Ассоциативный аппетит обонятельного обучения в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки

Резюме

Личинки дрозофилы способны связать запах стимулов с вкусовыми награды. Здесь мы опишем простую поведенческую парадигму, которая позволяет проводить анализ аппетит ассоциативного обонятельного обучения.

Аннотация

В следующем мы описываем методологические детали аппетит ассоциативного обучения в обонятельной личинки дрозофилы. Установки, в сочетании с генетическими помех, обеспечивает ручка для анализа нейронных и молекулярных основах специально ассоциативного обучения в простой личиночной мозга.

Организмы могут использовать прошлый опыт для настройки нынешнего поведения. Такое приобретение поведенческих потенциал может быть определен как обучение, а также физические основы этих потенциалов, как следы памяти ^1-4. Неврологи пытаются понять, как эти процессы организованы с точки зрения молекулярной и нейронных изменений в головном мозге с помощью различных методов в модельных организмов, начиная от насекомых до ^5,6 позвоночных. Для таких усилий было бы полезно использовать модели систем, которые являются простыми и доступными экспериментально. Личинки дрозофилы оказалось удовлетворить эти требования, основанные наНаличие надежных поведенческих тестов, существовании различных трансгенных технологий и элементарных организации нервной системы, содержащей только около 10.000 нейронов (хотя и с некоторыми уступками: когнитивные ограничения, несколько вариантов поведения, и богатство опыта сомнительная) ^7-10 .

Личинки дрозофил могут образовывать связи между запахами и вкусовыми аппетит подкрепление, как сахар ^11-14. В стандартном анализе, созданного в лаборатории Б. Гербер, животные получают два запаха взаимного обучения: первая группа личинок подвергается запах вместе с вкусовыми подкрепления (сахар награда) и последующем воздействии запаха B без подкрепления ^9. Тем временем вторая группа личинок получает взаимный обучение, испытывая запах без подкрепления, а затем подвергаются воздействию запахов B с подкреплением (сахар вознаграждение). В следующем обеих групп ТЭСТед их предпочтения между двумя запахами. Относительно высокие преференции для вознаграждены запах отражает ассоциативное обучение - представлена ​​в виде индекса производительности (PI). Вывод о том, ассоциативный характер индекс производительности является убедительным, потому что кроме резервного между запахами и tastants, другие параметры, такие как запах и награду экспозиции, временем и обработки не отличаются между двумя группами ^9.

протокол

1. Подготовка

1. Дрозофилы дикого типа личинок, поднятых на 25 ° C и 60% -80% влажности в 14/10 светлый / темный цикл. Для контроля точный возраст личинок всегда 20 женщин ставятся с 10 мужчинами в одном флаконе (6 см высотой и 2,5 см в диаметре), что включает в себя около 6 мл стандартной пищи лету. Мухи могут откладывать яйца в течение 12 часов и передаются в новый флакон на второй день. 5-6 дней после откладки яиц личинки достигают кормления ^3-го возраста этапе, если подняты на 25 ° C и может быть использован для поведенческий эксперимент. Тем не менее, необходимо обеспечить, чтобы принимать только личинки, которые все еще находятся в пищу, а не личинки со стороны флаконе. Эти личинки уже достигли «блуждающих ^3-го возраста этапе", - незадолго до окукливания - и их использование усложняет интерпретацию результатов.
2. Подготовка 2,5% агарозы чашках Петри (других лабораториях также использовать агар концентрации 1% в течение всего эксперимента, каквсе более низких концентрациях может позволить кормления ^3-го возраста личинки копаться в подложке): растворить 2,5 г агарозы в 100 мл DDH ₂ O. Нагрейте раствор в микроволновой печи, пока она закипит. Тщательно перемешивать раствор и положил его обратно в микроволновую печь, пока все агарозном растворяется. Залить горячим раствором агарозы в чашки Петри, что в нижней части чашки Петри полностью закрыта, и раствор агарозы образует гладкую поверхность. Пусть решение остыть до комнатной температуры и закрыть крышками. Не стоит сразу же закрыть крышкой, потому что оно позволит конденсации воды на веки.
3. Подготовка 2М фруктозы чашки Петри: растворить 2,5 г агарозы в 100 мл DDH ₂ O (опять же, использование 1% агара концентрации возможна, однако она может позволить кормления ^3-го возраста личинки копаться в подложке). Нагрейте раствор в микроволновой печи, пока она закипит. Тщательно перемешивать раствор и положил его обратно в микро-волны, пока все агарозном растворяется. Осторожно добавьте 35 г фруктозы в горячий раствор, медленно перемешивать смесь, пока сахар не растворится, чтобы избежать кипения отсталости. Залить горячим фруктоза-агарозы решение в чашки Петри таким образом, что нижняя полностью покрыта и фруктоза-агарозы раствор образует гладкую поверхность. Пусть решение остыть до комнатной температуры и закрыть крышками. Не стоит сразу же закрыть крышкой, потому что оно позволит конденсации воды на веки.
4. Получение 1-октанол (ОКТ) контейнеры запах: Fill 10 мкл чистой октября на заказ тефлоновым запах контейнер и закрыть его крышкой, которая имеет несколько маленьких отверстий для обеспечения испарения запах. Подробное описание контейнеров приведены в Gerber и Stocker 2007 года. Подготовить три контейнера запаха октября Запах контейнеры позволяют испарения химических веществ вставлены, но избегай, что личинки могут напрямую связаться с ними. Таким образом, здесь описанных экспериментов специальнорешения обонятельные обучения в личинки без возмущающих вкусовые побочные эффекты.
5. Подготовка amylacetate (AM) контейнеры запах: Разбавить AM 1:50 в парафиновой нефти. Заполнить 10 мкл разведения в заказ контейнера запах тефлона и закрыть его крышкой, которая имеет несколько маленьких отверстий для обеспечения испарения запах. Подготовить три контейнера запаха для АМ. Разведение имеет важное значение для практических соображений, а именно, чтобы избежать сильного предпочтение одного запаха по сравнению с другими, которые могут маскировать обучения зависит от изменения относительного предпочтения между двумя запахами. Равными для обеих привлечению запахи, возможно, придется быть подтвержден в лаборатории до начала эксперимента с применением позже описал испытание (2.5) с наивным животных. Значения Здесь представлены основана на нескольких публикаций лаборатории Gerber, которые недавно были воспроизведены нашей лаборатории ^9,15,16.
6. Маркировка чашки Петри: Перед поведенческих экспериментов все чашки Петри должны быть закодированы. Это означает, чтофруктозы содержащих чашки Петри должны быть отмечены, например, с "X" или "A" и агарозы только чашки Петри с "Y" или "B". Этот код должен быть открыта только после того, экспериментатор все данные были записаны. Проводя эксперименты "слепой" Таким образом, не исключено, что ожидания экспериментатора может повлиять на производительность личинок. Для облегчения понимания широкого круга читателей, в дальнейшем мы будем говорить только о запахов, как условные раздражители (CS1 и CS2), которые либо вознаграждены, когда представленные на фруктозе чашки Петри (+) или не вознаграждены, когда представил на агарозном только Чашка Петри (-).

2. Сахар Обучение Награды и испытаний

1. Соберите 30 кормлении ^3-го возраста личинок из пищи флаконе. Передача их в первую чашку Петри, которая содержит несколько капель воды из-под крана и тщательно перемещать их вперед и назад с помощью кисти. Перенести их на вторую чашку Петри, которая содержит также несколько капель водопроводной ваТер чтобы убедиться, что никакой еды пасты остается на bodywall личинок, в противном случае личинки могли бы испытать запах пищи во время эксперимента. Это, вероятно, скрыть процесс обучения и их производительность в тесте ситуации.
2. Обучение: Для обучения личинок ассоциированных с запахом аппетит кия сахара следующий режим применяется. Поставьте контейнер октября запах на левой и правой стороне «Х» отмечены - таким образом, фруктоза награду содержащие (+) чашки Петри ("слепой" эксперимент, подробнее см. 1.6). Положить группа из 30 кормлении личинок ^3-го возраста на середину чашки Петри, закройте крышкой и подождите 5 минут, в то время как животные подвергаются воздействию октября Убедитесь в том, что личинки не в ловушке внутри капли воды и может преодолеть поверхностное натяжение его. К тому личинки могут свободно передвигаться по чашке Петри и испытать обонятельные и / или вкусовые раздражители.
3. Подготовка: удалить личинок из чашки Петри с увлажненной кистью и передачим на второй чашке Петри, которые помечены "Y" - таким образом, агарозы только (-), содержащие Петри - и не имеет запаха AM контейнер расположен на левой и правой стороне. Закройте крышкой и подождите 5 минут, в то время как животные подвергаются воздействию AM.
4. Обучение: Повторите 2,2) и 2,3) в два раза, так, что все 30 личинок опыт трех учебных циклов: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). В этом эксперименте CS1 представляет октября и CS2 коды AM.
5. Тест: Место 1 утра и одну октября запах контейнера на противоположной сайтов агарозном только чашку Петри. Передача дрессированных животных к середине блюдо тест Петри. Закройте крышкой и подождите 5 минут. Затем подсчитывают число личинок на левой стороне, средней и правой стороне блюдо тест Петри.
6. Повторите шаги 2,1) до 2,5) со второй группой из 30 кормления личинок ^3-го возраста, но поменяться ролями экспериментальной М. и октябре, что животные получают следующую подготовку: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). В этом эксперименте CS1 представляет октября и CS2 коды AM.
7. Возможные мероприятия по обучению. Выше мы представляем обучения, которая существует в трех учебных испытаний либо октябрь / (+) - AM / (-) или в обратном группе также три учебных испытаний AM / (+) - октябрь / (-). Однако, чтобы избежать последовательности зависимых эффектов в процессе обучения важно, чтобы изменять последовательность стимулов в следующем повторении полного эксперимента. Изменяя CS1 или CS2 порядка, а также награду презентации в первом или втором представлены плиты, четыре различных последовательностей для подготовки испытаний возможны:

Первая группа	CS1 / (+) - CS2 / (-)	Взаимное группы	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

Для предотвращения систематических эффектов стимулов в окружающей среде экспериментальной, следует выполнить тест в половине случаев такое, что октябрь представлена ​​на левой и AM с правой стороны. В другой половине случаев утра должны быть представлены на левом и октябре справа.

3. Тесты для целевой значимых Сенсомоторное Факультеты

Дизайн описанных выше экспериментов позволяет проанализировать запах сахара обучения в дикий тип кормления ^3-го возраста личинок на свои собственные. Тем не менее, в повседневной жизни исследователи лаборатории обычно используют два или более различных экспериментальных групп личинок, чтобы сравнить, если обонятельные обучения зависит от номинальнойВ частности ген, определенный набор нейронов, мутант акции, специальное диетическое питание, различные условия выращивания, токсичных химических веществ добавлены в процессе разработки, и т.д. Таким образом, во всех случаях, когда два или более экспериментальных групп личинок тестируются, что нужно сделать Набор обязательных контрольных экспериментов, чтобы проверить, если различные группы личинок показать правильный сенсорно-моторной acuities. Это становится обязательным как потенциальные фенотипы не обязательно за счет снижения или отмены способности ассоциированных запахи с сахаром. Скорее всего, потенциальные обучения дефекты могут быть основаны на дефектах на любом этапе сенсорно-моторные схемы при обработке запахов и / или сахара. Или, другими словами, если мутантный личинки не в состоянии смысле сахара, он не может установить сахара памяти. Но этого не позволяют сделать вывод, что личинки не могут учиться. Подробно следующих контрольных опытов должно быть сделано для проверки надлежащей октября, AM и фруктозы обработки трансгенных личинок.

1. Тест для наивных октября preference

Соберите 30 кормлении ^3-го возраста личинок из пищи флаконе. Вымойте их тщательно в водопроводной воде, как описано в 2.1. Положите одну запаха октября контейнер на одной стороне блюда агарозном Петри, добавить личинок на середину чашки Петри, закройте крышкой и подождите 5 минут, так что личинки могут ползать по чашке Петри и ориентироваться на октябрь Запах источник. Затем подсчитывают число личинок на левой стороне, в центре и на правой стороне блюдо тест Петри.

2. Тест для наивных предпочтение AM

Соберите 30 кормлении ^3-го возраста личинок из пищи флаконе. Вымойте их тщательно в водопроводной воде, как описано в 2.1. Положите одну AM запах контейнер на одной стороне блюда агарозном Петри, добавить личинок на середину чашки Петри, закройте крышкой и подождите 5 минут, так что личинки могут ползать по чашке Петри и ориентироваться на сообщения Запах источник. Затем подсчитать количество лarvae слева, в центре и на правой стороне блюдо тест Петри.

3. Тест для наивных предпочтение сахара

Соберите 30 кормлении ^3-го возраста личинок из пищи флаконе. Вымойте их тщательно в водопроводной воде, как описано в 2.1. Подготовка чашки Петри, содержащие 2,5% агарозном в одной половине и фруктозы 2М-агарозы смеси в другой половине. Добавить личинок на чашке Петри, закройте крышкой и подождите 5 минут, так что личинки могут ползать по чашке Петри и ориентироваться на фруктозе содержащие стороне. Затем подсчитывают число личинок на левой стороне, в центре и на правой стороне блюдо тест Петри.

Подготовка половины половина чашки Петри: подготовка нормальных пластин агарозы, как описано выше в разделе 1.2. Когда агарозном заполнены чашки Петри остынет, аккуратно вырезать агарозном вдоль вертикальной оси с помощью скальпеля. Удалите одну половину агарозы из чашки Петри.дд горячие фруктозой-агарозы раствора (для приготовления см. п. 1.3) в пустую половину чашки Петри. Будьте осторожны, чтобы обе половины матча и не образуют определенный край - это влияет на выбор поведения личинок и оказывает поведенческого анализа довольно сложно ^4..

Sham обучения

Несмотря на испытания, если трансгенные кормления ^3-го возраста личинки способны различать на диком уровне типа между октябрем и воздушного (3,1), AM и воздуха (3,2), сахар и чистое агарозы (3,3), дополнительный набор тестовых экспериментов в последнее время введено (для обсуждения см. Гербер и Stocker, 2007). Основанием для этих экспериментов заключается в следующем. Во время обучения личинки подвергаются массивной обработки и последовательной запахом и сахар стимуляции. Таким образом, вполне возможно, что наблюдаемый фенотип обучения является вводящим в заблуждение (хотя и наивный запах и тесты сахара восприятия на диком уровне типа!). Действительно, вполне возможно, что трансгенные животные Differ от дикого типа личинок по отношению к стрессоустойчивости, мотивации, усталости, сенсорной адаптации, контекстного обучения, а также изменения в сытости. Таким образом, Михельс и др.. (2005) представил управления, проверить, является ли данный мутант способен (1) обнаружить AM сравнению с пустой контейнер запах, если вы относитесь к личинкам точно так, как во время тренировки исключением того, что вы пропустите награды и изобличают только как запахов; (2) обнаружить октября после того, как тот же режим, (3) обнаружение AM сравнению с пустой контейнер запах, если вы относитесь личинок в учебно-как способ исключением того, что вы пропустите запахи и просто выставить на вознаграждение и (4 ) обнаружения октября после того, как по той же схеме. Для всестороннего обсуждения и Более подробную информацию о методах см. Михельс и др. (2005) и Гербер и Стокер (2007).

4. Анализ данных для Sugar Learning награды

1. Для оценки данных обучения протокол награду сахар расчета индекса октября предпочтение (PREF OCT) для каждой из двух обратчески обученных групп:
   Для первой группы, который получил октября / (+) - AM / (-) обучения:
   PREF октября (OCT + / AM-) = (# личинок на стороне Октября - # личинок на стороне AM) / # всех личинок в левой, правой и средней зонах
   Для второй группы, которая получила AM / (+) - октябрь / (-) обучения:
   PREF AM (AM + / OCT-) = (# личинок на сообщения сторону - # личинок на стороне Октября) / # всех личинок в левой, правой и средней зонах

2. Расчет индекса производительности (PI) для двух значений PREF от 4,1). PI представляет ассоциативного обучения, отменив из возмущающих эффектов запаха и наказание экспозиции, временем и обработки:
   PI = (PREF октября (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / OCT)) / 2
   Таким образом, ИП может колебаться от -1 до 1. Значительно отрицательные значения представляют собой отвращение обучения, в то время как значительное положительное значение описать аппетит обучения. Полный эксперимент обычно состоит из 10 или более ИП. Данные визуализируются как includin окне участковг все значения данной экспериментальной группы. 50% от значений, расположенных в окно, средняя индекса производительности указывается как жирная линия в окне сюжет.

5. Анализ данных для целевой значимых Сенсомоторное Факультеты

1. Для оценки данных при тестировании для правильного запаха октября обработки вычислить предпочтение октября запах индекс следующим образом:
   Запах PREF октября = (# личинок на стороне Октября - # личинок на другой стороне) / # всех личинок в левой, правой и средней зонах
2. Для оценки данных при тестировании для правильного восприятия запаха AM расчета предпочтение AM запах индекс следующим образом:
   Запах PREF AM = (# личинок на сообщения сторону - # личинок на другой стороне) / # всех личинок в левой, правой и средней зонах
3. Для оценки данных при тестировании для правильного восприятия фруктозы рассчитать индекс фруктозы предпочтение следующим образом:
   PREF фруктозы = (# личинок на фруктозе стороны - # личинок на другой стороне) / # Всех личинок в левой, правой и средней зонах
4. Подробная информация для подготовки фиктивный приведены в Михельс и др.. 2005 года.

Результаты

Рисунок 1А показывает обзор экспериментальных процедур для личинок обонятельного ассоциативного обучения. По спаривания одного из двух представленных запахи с личинками награду сахар приобрести поведение потенциал для выражения привлекательных ответ на вознаграждены зап?...

Обсуждение

Описанная установка у личинок дрозофилы позволяет для исследования ассоциативного обонятельные обучения в рамках сравнительно элементарных мозга. Этот подход является простым, дешевым, легко установить в лаборатории и не требует высокотехнологичного оборудования ^9. М?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	CAS номер
Фруктоза	Сигма	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
Агароза	Сигма	A5093	9012-36-6
1-октанол	Сигма	12012	111-87-5
Amylacetate	Сигма	46022	628-63-7
Керосин	Сигма	18512	8012-95-1