Appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

Résumé

Larves de drosophile sont capables de s'associer avec des stimuli odeur récompense gustative. Nous décrivons ici un paradigme simple de comportement qui permet l'analyse de l'apprentissage olfactif associatif appétitive.

Résumé

Dans ce qui suit, nous décrivons les détails méthodologiques de l'apprentissage olfactif associatif appétit chez les larves de drosophile. L'installation, en association avec d'interférence génétique, fournit une poignée d'analyser les bases neuronales et moléculaire de l'apprentissage associatif spécifiquement à une réflexion simple larvaire.

Les organismes peuvent utiliser l'expérience passée pour ajuster le comportement présent. Une telle acquisition du potentiel de comportement peut être définie comme l'apprentissage et les bases physiques de ces potentiels que les traces mnésiques ^1-4. Les neuroscientifiques essayer de comprendre comment ces processus sont organisés en fonction des changements moléculaires et neuronale dans le cerveau en utilisant une variété de méthodes dans des organismes modèles, allant des insectes aux vertébrés ^5,6. Pour ces efforts, il est utile d'utiliser des systèmes modèles simples et accessibles expérimentalement. La larve Drosophila s'est avéré répondre à ces exigences fondées surla disponibilité de solides analyses comportementales, l'existence d'une variété de techniques transgéniques et l'organisation élémentaire du système nerveux comprenant seulement environ 10.000 neurones (quoique avec quelques concessions: limitations cognitives, comportementales, peu d'options et de la richesse de l'expérience douteuse) ^7-10 .

Larves de drosophile peuvent créer des associations entre les odeurs et appétitive renforcement gustative comme le sucre ^11-14. Dans un essai standard, mis en place dans le laboratoire de B. Gerber, les animaux reçoivent une formation de deux odeurs réciproque: Un premier groupe de larves est exposé à une odeur A avec un renforçateur gustative (récompense sucre) et est ensuite exposé à une odeur B sans armature ^9. Pendant ce temps un deuxième groupe de larves reçoit une formation réciproque tout en éprouvant une odeur sans armature et étant ensuite exposée à odeurs B avec renforcement (récompense sucre). Dans ce qui suit les deux groupes sont tested pour leur préférence entre les deux odeurs. Préférences relativement plus élevés pour l'odeur récompensés reflètent l'apprentissage associatif - présenté comme un indice de performance (PI). La conclusion quant à la nature associative de l'indice de performance est convaincante, car en dehors de la contingence entre les odeurs et sapides, d'autres paramètres, tels que l'odeur et l'exposition de récompense, le passage du temps et de manipulation ne diffèrent pas entre les deux groupes ^9.

Protocole

1. Préparation

1. Drosophile de type sauvage larves sont élevées à 25 ° C et 60% -80% d'humidité dans un cycle de 14/10 lumière / obscurité. Pour le contrôle de l'âge exact des larves toujours 20 femelles sont mises avec 10 hommes dans un flacon (6 cm de hauteur et 2,5 cm de diamètre) qui comprend environ 6 ml de nourriture volée standard. Les mouches sont autorisés à pondre des œufs pendant 12 heures et sont transférés dans un nouveau flacon, le deuxième jour. 5-6 jours après la ponte des larves atteignent le stade d'alimentation 3 ^ème étape si élevée à 25 ° C et peut maintenant être utilisé pour l'expérience comportementale. Cependant, il faut s'assurer de ne prendre larves qui en sont encore à la nourriture et non les larves de la paroi du flacon. Ces larves ont déjà atteint «l'errance 3 ^e stade larvaire scène» - peu de temps avant la nymphose - et leur utilisation complique l'interprétation des résultats.
2. Préparation de 2,5% des boîtes de Pétri d'agarose (d'autres laboratoires utilisent également des concentrations de gélose de 1% tout au long de l'expérience, commentconcentrations de plus en plus faibles peuvent permettre l'alimentation 3 ^e stade larvaire de creuser dans le substrat): Dissoudre 2,5 g d'agarose dans 100 ml ddH O. ₂ Chauffer la solution dans un four micro-ondes jusqu'à ce qu'il commence à bouillir. Soigneusement agiter la solution et le remettre au micro-ondes jusqu'à ce que tous agarose est dissous. Verser la solution d'agarose à chaud dans des boîtes de Pétri de telle sorte que le fond des boîtes de Pétri est complètement recouvert de la solution d'agarose et forme une surface lisse. Laisser la solution refroidir à température ambiante puis fermez le couvercle. Ne pas fermer immédiatement les couvercles, car elle permettrait de condensation de l'eau sur les couvercles.
3. Préparation des boîtes de Petri 2M fructose: Dissoudre 2,5 g d'agarose dans 100 ml ddH O ₂ (là encore, l'utilisation de la concentration de 1% de gélose est possible, mais il peut permettre d'alimenter 3 ^e stade larvaire de creuser dans le substrat). Chauffer la solution dans un four micro-ondes jusqu'à ce qu'il commence à bouillir. Soigneusement agiter la solution et le remettre dans le microondes jusqu'à ce que tous agarose est dissous. Ajouter avec précaution 35 g de fructose dans la solution chaude, lentement agiter le mélange jusqu'à ce que le sucre soit dissous afin d'éviter un retard d'ébullition. Verser le fructose-agarose chaud solution dans des boîtes de Pétri telle que le fond est complètement recouverte et la solution de fructose-agarose forme une surface lisse. Laisser la solution refroidir à température ambiante puis fermez le couvercle. Ne pas fermer immédiatement les couvercles, car elle permettrait de condensation de l'eau sur les couvercles.
4. Préparation du 1-octanol conteneurs odeurs (OCT): Remplir 10 ul de pur PTOM dans un récipient fait sur commande d'odeur téflon et le fermer avec un couvercle qui a plusieurs petits trous pour permettre l'évaporation de l'odeur. Une description détaillée des conteneurs est donnée dans Gerber et Stocker 2007. Préparer trois récipients d'odeurs pour octobre Conteneurs odeur permettre l'évaporation des produits chimiques introduits, mais il faut éviter que les larves de pouvoir les contacter directement. Ainsi, les expériences ici décrites de façon spécifiqueaborder l'apprentissage olfactif chez les larves sans perturber les effets secondaires gustatives.
5. Préparation des conteneurs amyle odeurs (AM): Diluer AM 1:50 dans l'huile de paraffine. Remplir 10 ul de la dilution dans un récipient fabriqué sur mesure odeur téflon et le fermer avec un couvercle qui a plusieurs petits trous pour permettre l'évaporation de l'odeur. Préparer trois récipients d'odeurs pour AM. La dilution est important pour des raisons pratiques, à savoir éviter une forte préférence pour l'un sur l'autre odeur qui peut masquer un changement d'apprentissage en fonction de la préférence relative entre les deux odeurs. L'attrait égal pour les deux odeurs peuvent avoir besoin d'être confirmée par le laboratoire avant l'expérience en appliquant le test décrit ci-après (2.5) avec des animaux naïfs. L'valeurs présentées ici sont basées sur plusieurs publications du laboratoire Gerber qui ont récemment été reproduites par notre laboratoire ^9,15,16.
6. L'étiquetage des boîtes de Pétri: Avant les expériences comportementales tous les boîtes de Petri doivent être codés. Cela signifie quefructose contenant des boîtes de Petri doivent être marquées par exemple par un "X" ou un "A" et d'agarose seulement des boîtes de Pétri avec un «Y» ou un «B». Ce code doit être révélé à l'expérimentateur que lorsque toutes les données ont été enregistrées. En effectuant des expériences «à l'aveugle», il n'est donc pas possible que les attentes de l'expérimentateur peuvent affecter la performance des larves. Pour faciliter la compréhension de la vaste lectorat dans ce qui suit, nous ne parlerons que les odeurs comme stimuli conditionnés (CS1 ou CS2) qui sont soit récompensés lorsqu'ils sont présentés sur un plat de Pétri fructose (+) ou non récompensés lorsqu'ils sont présentés sur une seule agarose boîte de Pétri (-).

2. Formation Récompense de sucre et d'essai

1. Recueillir 30 d'alimentation 3 ^e stade larvaire d'un flacon de nourriture. Les transférer dans un premier plat de Pétri contenant quelques gouttes de l'eau du robinet et soigneusement les déplacer vers l'avant et vers l'arrière avec une brosse. De les transférer vers un second plat de Pétri qui contient également quelques gouttes d'eau du robinet water pour vérifier qu'aucune pâte alimentaire reste sur le tégument de la larve, sinon les larves pourront faire l'expérience de l'odeur de nourriture pendant l'expérience. Ce serait probablement obscurcir le processus d'apprentissage et leur performance dans la situation de test.
2. Formation: Former les larves aux odeurs associés avec une queue de sucre appétitive le régime suivant est appliqué. Mettez un récipient odeur PTOM sur le côté gauche et droit d'un "X" marqué - ainsi, récompense contenant du fructose (+) boîte de Pétri («aveugle» expérience, pour plus de détails voir paragraphe 1.6). Mettez le groupe de 30 larves se nourrissent 3 ^e stade larvaire sur le milieu de la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tandis que les animaux sont exposés à octobre Assurez-vous que les larves ne sont pas piégés à l'intérieur de la goutte d'eau et peut surmonter la tension superficielle de celui-ci. Par ce que les larves peuvent se déplacer librement sur la boîte de Pétri et l'expérience de stimuli olfactifs et / ou gustatif.
3. Formation: Retirer les larves de la boîte de Pétri avec un pinceau imbibé et de transférer lem sur un deuxième plat de Pétri qui est marqué avec un "Y" - donc, l'agarose seulement (-) boîte de Pétri contenant - et a une odeur AM conteneur situé sur le côté gauche et à droite. Fermez le couvercle et attendez 5 min, tandis que les animaux sont exposés à AM.
4. Formation: Répétez 2.2) et 2.3) deux fois, de sorte que tous les 30 cycles expérience larves formation de trois: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). Dans cette expérience représente CS1 CS2 PTOM et codes pour AM.
5. Test: un endroit AM et d'une odeur contenant les PTOM sur les sites opposées d'un plat d'agarose seule Petri. Transférez les animaux dressés au milieu du plat de Pétri de test. Fermez le couvercle et attendre 5 min. Par la suite compter le nombre de larves sur le côté gauche, le côté centre et à droite de la boîte de Petri de test.
6. Répétez les étapes 2.1) à 2,5) avec un second groupe de 30 larves se nourrissent 3 ^e stade larvaire, mais inverser les rôles expérimentales de AM et PTOM tels que les animaux reçoivent la formation suivante: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). Dans cette expérience représente CS1 CS2 PTOM et codes pour AM.
7. Arrangements possibles pour la formation. Ci-dessus, nous présentons une formation qui existe de trois essais de formation de deux OCT / (+) - Radio AM / (-) ou dans le groupe de réciprocité aussi trois essais de formation de AM / (+) - OCT / (-). Cependant, pour éviter les effets de séquence à charge lors de la formation, il est important de varier l'ordre des stimuli répétitions suivantes de l'expérience complète. En faisant varier la commande CS1 ou CS2 et également la présentation de récompense dans la première plaque ou la seconde présentés, quatre séquences différentes pour les essais d'entraînement sont possibles:

Premier groupe	CS1 / (+) - CS2 / (-)	Réciproque groupe	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

Pour prévenir les effets systématiques des stimuli de l'environnement expérimental, il faut effectuer le test dans la moitié des cas, que l'OCT est présentée sur la gauche et vers la droite AM. Dans l'autre moitié des cas AM doivent être présentées sur la gauche et les PTOM sur la droite.

3. Les tests pour les tâches pertinentes sensori-moteur Facultés

La conception des expériences décrites ci-dessus permet d'analyser les odeurs de sucre dans l'apprentissage de type sauvage alimentation 3 ^e stade larvaire sur ses propres. Cependant, dans la vie quotidienne des chercheurs de laboratoire utilisent généralement deux ou plusieurs groupes expérimentaux de larves de comparer, si l'apprentissage olfactif dépend d'un pairgène particulier, un ensemble spécifique de neurones, un stock mutant, un régime alimentaire spécial, différentes conditions d'élevage, les produits chimiques toxiques ajoutés au cours du développement, etc Ainsi, dans tous les cas où deux ou plusieurs groupes expérimentaux de larves sont testés qu'on a à faire un ensemble d'expériences de contrôle obligatoires afin de tester si les différents groupes de larves montrent appropriées sensori-motrices acuité. Cela devient obligatoire phénotypes potentiels ne sont pas nécessairement en raison de capacités réduites ou abolies aux odeurs associés avec le sucre. Au contraire, les éventuels défauts d'apprentissage pourrait être basée sur les défauts à n'importe quelle étape du circuit sensori-motrice dans le traitement des odeurs et / ou de sucre. Ou en d'autres termes, si une larve mutante n'est pas en mesure de sucre sens, il ne peut pas établir une mémoire de sucre. Mais cela ne permet pas de conclure que la larve ne peut pas apprendre. En détail les expériences de contrôle suivantes doivent être effectuées pour tester la bonne PTOM, AM et le traitement des larves de fructose transgénique.

1. Test de naïf octobre préférence

Recueillir 30 d'alimentation 3 ^e stade larvaire d'un flacon de nourriture. Lavez-les soigneusement à l'eau du robinet comme décrit en 2.1. Placez un récipient odeur unique PTOM sur un côté d'un plat de Pétri agarose, ajouter les larves sur le milieu de la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tels que les larves peuvent ramper sur la boîte de Pétri et les orienter vers les PTOM source de l'odeur. Par la suite compter le nombre de larves sur le côté gauche, au milieu et sur le côté droit de la boîte de Petri de test.

2. Test de préférence naïve AM

Recueillir 30 d'alimentation 3 ^e stade larvaire d'un flacon de nourriture. Lavez-les soigneusement à l'eau du robinet comme décrit en 2.1. Placez un récipient odeur unique AM sur un côté d'un plat de Pétri agarose, ajouter les larves sur le milieu de la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tels que les larves peuvent ramper sur la boîte de Pétri et les orienter vers l'AM source de l'odeur. Par la suite compter le nombre de larvae sur le côté gauche, au milieu et sur le côté droit de la boîte de Petri de test.

3. Test de préférence sucre naïve

Recueillir 30 d'alimentation 3 ^e stade larvaire d'un flacon de nourriture. Lavez-les soigneusement à l'eau du robinet comme décrit en 2.1. Préparer des boîtes de Pétri contenant 2,5% d'agarose dans une moitié et un fructose 2M-agarose mélange dans l'autre moitié. Ajouter les larves sur la boîte de Pétri, fermez le couvercle et attendez 5 min, tels que les larves peuvent ramper sur la boîte de Pétri et les orienter vers le côté contenant du fructose. Par la suite compter le nombre de larves sur le côté gauche, au milieu et sur le côté droit de la boîte de Petri de test.

Préparation des boîtes de Petri moitié-moitié: Préparer normales des plaques d'agarose comme décrit ci-dessus à la section 1.2. Lorsque les boîtes de Pétri remplies d'agarose sont refroidies, coupez soigneusement le agarose sur l'axe vertical avec un scalpel. Enlever une moitié de l'agarose à partir de la boîte de Pétri. Add une chaude fructose solution d'agarose (pour la préparation voir 1.3) à la moitié vide de la boîte de Pétri. Veillez à ce que les deux moitiés de match et ne forment pas un bord défini - cela influe sur le comportement de choix des larves et rend une analyse comportementale plutôt difficile. ^4.

Sham formation

Malgré un examen si l'alimentation transgénique 3 ^e stade larvaire sont capables de distinguer au niveau du type sauvage entre les PTOM et l'air (3,1), AM et de l'air (3,2) et le sucre et pur agarose (3,3), une série supplémentaire d'expériences de test a récemment été introduit (pour une discussion voir Gerber et Stocker, 2007). La justification de ces expériences est la suivante. Au cours de la formation des larves subissent manipulation massive et successive odeur et le sucre stimulation. Ainsi, il est bien possible que le phénotype observé apprentissage est trompeur (bien que l'odeur naïve et tests de perception de sucre sont à un niveau de type sauvage!). En effet, il est possible que les animaux transgéniques differ de larves de type sauvage en ce qui concerne la résistance au stress, la motivation, la fatigue, l'adaptation sensorielle, apprentissage contextuel, et les changements dans la satiété. Ainsi, Michels et al. (2005) ont introduit des contrôles qui testent si un mutant donné est capable de (1) détecter AM par rapport à un conteneur vide odeur si vous traitez les larves exactement comme lors de la formation, sauf que vous omettez la récompense et simplement exposer à la fois les odeurs; (2) détecter octobre après le même régime; (3) détecter AM par rapport à un conteneur vide odeur, si vous traitez les larves d'une manière semblable à la formation, sauf que vous omettez les odeurs et simplement exposer à la récompense, et (4 ) détecter octobre après le même schéma. Pour une discussion détaillée et de plus amples détails sur les méthodes s'il vous plaît voir Michels et al (2005) et de Gerber et Stocker (2007).

4. Analyse des données pour l'apprentissage Récompense sucre

1. À évaluer les données de protocole de l'apprentissage sucre récompense calculer un indice de préférence octobre (PREF octobre) pour chacun des deux réciment des groupes formés:
   Pour le premier groupe qui a reçu OCT / (+) - Radio AM / (-) de formation:
   PREF OCT (OCT + / AM-) = (nombre de larves sur le côté OCT - Nombre de larves sur le côté AM) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale
   Pour le second groupe qui a reçu AM / (+) - OCT / (-) de formation:
   PREF AM (AM + / OCT-) = (nombre de larves sur la bande AM côté - Nombre de larves sur le côté OCT) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale

2. Calculer un indice de performance (PI) pour les valeurs PREF deux de 4,1). Le PI représente l'apprentissage associatif en annulant les effets perturbateurs de l'odeur et de l'exposition punition, passage du temps et la manipulation:
   PI = (PREF OCT (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTOM)) / 2
   Ainsi IP peut varier entre -1 et 1. Des valeurs significativement négatifs représentent aversif d'apprentissage, tandis que les valeurs positives significatives décrire l'apprentissage appétitive. Une expérience complète comprend habituellement de 10 ou plus inhibiteurs de protéase. Les données sont visualisées comme boîte de parcelles including toutes les valeurs d'un groupe expérimental donné. 50% des valeurs se trouvant à l'intérieur de la boîte, l'indice de performance médiane est indiquée en trait gras à l'intérieur de la boîte à moustaches.

5. Analyse des données pertinentes pour la tâche-sensori-moteur Facultés

1. Pour évaluer les données lors du test de bon traitement de l'odeur octobre calculer un indice d'odeur octobre préférence comme suit:
   Odeur PREF OCT = (nombre de larves sur le côté OCT - Nombre de larves de l'autre côté) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale
2. Pour évaluer les données lors du test de bonne perception des odeurs AM calculer un indice AM préférence odeur comme suit:
   Odeur PREF AM = (nombre de larves sur la bande AM côté - Nombre de larves de l'autre côté) / # de toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale
3. Pour évaluer les données lors du test de perception du fructose bonne calculer un indice de préférence le fructose comme suit:
   PREF fructose = (nombre de larves sur le côté fructose - Nombre de larves de l'autre côté) / # De toutes les larves dans les zones gauche, droite et centrale
4. Détails sur le simulacre de formation sont donnés dans Michels et al. 2005.

Résultats

La figure 1A montre une vue d'ensemble des procédures expérimentales pour des larves apprentissage associatif olfactif. En couplant une des deux odeurs présentées avec une récompense larves sucre acquérir le comportement potentiel d'exprimer une réponse intéressante à l'odeur récompensés par rapport à l'odeur récompense. Deux groupes de larves sont toujours formés soit par l'appariement du renfort de l'odeur ou du PTOM AM. L'indice de performance (PI) mesure la ...

Discussion

La configuration décrite dans les larves de drosophile permet d'enquêter sur l'apprentissage olfactif associatif au sein d'un cerveau comparable élémentaire. L'approche est simple, pas cher, facile à mettre en place dans un laboratoire et ne nécessite pas de matériel de haute technologie ^9. Nous présentons une version de l'expérience, d'étudier appétitive apprentissage associatif renforcé par la récompense fructose ^11. La configuration décrite es...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Numéro CAS
Fructose	Sigma	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
Agarose	Sigma	A5093	9012-36-6
1-octanol	Sigma	12012	111-87-5
Amyle	Sigma	46022	628-63-7
Pétrole	Sigma	18512	8012-95-1