이됩니다. Drosophila의 유충이에 따라 이러한 요구를 충족하기 위해가되었습니다^7-10 강력한 행동 assays, 유전자 변형 기술의 다양성과 약 10,000 뉴런을 (인지 제한, 몇 가지 행동 옵션 및 의심 경험 풍부한 일부 할인 혜택이있는에도 불구하고)를 포함하는 신경계의 초등학교 조직의 존재의 가용성 .

Drosophila의 애벌레는 악취, 설탕 ^11-14 같은 appetitive gustatory 강화 사이의 연관 관계를 형성 할 수있다. 표준 검정에서 B. 거버의 연구실에 설립, 동물은 두 냄새 상호 교육을받을 : 애벌레의 첫 번째 그룹은 gustatory reinforcer (설탕 보상)와 함께 냄새에 노출되어 이후 냄새에 노출되어 강화 ^아홉없이 B. 보강하지 않고 냄새가 발생하고 이후 강화 (설탕 보상)와 악취 B에 노출되는 동안 한편 애벌레의 두 번째 그룹은 상호 교육을받습니다. 다음의 두 그룹 tes 아르두 냄새 사이의 환경 설정에 대한 테드. 보상 냄새에 대한 상대적으로 높은 환경 설정 연관 학습을 반영 - 성능 지수 (PI)로 제시했다. 성능 색인의 결합 특성에 대한 결론은 떨어져 냄새와 tastants 등 냄새 및 보상에 노출, 시간 및 취급의 통로 두 그룹 ⁹ 다를하지 않는 등 다른 매개 변수 사이의 우발적의 때문에 눈길을 끄는 것입니다.

프로토콜

1. 준비하기

1. Drosophila 야생 형 유충은 25 제기 ° C와 10분의 14 라이트 / 어두운주기에 60% -80 %의 습도. 항상 20 여자는 표준 플라이 식품의 약 6 ML을 포함 한 병 (6cm의 높이와 2.5 cm 직경)에 10 남성시킨 애벌레의 정확한 연령을 제어하십시오. 파리는 12 시간에 알을 낳기 위해 허용하고 두 번째 날에 새로운 유리 병으로 전송됩니다. 25 ° C에서 제기되어, 지금은 행동 실험을 위해 사용할 수있을 경우 계란 누워있는 애벌레 후 5~6일는 먹이 ³ instar 단계에 도달합니다. 그러나, 하나는 유리 병의 측면에서 애벌레가 아닌 음식을 아직하고 애벌레 만 취할 수 있도록합니다. 이 애벌레는 이미 "방황 ³ instar 단계"에 도달 한 - 곧 pupation 전에 -과 사용법은 결과의 해석을 복잡하게.
2. 2.5 % 아가로 오스 배양 접시의 준비 (다른 실험실에서 실험을하는 동안도 1 %의 한천 농도를 사용하는 방법어느 낮은 농도는 먹이 ³ instar의 애벌레)은 기판에 파를 허용 할 수 있습니다 : 100 ML ddH ₂ O.에서 2.5 g 아가로 오스를 해산 가 끓는 시작할 때까지 전자 레인지에서 솔루션을 가열. 조심스럽게 솔루션을 선동하고 모든 아가로 오스가 해소 될 때까지 전자 레인지에 돌려 놓을. 배양 접시의 바닥이 완전히 적용하고 아가로 오스 솔루션은 매끄러운 표면을 형성되는 등 배양 접시에 따뜻한 아가로 오스 솔루션을 넣어. 솔루션은 실내 온도로 냉각하고 뚜껑을 닫습니다 보자. 이 뚜껑에 물을 응축 할 수 있도록하기 때문에 즉시 뚜껑을 닫고하지 마십시오.
3. 2M 과당 배양 접시의 준비 : 100 ML ddH ₂ O (다시 1 % 한천 농도의 사용이 가능하지만이 ³ instar의 애벌레가 기판에 ​​파고 먹이를 허용 할 수 있습니다)에 2.5 g 아가로 오스를 해산. 가 끓는 시작할 때까지 전자 레인지에서 솔루션을 가열. 조심스럽게 솔루션을 선동하고 마이크로으로 다시 넣어모든 아가로 오스까지 파도가 해산되어 있습니다. 조심스럽게 뜨거운 용액에 과당의 35g을 추가하고, 설탕은 끓는 지체를 피하기 위해 해산 될 때까지 천천히 혼합물을 선동. 바닥이 완전히 적용과 과당 - 아​​가로 오스 솔루션은 매끄러운 표면을 형성되는 등 배양 접시에 뜨거운 과당 - 아​​가로 오스 솔루션을 넣어. 솔루션은 실내 온도로 냉각하고 뚜껑을 닫습니다 보자. 이 뚜껑에 물을 응축 할 수 있도록하기 때문에 즉시 뚜껑을 닫고하지 마십시오.
4. 1 octanol (OCT) 악취 컨테이너의 준비 : 테플론 냄새 컨테이너를 만든 사용자 정의로 순수 10월의 10 μl를 입력하고 냄새의 증발 할 수 있도록하는 방법에는 여러 작은 구멍이있는 뚜껑으로 닫습니다. 컨테이너에 대한 자세한 설명은 거버와 스토커 2007 년에 제공됩니다. 10월위한 세 가지 냄새 용기를 준비합니다. 냄새 컨테이너는 삽입 된 화학 물질의 증발을 허용하지만, 애벌레 직접 연락 할 수 마십시오. 따라서 여기에서 설명한 실험 구체적으로gustatory 부작용을 perturbing하지 않고 유충의 후각 학습을 해결합니다.
5. amylacetate (AM) 악취 컨테이너의 준비 : 희석는 파라핀 오일에서 오전 1시 50분. 맞춤 제작 테플론 냄새 컨테이너에 희석의 10 μl를 입력하고 냄새의 증발 할 수 있도록하는 방법에는 여러 작은 구멍이있는 뚜껑으로 닫습니다. AM위한 세 가지 냄새 용기를 준비합니다. 희석은 두 냄새 사이의 상대적 선호의 학습에 의존 변화를 마스크 수있는 다른 통해 하나 냄새에 대한 강한 선호를 피하기 위해, 즉 실용적인 이유로 중요합니다. 두 냄새에 대한 동등한 매력은 순진한 동물과 뒷부분에서 설명하는 테스트 (2.5)를 적용하여 실험하기 전에 실험실에서 확인해야 할 수 있습니다. 여기에 제시된 최근 우리 연구소 ^9,15,16에 의해 복제 된 거버 연구소의 여러 간행물을 기반으로 값.
6. 배양 접시의 라벨 : 행동 실험을하기 전에 모든 페트리 요리 코딩해야합니다. 그런 의미배양 접시를 포함하는 과당은 "X"또는 "A"와 "Y"또는 "B"와 아가로 오스 만 페트리 요리 예를 들어 표시해야합니다. 이 코드는 모든 데이터가 기록 된 후에 만​​ 실험에 공개해야합니다. 실험을 수행하여 그 실험의 기대는 애벌레의 성능에 영향을 미칠 수 있으므로 가능한 '맹인'은 아닙니다. 우리가 오직 아가로 오스에 표시 할 때 과당 페트리 접시 (+) 또는 비 보상에 표시 할 때 하나 보상이 설치된 자극 (CS1 또는 CS2) 등의 냄새에 대해 이야기합니다 다음에 폭 넓은 독자층에 대한 이해를 쉽게하기 위해 페트리 접시 (-).

2. 슈가 보상 교육 및 시험

1. 식품 유리 병에서 30 수유 ³ instar의 애벌레를 수집합니다. 수돗물의 일부 방울을 포함하는 첫번째 페트리 접시로 갈아 조심스럽게 브러시로 앞으로 및 뒤로를 이동합니다. 또한 탭 구미시의 일부 방울을 포함하는 두 번째 페트리 접시로 전송적이 더 음식 붙여 넣기가 애벌레의 bodywall에 남아 없다는 것을 확인하는, 그렇지 않으면 애벌레에서 실험이 진행되는 동안 음식 냄새를 체험 할 수있을 것입니다. 이 가능성이 테스트 상황에서 학습 과정과 성능을 가리는 것입니다.
2. 교육 : appetitive 설탕 큐 다음 정권과 연관 냄새에 애벌레를 양성하는이 적용됩니다. 표시 "X"의 왼쪽과 오른쪽에 10월 냄새 컨테이너를 넣어 - 따라서, 과당 보상 (자세한 내용은 1.6 참조에 대해 "맹인"실험) (+) 페트리 접시를 포함. 페트리 접시의 중간에 30 수유 ³ instar의 유충의 그룹을 넣고, 뚜껑을 닫고 동물 10월에 노출되는 동안 5 분 기다립니다. 유충이 물 드롭 안에 갇혀 있지 않고, 그것의 표면 장력을 극복 할 수 있는지 확인하십시오. 그 애벌레가 자유롭게 페트리 접시에 이동 후각 및 / 또는 gustatory 자극을 경험할 수 있습니다.
3. 교육 : moistened 브러시로 페트리 접시에서 애벌레를 제거하고 전송따라서, 아가로 오스 만 (- -) 페트리 접시를 포함하는 - "Y"으로 표시됩니다 두 번째 페트리 접시 위에 m와는 왼쪽과 오른쪽에있는 AM 냄새 컨테이너가 있습니다. 뚜껑을 닫고 동물 AM에 노출되는 동안 5 분 기다립니다.
4. 교육 : 두 번 반복 2.2) 및 2.3) 등 모든 30 애벌레의 경험 세 교육주기 : CS1 / (+) - CS2 / (-), CS1 / (+) - CS2 / (-), CS1 / (+) - CS2 / (-). 이 실험에서는 CS1은 AM에 10월 및 CS2 코드를 나타냅니다.
5. 테스트 : 장소 하나가 오전과 아가로 오스 전용 페트리 접시의 반대 사이트에 하나 10월 냄새 컨테이너. 테스트 페트리 접시의 중간에 훈련 동물을 전송합니다. 뚜껑을 닫고 5 분 기다립니다. 그 후 왼쪽, 시험 페트리 접시의 중간과 오른쪽에 유충의 수를 계산합니다.
6. 30 수유 ³ instar의 애벌레의 두 번째 그룹과 2.5)에 단계 2.1) 반복하지만, AM과 10월 동물은 다음과 훈련을받을 그러한 실험 역할을 교환 : CS2/ (+) - CS1 / (-), CS2 / (+) - CS1 / (-), CS2 / (+) - CS1 / (-). 이 실험에서는 CS1은 AM에 10월 및 CS2 코드를 나타냅니다.
7. 교육에 대한 가능성이 조치. 우리가 10월 / (+) 중 세 가지 교육 실험의 존재 훈련을 제시 위 - AM / (-) 또는 AM / (+)의도 세 교육 시험의 상호 그룹 - 10 / (-). 교육 기간 동안 순서에 의존 효과를 방지하기 위해하지만 그것은 완전한 실험의 다음 반복에서 자극의 순서를 변경할 중요합니다. CS1 또는 CS2 순서와도 첫 번째 또는 두 번째 제시 판에 보상 프리젠 테이션을 변화함으로써, 교육 시험에 대한 네 가지 절차가 가능합니다 :

첫 번째 그룹	CS1 / (+) - CS2 / (-)	상호 그룹	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

주변 실험 환경에서 자극의 체계적 효과를 방지하기 위해, 하나는 10월이 왼쪽에 표시하고 오른쪽에 AM되는 등의 사례 중 하나를 반으로 테스트를 수행해야합니다. 사건의 다른 반쪽에서 오른쪽에있는 왼쪽 10월에 나타납니다입니다.

3. 작업과 관련된 감각 - 모터 학부에 대한 시험

위에서 설명한 실험의 디자인은 그 자체로 ³ instar의 애벌레 먹이를 야생 유형에 냄새 설탕 학습을 분석 할 수 있습니다. 후각 학습 파에 따라 달라집니다 경우, 일일 실험실 생활 연구원에 일반적으로 비교 애벌레의 두 개 이상의 서로 다른 실험 그룹을 사용ticular 유전자 뉴런의 특정 세트, 돌연변이 주식, 특별 음식 다이어트, 서로 다른 양육 조건, 독성 화학 물질은 애벌레의 두 개 이상의 실험 그룹 테스트 모든 경우에 하나를 수행 있으며, 따라서 등, 개발 중에 추가 애벌레의 다른 그룹 적절한 감각 모터 acuities을 표시하는 경우 테스트하기 위해 의무적으로 제어 실험을 설정합니다. 잠재적 인 phenotypes 반드시 설탕과 연관 냄새를 감소 또는 폐지 능력으로 인해 없기 때문에이 필수가됩니다. 오히려 잠재적 인 학습 결함은 악취 및 / 또는 설탕의 처리에있는 감각 모터 회로의 단계에서 결함을 기반으로 할 수있다. 돌연변이 유충이 의미 설탕 할 수없는 경우 또는 다른 말로, 그것은 설탕 메모리를 설정할 수 없습니다. 그러나 이것은 유충 학습 할 수 성립 허용하지 않습니다. 세부에서 다음 제어 실험 적절한 10 월, AM 및 유전자 변형 애벌레의 과당 처리를위한 테스트 수행해야합니다.

1. 순진한 10월 prefe에 대한 시험rence

식품 유리 병에서 30 수유 ³ instar의 애벌레를 수집합니다. 2.1에 설명 된대로 수돗물에 신중을 씻으십시오. 아가로 오스 페트리 접시의 한쪽에 하나의 10월 냄새 컨테이너를 넣어, 페트리 접시의 중간에 애벌레를 추가 뚜껑을 닫고 애벌레가 10월으로 페트리 접시와 방향에 크롤링 할 수 있도록, 5 분 기다려야 냄새 소스. 그 후 중간에와 테스트 페트리 접시의 오른쪽에, 왼쪽에 유충의 수를 계산합니다.

2. 순진한 AM 환경 설정을위한 시험

식품 유리 병에서 30 수유 ³ instar의 애벌레를 수집합니다. 2.1에 설명 된대로 수돗물에 신중을 씻으십시오. 아가로 오스 페트리 접시의 한쪽에 단일 AM 냄새 컨테이너를 넣어, 페트리 접시의 중간에 애벌레를 추가 뚜껑을 닫고 애벌레는 오전 향해 페트리 접시와 방향에 크롤링 할 수 있도록, 5 분 기다려야 냄새 소스. 그 후 리터의 수를 계산중간과 테스트 페트리 접시의 오른쪽에, 왼쪽에 arvae.

3. 순진한 설탕 환경 설정을위한 시험

식품 유리 병에서 30 수유 ³ instar의 애벌레를 수집합니다. 2.1에 설명 된대로 수돗물에 신중을 씻으십시오. 절반과 다른 반으로 2M 과당 - 아​​가로 오스의 혼합물에 2.5 % 아가로 오스를 포함 배양 접시를 준비합니다. 페트리 접시 위에 애벌레를 추가 애벌레는 과당이 포함 된 편으로 페트리 접시와 방향에 크롤링 할 수 있도록 5 분을 위해 뚜껑을 닫고 기다립니다. 그 후 중간에와 테스트 페트리 접시의 오른쪽에, 왼쪽에 유충의 수를 계산합니다.

이분의 일 반 페트리 요리 준비 : 위의 섹션 1.2에서 설명한 바와 같이 정상적인 아가로 오스 판을 준비합니다. 아가로 오스 가득 배양 접시가 냉각되면주의 깊게 메스 수직 축을 따라 아가로 오스를 잘라. 페트리 접시에서 아가로 오스의 절반을 제거합니다.페트리 접시의 빈 절반 DD는 뜨거운 과당 - 아​​가로 오스 솔루션 (준비를 위해 1.3 참조). 두 반쪽 일치하고 정의 된 가장자리를 형성하지 않는 것이주의 -이 애벌레의 선택 행동에 영향을 오히려 어려운 행동 분석을 렌더링 ^4..

사기 훈련

유전자 변형 먹이 ³ instar의 애벌레가 10월과 공기 (3.1), AM, 공기 (3.2), 설탕 순수한 아가로 오스 (3.3), 테스트 실험의 추가 집합 사이 야생 유형 수준에서 구별 할 수있는 경우 테스트에도 불구하고 최근 왔습니다 (토론 거버와 스토커, 2007 참조) 소개했다. 이 실험에 대한 근거는 다음과 같습니다. 교육 유충 기간 동안 대규모 처리 및 연속 냄새와 설탕의 자극이 거칩니다. 따라서, 그것은 관찰 학습 표현형이 (순진 냄새와 설탕 인식 테스트 야생 형 수준에 있지만!) 오해의 소지가 있다는 잘 수 있습니다. 사실, 가능하다면, 그 유전자 변형 동물 D스트레스 저항, 동기 부여, 피로, 감각 적응, 콘텐츠 학습, 물림의 변화와 관련하여 야생 유형 애벌레에서 iffer. 따라서, Michels 외. (2005)는 당신이 보상을 생략하고 단순히 모두에게 노출된다는 점을 제외하고 그대로 교육하는 동안 애벌레를 처리하는 경우 특정 돌연변이 (1) 감지 할 수 있는지 여부를 테스트 빈 냄새 컨테이너 비해 AM하는 컨트롤을 도입 냄새, 당신이 냄새를 생략하고 단지 보상에 노출 점을 제외 훈련과 같은 방법으로 애벌레를 처리하는 경우 (3), 빈 냄새 컨테이너 비해 AM 감지,, (2) 같은 정권 이후 10월를 감지하고 (4 ) 같은 처방 후 10월을 감지합니다. 종합 토론 및 방법에 대한 자세한 내용은 Michels 외 (2005)와 거버와 스토커 (2007)를 참조하시기 바랍니다.

4. 슈가 보상 학습에 대한 데이터 분석

1. 설탕 보상 학습 프로토콜의 데이터를 평가하기 위해 두 recipro 각각에 대한 10월 환경 지수 (현 10월)를 계산켈리 훈련 그룹 :
   AM / (- -) 10월 / (+)받은 첫 번째 그룹에 대한 교육을 :
   현 10월 (OCT + / AM-) = (# 10월 측에서 애벌레의 - # AM 측에서 애벌레의) / # 모든 애벌레의 왼쪽, 오른쪽과 중간 영역 내에서
   : - 10 / (-) 교육 AM / (+)를받은 두 번째 그룹에 대한
   현 AM (AM + / 월) =가 (# AM 쪽 애벌레의 - # 애벌레의 10월 쪽) / # 왼쪽, 오른쪽 및 중간 영역 내의 모든 애벌레의

2. 4.1에서 두 현 값에 대한 성능 지수 (PI)를) 계산합니다. PI는 냄새와 처벌 노출, 시간 및 취급 통과 perturbing 효과를 취소하여 연관 학습을 나타냅니다 :
   PI = (현 10월 (OCT는 + / AM) + 현 AM (AM + / -10 월)) / 2
   따라서 싸개 동상은 -1에서 1까지 다양 할 수 있습니다. 상당히 긍정적 인 가치가 appetitive 학습을 설명하는 반면에 크게 음수 값은 ave​​rsive, 학습 나타냅니다. 전체 실험은 일반적으로 10 개 이상의 싸개로 구성되어 있습니다. 데이터 상자 플롯의 includin으로 시각화 아르주어진 실험 그룹의 g는 모든 값. 값의 50 %가 상자 내에 위치한되고, 중간 성능 지수는 상자 플롯에서 굵은 선으로 표시됩니다.

5. 작업과 관련된 감각 - 모터 학부에 대한 데이터 분석

1. 적절한 10월 냄새 처리는 다음과 같이 10월 냄새 환경 지수를 계산에 테스트 할 때 데이터를 평가하려면 :
   냄새 현 10월 = (# 10월 측에서 애벌레의 - # 맞은 편에 유충의) / # 왼쪽, 오른쪽 및 중간 영역 내의 모든 애벌레의
2. 적절한 AM 냄새 인식은 다음과 AM 냄새 환경 지수를 계산에 테스트 할 때 데이터를 평가하려면 :
   / # 왼쪽, 오른쪽 및 중간 영역 내의 모든 애벌레의 - 현 AM = (# 다른쪽에 애벌레의 # AM면에 유충의) 냄새
3. 적절한 과당 인식에 대한 테스트를하는 것은 다음과 같은 과당 환경 지수를 계산하면 데이터를 평가하려면 :
   현 과당 = (# 과당 쪽 애벌레의 - # 맞은 편에 애벌레의) / # 왼쪽, 오른쪽 및 중간 영역 내의 모든 애벌레의
4. 체하다 교육에 대한 자세한 내용은 Michels 외에 부여됩니다. 2005.

결과

그림 1A는 애벌레의 후각 연관 학습을위한 실험 절차의 개요를 보여줍니다. 설탕 보상 애벌레와 두 제시 냄새 중 하나를 페어링하면 보수없는 냄새에 비해 보상 냄새에 대한 매력적인 응답을 표현할 수있는 잠재적 인 행동을 습득. 애벌레의 두 그룹은 항상 두 냄새 10월 또는 AM으로 reinforcer을 페어링하여 훈련하고 있습니다. 성능 지수 (PI)는 서로 훈련 집단 간의 선호의 차이로 연관 기...

토론

Drosophila의 애벌레의 설명 설정은 comparably 초등학교 두뇌 속에 연관 후각 학습의 조사 할 수 있습니다. 방법은 실험실에서 확립 할, 간단한 저렴 용이하고 첨단 장비를 ^구가 필요하지 않습니다. 우리는 과당 보상 ^11에 의해 강화 appetitive 연관 학습을 연구하는 실험 버전을 제시한다. 설명 설정이 종합적으로 교육 시험의 수가 변화, 단일 검정 대 질량 분석, 보존 기간, 사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	CAS 번호
프 럭토 오스	시그마	47,740	57-48-7
NaCl	Fluka	71,350	7647-14-5
아가로 오스	시그마	A5093	9012-36-6
1 octanol	시그마	12,012	111-87-5
Amylacetate	시그마	46,022	628-63-7
파라핀 유	시그마	18,512	8012-95-1