Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Resumen

Larvas de Drosophila son capaces de asociarse con estímulos de olor recompensa gustativa. Aquí se describe un sencillo paradigma de comportamiento que permite el análisis de apetito aprendizaje olfativo asociativo.

Resumen

A continuación se describen los detalles metodológicos de aprendizaje asociativo apetitiva olfativa de larvas de Drosophila. La configuración, en combinación con la interferencia genética, proporciona un identificador para analizar los fundamentos neuronales y moleculares de aprendizaje asociativo específicamente en un cerebro de larvas simple.

Los organismos pueden utilizar la experiencia pasada para ajustar el comportamiento presente. Tal adquisición de potencial de comportamiento puede ser definido como el aprendizaje, y las bases físicas de estos potenciales como trazas de memoria ^1-4. Los neurocientíficos tratar de entender cómo estos procesos están organizados en función de los cambios moleculares y neuronales en el cerebro mediante el uso de una variedad de métodos en organismos modelos que van desde los insectos a vertebrados ^5,6. Para tales esfuerzos, es útil utilizar modelos de sistemas que son simples y accesibles experimentalmente. La larva de Drosophila se ha convertido en satisfacer estas demandas sobre la base dela disponibilidad de potentes ensayos de comportamiento, la existencia de una variedad de técnicas transgénicas y la organización básica del sistema nervioso que comprende sólo unas 10.000 neuronas (aunque con algunas concesiones: las limitaciones cognitivas, pocas opciones de comportamiento, y la riqueza de la experiencia cuestionable) ^7-10 .

Larvas de Drosophila pueden formar asociaciones entre los olores y el refuerzo del apetito gustativo como el azúcar ^11-14. En un ensayo estándar, establecido en el laboratorio de B. Gerber, los animales reciben una de dos olor formación recíproca: Un primer grupo de larvas está expuesto a un olor A, junto con un reforzador gustativa (recompensa azúcar) y es posteriormente expuesto a un olor B sin refuerzo ^9. Mientras tanto, un segundo grupo de larvas recibe formación recíproca, mientras que experimentan olor A sin refuerzo y posteriormente expuestos a B con olor refuerzo (recompensa azúcar). En la siguiente ambos grupos son TESdo por su preferencia entre los dos olores. Preferencias relativamente altos para el olor recompensado reflejar el aprendizaje asociativo - presentado como un índice de rendimiento (PI). La conclusión sobre la naturaleza asociativa del índice de rendimiento es convincente, ya que además de la contingencia entre los olores y los estimulantes del gusto, otros parámetros, como el olor y la exposición recompensa, el paso del tiempo y la manipulación no difieren entre los dos grupos de ^9.

Protocolo

1. Preparación

1. Drosophila salvaje larvas se crían a 25 ° C y 60% -80% de humedad en un ciclo de 14/10 luz / oscuridad. Para el control de la edad exacta de las larvas siempre se ponen 20 hembras y 10 machos en un vial (6 cm de altura y 2,5 cm de diámetro) que incluye aproximadamente 6 ml de alimento mosca estándar. Las moscas se les permite poner huevos durante 12 horas y se transfieren a un nuevo vial en el segundo día. 5-6 días después de la puesta de huevos larvas de llegar a la alimentación 3 ^ª etapa instar si se crían a 25 º C y se puede utilizar ahora para el experimento de comportamiento. Sin embargo, hay que asegurarse de tomar solamente las larvas que se encuentran todavía en la comida no y las larvas desde el lado del vial. Estas larvas ya han llegado a "vagar 3 ^º estadio etapa" - poco antes de la pupación - y su uso complica la interpretación de los resultados.
2. Preparación de agarosa 2,5% cajas de Petri (otros laboratorios utilizar también las concentraciones de agar de 1% durante todo el experimento, cómoconcentraciones cada vez más bajas pueden permitir la alimentación 3 ^º estadio las larvas de excavar en el sustrato): Disolver 2,5 g de agarosa en 100 ml ddH ₂ O. Calentar la solución en un horno de microondas hasta que empiece a hervir. Con cuidado, agitar la solución y vuelva a colocarlo en el microondas hasta que todo agarosa se disuelva. Se vierte la solución caliente de agarosa en placas de Petri de tal manera que la parte inferior de las placas de Petri está completamente cubierta y la solución de agarosa forma una superficie lisa. Dejar que la solución se enfríe a temperatura ambiente y cerrar los párpados. No de inmediato cerrar los párpados, porque permitiría la condensación de agua en los párpados.
3. Preparación de 2M fructosa placas de Petri: Disolver 2,5 g de agarosa en 100 ml de _ddH2O (de nuevo, el uso de la concentración de agar al 1% es posible, sin embargo, puede permitir la alimentación 3 ^ª estadio larvario para excavar en el sustrato). Calentar la solución en un horno de microondas hasta que empiece a hervir. Con cuidado, agitar la solución y vuelva a colocarlo en el microonda de agarosa hasta que todo se disuelve. Añadir cuidadosamente 35 g de fructosa en la solución caliente; lentamente agitar la mezcla hasta que el azúcar se disuelve para evitar retardo de ebullición. Verter la caliente fructosa-solución de agarosa en placas de Petri de tal manera que la parte inferior está completamente cubierta y la solución de fructosa-agarosa forma una superficie lisa. Dejar que la solución se enfríe a temperatura ambiente y cerrar los párpados. No de inmediato cerrar los párpados, porque permitiría la condensación de agua en los párpados.
4. Preparación de 1-octanol contenedores olor (OCT): Completa 10 l de octubre puro en un recipiente de teflón encargo olor y cerrarlo con una tapa que tiene varios pequeños orificios para permitir la evaporación del olor. Una descripción detallada de los recipientes se dan en Gerber y Stocker 2007. Prepare tres contenedores de olor para octubre Contenedores de olor permitir la evaporación de los productos químicos insertados, pero evitar que las larvas pueden directamente en contacto con ellos. Así, los experimentos aquí descritos específicamenteabordar el aprendizaje olfativo en las larvas sin perturbar efectos secundarios gustativas.
5. Preparación de los contenedores amilacetato olor (AM): Diluir 1:50 AM en el aceite de parafina. Completa 10 l de la dilución en un contenedor hecho a medida olor Teflon y cerrar con una tapa que tiene varios agujeros pequeños para permitir la evaporación del olor. Prepare tres contenedores de olor para AM. La dilución es importante por razones prácticas, es decir, para evitar una fuerte preferencia por un olor sobre la otra que podría ocultar un cambio dependiente de aprendizaje en la preferencia relativa entre los dos olores. La atracción igual para ambos olores pueden necesitar ser confirmado en el laboratorio antes del experimento mediante la aplicación de la prueba se describe más adelante (2.5) con los animales no tratados. Los valores que aquí se presenta se basa en varias publicaciones del laboratorio Gerber que fueron reproducidos recientemente por nuestro laboratorio ^9,15,16.
6. El etiquetado de las placas de Petri: Antes de los experimentos de comportamiento todos los platos de Petri tienen que ser codificados. Esto significa quefructosa que contiene cápsulas de Petri tienen que ser marcados por ejemplo con una "X" o una "A" y agarosa sólo platos de Petri con una "Y" o "B". Este código debe ser revelado al experimentador sólo después de que todos los datos han sido registrados. Mediante la realización de los experimentos de "ciego", no es por lo tanto posible que las expectativas del experimentador puede afectar al rendimiento de las larvas. Para facilitar la comprensión por el público amplio en lo que sigue sólo a hablar de los olores como estímulos condicionados (CS1 o CS2) que son bien recompensados ​​cuando se presenta en un plato de Petri fructosa (+) o no premiados, cuando se presentan en un solo agarosa placa de Petri (-).

2. Sugar entrenamiento de la recompensa y Test

1. Recoger alimentación 30 3 ^º estadio las larvas de un vial de alimentos. Transferirlos a una primera placa de Petri que contiene unas gotas de agua del grifo y cuidadosamente moverse hacia delante y hacia atrás con un cepillo. Transferirlos a una segunda placa de Petri que contiene también algunas gotas de grifo water para comprobar que no pasta comida en el bodywall de las larvas, de lo contrario las larvas sería capaz de experimentar el olor del alimento durante el experimento. Esto probablemente oscurecer el proceso de aprendizaje y su rendimiento en la situación de prueba.
2. Capacitación: Capacitar a las larvas a los olores asociados con una señal azúcar apetitivo el siguiente régimen se aplica. Ponga un recipiente olor octubre en la parte izquierda y derecha de una "X" marcada - por lo tanto, la recompensa que contiene fructosa (+) placa de Petri ("ciego" experimento, para más detalles ver 1.6). Dejar el grupo de 30 larvas de alimentación 3 ^º estadio en el medio de la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min mientras los animales están expuestos a octubre Asegúrese de que las larvas no están atrapadas dentro de la gota de agua y puede superar la tensión superficial de la misma. Por que las larvas pueden moverse libremente en la placa de Petri y la experiencia de los estímulos olfativos y / o gustativa.
3. Formación: Retire las larvas de la placa de Petri con un cepillo humedecido y transferir lam sobre una segunda placa de Petri que está marcado con una "Y" - por lo tanto, sólo agarosa (-) que contenía placa de Petri - y tiene un contenedor de olor AM localizado en su lado izquierdo y derecho. Cerrar la tapa y esperar 5 min mientras los animales están expuestos a AM.
4. Formación: Repite 2,2) y 2,3) dos veces, de modo que los 30 larvas experimentan tres ciclos de formación: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). En este experimento representa CS1 CS2 octubre y códigos para AM.
5. Prueba: Coloque una mañana y un contenedor olor octubre en las páginas opuestas de un plato de agarosa-sólo Petri. Transferir los animales entrenados para el medio de la placa de Petri de prueba. Cerrar la tapa y esperar 5 min. Posteriormente contar el número de larvas en el lado izquierdo, el lado central y derecha de la placa de Petri de prueba.
6. Repita los pasos 2.1) a 2,5) con un segundo grupo de 30 larvas alimentándose 3 ^º estadio, sino cambiar los roles experimentales de AM y octubre para que los animales reciban la formación siguientes: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). En este experimento representa CS1 CS2 octubre y códigos para AM.
7. Posibles disposiciones para la formación. Por encima se presenta una formación existente de tres ensayos de formación de cualquiera de octubre / (+) - AM / (-) o en el grupo recíproco de además de tres ensayos de formación de AM / (+) - octubre / (-). Sin embargo, para evitar los efectos dependientes de la secuencia durante el entrenamiento es importante para variar la secuencia de los estímulos en repeticiones siguientes del experimento completo. Al variar el orden CS1 o CS2 y también la presentación recompensa en la placa de primera o segunda presentada, cuatro secuencias diferentes para los ensayos de entrenamiento son posibles:

Primer grupo	CS1 / (+) - CS2 / (-)	Recíproca grupo	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

Para evitar efectos sistemáticos de estímulos en el ambiente circundante experimental, se debe realizar la prueba en un medio de los casos tales que octubre se presenta a la izquierda y a la derecha AM. En la otra mitad de los casos AM debe ser presentada a la izquierda y a la derecha octubre.

3. Las pruebas para tareas relevantes-sensorial-motoras Facultades

El diseño de los experimentos descritos anteriormente permite analizar olor-azúcar en el aprendizaje de tipo salvaje alimentación 3 ^rd larvas instar por sí solo. Sin embargo, en la vida diaria investigadores de laboratorio suelen utilizar dos o más diferentes grupos experimentales de larvas para comparar, si el aprendizaje olfativo depende de un pargen particular, un conjunto específico de neuronas, una acción mutante, una dieta especial, diferentes condiciones de crianza, los productos químicos tóxicos añadidos durante el desarrollo, etc Por lo tanto, en todos los casos en que dos o más grupos experimentales de larvas se prueban uno tiene que hacer un conjunto de experimentos de control obligatorios para probar, si los diferentes grupos de larvas mostrar adecuados agudeza sensorial-motoras. Esto se convierte en obligatoria como posibles fenotipos no son necesariamente debido a la capacidad reducida o abolida a los olores asociados con el azúcar. Más bien, los posibles defectos de aprendizaje podría basarse en defectos en cualquier paso de la circuitería sensorial-motor en el tratamiento de los olores y / o azúcar. O en otras palabras, si una larva mutante no es capaz de azúcar sentido, no se puede establecer una memoria azúcar. Pero esto no permite concluir que la larva no puede aprender. En detalle los siguientes experimentos de control tienen que ser hechas para probar la correcta octubre, AM y el procesamiento de la fructosa de larvas transgénicas.

1. Prueba de ingenuo prefe octubrerencia

Recoger alimentación 30 3 ^º estadio las larvas de un vial de alimentos. Lave cuidadosamente con agua del grifo, como se describe en 2.1. Poner un solo contenedor de octubre de olor en un lado de una placa de Petri de agarosa, añadir las larvas en el medio de la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min, de tal manera que las larvas pueden arrastrarse en la placa de Petri y se orientan hacia la octubre olor fuente. Posteriormente contar el número de larvas en el lado izquierdo, en el centro y en el lado derecho de la placa de Petri de prueba.

2. Prueba de preferencia ingenuo AM

Recoger alimentación 30 3 ^º estadio las larvas de un vial de alimentos. Lave cuidadosamente con agua del grifo, como se describe en 2.1. Poner un solo recipiente AM olor en un lado de un plato de Petri de agarosa, añadir las larvas en el medio de la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min, de tal manera que las larvas pueden arrastrarse en la placa de Petri y se orientan hacia la AM olor fuente. Posteriormente contar el número de larvae en el lado izquierdo, en el centro y en el lado derecho de la placa de Petri de prueba.

3. Prueba de preferencia azúcar ingenuo

Recoger alimentación 30 3 ^º estadio las larvas de un vial de alimentos. Lave cuidadosamente con agua del grifo, como se describe en 2.1. Preparar placas de Petri que contienen 2,5% de agarosa en un medio y un 2M fructosa-agarosa mezcla en la otra mitad. Añadir las larvas sobre la placa de Petri, cerrar la tapa y esperar 5 min, de tal manera que las larvas pueden arrastrarse en la placa de Petri y orientar hacia el lado que contiene fructosa. Posteriormente contar el número de larvas en el lado izquierdo, en el centro y en el lado derecho de la placa de Petri de prueba.

Preparación de medio-medio platos Petri: Preparar normales placas de agarosa como se describe anteriormente en la sección 1,2. Cuando las placas de Petri llenas de agarosa se enfría, se corta cuidadosamente la agarosa a lo largo del eje vertical con un escalpelo. Retire la mitad de la agarosa de la placa de Petri. Ladd caliente una solución de fructosa-agarosa (para la preparación véase 1,3) a la mitad vacía de la placa de Petri. Tener cuidado de que las dos mitades de acuerdo y no forman un borde definido - esto afecta el comportamiento de elección larval y hace un análisis de comportamiento bastante difícil ^4..

Sham formación

A pesar de las pruebas de si la alimentación transgénica 3 ^ª instar larvas son capaces de distinguir a un nivel de tipo salvaje entre octubre y aire (3,1), AM y aire (3,2) y el azúcar y puro de agarosa (3,3), una serie adicional de experimentos de prueba ha sido recientemente introducido (para ver la discusión Gerber y Stocker, 2007). La justificación de estos experimentos es la siguiente. Durante la formación de las larvas se someten manipulación masiva y olor sucesiva y azúcar estimulación. Por lo tanto, es muy posible que el fenotipo observado aprendizaje es engañoso (aunque ingenuo olor y pruebas de azúcar en la percepción está en un nivel de tipo salvaje!). En efecto, es posible que los animales transgénicos differ de larvas de tipo salvaje con respecto a la resistencia al estrés, la motivación, la adaptación fatiga, sensorial, aprendizaje contextual, y cambios en la saciedad. Por lo tanto, Michels et al. (2005) introdujo controles que prueba si un mutante dado es capaz de (1) detectar AM frente a un contenedor vacío olor si usted trata a las larvas exactamente como durante el entrenamiento, excepto que se omite la recompensa y se limita a exponer a los dos los olores, (2) detectar octubre después de que el régimen mismo, (3) detectar AM frente a un contenedor vacío olor, si usted trata de las larvas de una manera similar a la formación, salvo que omite los olores y se limita a exponer a la recompensa, y (4 ) detectar octubre después de que el mismo régimen. Para una discusión completa y más detalles sobre los métodos consulte Michels et al (2005) y Gerber y Stocker (2007).

4. Análisis de los datos para el Aprendizaje Sugar Recompensa

1. Para evaluar los datos del protocolo del azúcar aprendizaje recompensa calcular un índice de preferencia OCT (PREF OCT) para cada uno de los dos reciprocidadcamente los grupos formados:
   Para el primer grupo que recibió octubre / (+) - AM / (-) formación:
   PREF octubre (OCT + / AM-) = (número de larvas por parte de OCT - N º de larvas por parte de AM) / # de todas las larvas presentes en la zona izquierda, central y derecha
   Para el segundo grupo que recibió AM / (+) - OCT / (-) formación:
   PREF AM (AM + / OCT-) = (número de larvas en AM side - N º de larvas en el lado OCT) / # de todas las larvas presentes en la zona izquierda, central y derecha

2. Cálculo de un índice de rendimiento (PI) para los dos valores de PREF 4,1). El PI representa el aprendizaje asociativo por anulando los efectos perturbadores de olor y la exposición castigo, el paso del tiempo y la manipulación:
   PI = (PREF octubre (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTU)) / 2
   Así, inhibidores de la proteasa pueden variar desde -1 a 1. Valores significativamente negativos representan aprendizaje aversivo, mientras que los valores positivos significativamente describir el aprendizaje apetitivo. Un experimento completo suele constar de 10 o más inhibidores de la proteasa. Los datos se visualizan como caja de parcelas including todos los valores de un determinado grupo experimental. 50% de los valores que se encuentran dentro de la caja, el índice de rendimiento medio se indica como una línea gruesa en el gráfico de caja.

5. Análisis de los datos relevantes para la Task-sensorial-motoras Facultades

1. Para evaluar los datos en las pruebas para el procesamiento apropiado olor octubre calcular un olor octubre índice de preferencia de la siguiente manera:
   Olor PREF octubre = (N º de larvas en el lado de octubre - N º de larvas en el otro lado) / # de todas las larvas dentro de las zonas izquierda, central y derecha
2. Para evaluar los datos cuando las pruebas de percepción adecuada olor AM calcular un olor AM índice de preferencia de la siguiente manera:
   Olor PREF AM = (# larvas de lado en AM - N º de larvas en el otro lado) / # de todas las larvas dentro de las zonas izquierda, central y derecha
3. Para evaluar los datos cuando las pruebas de percepción fructosa apropiado calcular un índice de preferencia de fructosa de la siguiente manera:
   PREF = fructosa (N º de larvas en el lado de la fructosa - N º de larvas en el otro lado) / # De todas las larvas dentro de las zonas izquierda, central y derecha
4. Detalles para el entrenamiento simulado se dan en Michels et al. 2005.

Resultados

La figura 1A muestra una visión general de los procedimientos experimentales para las larvas aprendizaje asociativo olfativo. Por el emparejamiento de una de las dos olores presentados con una recompensa larvas azúcar adquirir el comportamiento potencial de expresar una respuesta atractiva hacia el olor recompensado en comparación con el olor sin recompensa. Dos grupos de larvas están siempre formados por cualquiera de emparejamiento el reforzador con el olor octubre o AM. El índice de rendimiento ...

Discusión

La configuración descrita en larvas de Drosophila permite la investigación de aprendizaje olfativo asociativo dentro de un cerebro comparativamente elemental. El enfoque es simple, barato, fácil de establecer en un laboratorio y no requiere de equipos de alta tecnología ^9. Se presenta una versión del experimento para estudiar el aprendizaje apetitivo asociativo reforzada por recompensa fructosa ^11. La configuración descrita se basa en una serie de estudios paramétricos que exh...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Número del CAS
Fructosa	Sigma	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
Agarosa	Sigma	A5093	9012-36-6
1-octanol	Sigma	12012	111-87-5
Amilacetato	Sigma	46022	628-63-7
Queroseno	Sigma	18512	8012-95-1