Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Zusammenfassung

Drosophila-Larven sind in der Lage, um Geruch Reize mit geschmackliche Belohnung assoziieren. Hier beschreiben wir eine einfache Verhaltensänderungen Paradigma, das die Analyse von appetitive assoziative olfaktorische Lernen ermöglicht.

Zusammenfassung

Im Folgenden beschreiben wir die methodischen Einzelheiten der appetitive assoziative olfaktorische Lernen in Drosophila-Larven. Das Setup in Kombination mit genetischen Störungen, bietet ein Handle auf die neuronale und molekularen Grundlagen von speziell assoziativen Lernens in einer einfachen Larven Gehirns zu analysieren.

Organismen können Erfahrungen aus der Vergangenheit zu präsentieren Verhalten anzupassen. Solche Akquisition von Verhaltensstörungen Potential kann als Lernen definiert werden, und die physikalischen Grundlagen dieser Potentiale als Gedächtnisspuren ^1-4. Neurowissenschaftler versuchen zu verstehen, wie diese Prozesse im Hinblick auf die molekularen und neuronalen Veränderungen im Gehirn werden durch eine Vielzahl von Methoden im Modell Organismen von Insekten Wirbeltiere ^5,6 organisiert. Für diese Bemühungen ist es hilfreich, Modellsysteme, die einfach und experimentell zugänglichen verwenden. Die Drosophila Larve hat sich diese Anforderungen auf Basis erfüllen sichdie Verfügbarkeit von robusten Verhaltens-Assays, die Existenz einer Vielzahl von transgenen Techniken und der elementaren Organisation des Nervensystems, die nur etwa 10.000 Neuronen (wenn auch mit einigen Zugeständnissen: kognitive Einschränkungen, nur wenige Handlungsoptionen, und den Reichtum der Erfahrungen fraglich) ^7-10 .

Drosophila-Larven bilden können Assoziationen zwischen Gerüchen und appetitive geschmackliche Verstärkung wie Zucker ^11-14. In einem Standardtest, gegründet im Labor von B. Gerber, erhalten Tiere eine zwei-Geruch gegenseitige Ausbildung: Eine erste Gruppe von Larven zu einer Geruchs A zusammen mit einer geschmacklichen Verstärker (Zucker Belohnung) ausgesetzt und anschließend zu einem Geruch ausgesetzt B ohne Verstärkung ^9. Unterdessen eine zweite Gruppe von Larven empfängt reziproken Ausbildung aber gleichzeitig mit Geruch A ohne Verstärkung und nachfolgend um Geruch B mit Verstärkung (Zucker Belohnung) ausgesetzt. In den folgenden beiden Gruppen sind tesTed für ihre Präferenz zwischen den beiden Gerüche. Relativ höhere Präferenzen für den belohnten Duft spiegelt assoziativen Lernens - präsentiert als Performance-Index (PI). Die Schlussfolgerung in Bezug auf die assoziative Natur des Performance-Index ist überzeugend, denn abgesehen von der Kontingenz zwischen Gerüche und Geschmacksstoffe auch andere Parameter, wie Geruch und Belohnung Belichtung Laufe der Zeit und Handhabung nicht zwischen den beiden Gruppen ⁹ unterscheiden.

Protokoll

Ein. Vorbereitung

1. Drosophila Wildtyp-Larven werden bei 25 ° C erhöht und 60% -80% Luftfeuchtigkeit in einem 14/10 Licht / Dunkel-Zyklus. Für die Steuerung das genaue Alter der Larven immer 20 Frauen sind mit 10 Männern in einem Fläschchen (6 cm Höhe und 2,5 cm Durchmesser), die etwa 6 ml Standard fly Essen beinhaltet setzen. Fliegen werden dürfen Eier für 12 h lag und in ein neues Fläschchen am zweiten Tag übertragen. 5-6 Tage nach der Eiablage Larven erreichen die Fütterung 3 ^rd instar der Bühne, wenn bei 25 ° C erhöht und kann nun für die Verhaltensexperiment verwendet werden. Allerdings muss man sicherstellen, um nur Larven, die sich noch in der Lebensmittel-und nicht der Larven aus der Seite der Flasche. Diese Larven haben bereits "wandernden 3 ^rd instar Bühne" erreicht - kurz vor der Verpuppung - und ihre Nutzung erschwert die Interpretation der Ergebnisse.
2. Zubereitung von 2,5% Agarose Petrischalen (anderen Labors nutzen auch Agar-Konzentrationen von 1% des gesamten Experiments, wieimmer geringeren Konzentrationen kann damit die Fütterung ^3. Larvenstadium in das Substrat zu graben): Lösen Sie 2,5 g Agarose in 100 ml ddH ₂ O. Heizen Sie die Lösung in einer Mikrowelle, bis es zu kochen beginnt. Vorsichtig schütteln Sie die Lösung und setzen Sie ihn wieder in die Mikrowelle, bis alle Agarose gelöst ist. Die heiße Lösung Agarose in Petrischalen so dass der Boden der Petri-Schalen vollständig bedeckt ist und die Agarose Lösung bildet eine glatte Oberfläche. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen Temperatur und schließen Sie den Deckel. Nicht sofort schließen die Deckel, weil es zur Kondensation von Wasser an den Deckeln ermöglichen würde.
3. Herstellung von 2M Fructose Petrischalen: Man löst 2,5 g Agarose in 100 ml ddH ₂ O (wiederum ist die Nutzung von 1% Agar Konzentration möglich, jedoch kann sie zulassen Zuführen ^3. Larvenstadium in das Substrat graben). Heizen Sie die Lösung in einer Mikrowelle, bis es zu kochen beginnt. Vorsichtig schütteln Sie die Lösung und setzen Sie ihn wieder in die Mikro-Welle bis alle Agarose gelöst ist. Vorsichtig 35 g Fruktose in die heiße Lösung, langsam rühren die Mischung, bis der Zucker aufgelöst ist, um Siedeverzug zu vermeiden. Die heiße Fructose-Agaroselösung in Petrischalen so dass der Boden vollständig bedeckt ist und der Fructose-Agaroselösung bildet eine glatte Oberfläche. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen Temperatur und schließen Sie den Deckel. Nicht sofort schließen die Deckel, weil es zur Kondensation von Wasser an den Deckeln ermöglichen würde.
4. Herstellung von 1-Octanol (OCT) Geruch Behälter: Füllen Sie 10 ul reines Oktober in eine maßgeschneiderte Teflon Geruch Behälter und schließen Sie es mit einem Deckel, der mehrere kleine Löcher für die Verdampfung des Geruchs zu ermöglichen hat. Eine detaillierte Beschreibung der Behälter in Gerber und Stocker 2007. Bereiten Sie drei Geruch Behälter für Oktober Geruch Behälter ermöglichen für die Verdampfung der eingesetzten Chemikalien, sondern vermeiden, daß Larven können direkt kontaktieren. So sind die hier beschriebenen Experimente gezieltAdresse olfaktorischen Lernens bei Larven ohne störende Geschmacks Nebenwirkungen.
5. Vorbereitung der Amylacetat (AM) Geruch Behälter: verdünnen AM 1:50 in Paraffinöl. Füllen Sie 10 ul der Verdünnung in einem speziell angefertigten Teflon Geruch Behälter und schließen Sie es mit einem Deckel, der mehrere kleine Löcher für die Verdampfung des Geruchs zu ermöglichen hat. Bereiten Sie drei Geruch Behälter für AM. Die Verdünnung ist aus praktischen Gründen wichtig, nämlich eine starke Bevorzugung eines Geruchs über die andere, die einen Lern-abhängige Veränderung der relativen bevorzugt zwischen den beiden Gerüche maskieren, zu vermeiden. Das gleiche Attraktion für Gerüche müssen eventuell im Labor vor dem Experiment werden durch Aufbringen der später beschriebenen Test (2.5) mit naiven Tieren bestätigt. Die Werte hier präsentiert auf mehreren Veröffentlichungen des Gerber-Labor, das vor kurzem von unserem Labor ^9,15,16 wurden reproduziert basieren.
6. Die Beschriftung der Petrischalen: Vor den Verhaltensexperimente alle Petrischalen codiert werden. Das bedeutet, dassfructosehaltigen Petrischalen müssen zum Beispiel mit einem "X" oder ein "A" und Agarose nur Petrischalen mit einem "Y" oder "B" markiert werden. Dieser Code sollte der Experimentator erst alle Daten aufgezeichnet wurden aufgedeckt werden. Durch die Durchführung der Experimente "blind" ist es also nicht möglich, dass die Erwartungen der Experimentator kann die Leistung der Larven beeinflussen. Um ein Verständnis für die breite Leserschaft wir im Folgenden nur die Gerüche als konditionierte Stimuli (CS1 oder CS2), die entweder belohnt werden, wenn sie auf einer Fructose Petrischale (+) oder nicht belohnt präsentiert, wenn auf einem Agarose nur vorgestellt werden reden erleichtern Petrischale (-).

2. Zucker Belohnung Training und Test-

1. Sammle 30 Fütterung 3 ^rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Übertragung auf einen ersten Petrischale, die einige Tropfen Leitungswasser enthält und vorsichtig bewegen sie vorwärts und rückwärts mit einer Bürste. Übertragung auf einen zweiten Petrischale dass enthält auch einige Tropfen Leitungswasser water zu überprüfen, dass keine Nahrung Paste auf der Körperwandschicht der Larven bleibt, andernfalls Larven der Lage wäre, die Nahrungsmittelgeruch während des Experiments zu erleben. Dies würde wahrscheinlich zu verdunkeln den Lernprozess und ihre Leistung in der Testsituation.
2. Training: Um Larven Associate Gerüche trainieren mit einem appetitive Zucker Cue folgende Regelung angewendet wird. Setz einen OCT Geruch Behälter auf der linken und rechten Seite eines "X" gekennzeichnet - dadurch, Fructose Belohnung enthaltend (+) Petrischale ("Blind"-Experiment, für Details siehe 1,6). Fügen Sie die Gruppe von 30 Fütterung 3 ^rd Larven auf die Mitte der Petrischale, den Deckel schließen und warten, 5 min, während die Tiere Oktober ausgesetzt sind. Stellen Sie sicher, dass die Larven nicht im Wasser Tropfen gefangen und kann die Oberflächenspannung zu überwinden. Bis dahin Larven können frei auf der Petrischale zu bewegen und erleben Geruchs-und / oder geschmackliche Reize.
3. Training: Nehmen Sie die Larven aus der Petrischale mit einem feuchten Pinsel und übertragen diem auf eine zweite Petrischale, die mit einem "Y" bezeichnet ist - dadurch, Agarose nur (-), enthaltend Petrischale - und weist einen AM Geruch Behälter an seiner linken und rechten Seite angeordnet. Schließen Sie den Deckel und warten 5 Minuten, während die Tiere AM ausgesetzt sind.
4. Training: Repeat 2,2) und 2,3) zweimal, so dass alle 30 Larven Erfahrung drei Trainings-Zyklen: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). In diesem Experiment CS1 stellt Oktober und CS2-Codes für AM.
5. Test: Legen Sie eine Uhr und ein Oktober Geruch Container auf den gegenüberliegenden Seiten eines Agarose-only Petrischale. Übertragen der trainierten Tieren zur Mitte des Tests Petrischale. Schließen Sie den Deckel und warten Sie 5 min. Anschließend zählt die Anzahl der Larven auf der linken Seite, der mittlere und rechte Seite des Prüflings Petrischale.
6. Wiederholen Schritte 2.1) bis 2.5) mit einer zweiten Gruppe von 30 Fütterung ^3. Larvenstadium aber tauschen die experimentellen Rollen von AM und OCT, dass die Tiere die folgende Ausbildung erhalten: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). In diesem Experiment CS1 stellt Oktober und CS2-Codes für AM.
7. Mögliche Vorkehrungen für die Ausbildung. Oben haben wir eine Ausbildung, die von drei Trainings Studien entweder Oktober / (+) existiert präsentieren - AM / (-) oder im reziproken Gruppe auch drei Trainings Studien AM / (+) - Oktober / (-). Jedoch zu sequenzieren abhängigen Effekte während des Trainings zu vermeiden, ist es wichtig, um die Reihenfolge der Reize im folgenden Wiederholungen des gesamten Tests variieren. Durch Variieren der Reihenfolge CS1 oder CS2 und auch die Belohnung Präsentation in der ersten oder zweiten Platte präsentierten sind vier verschiedene Sequenzen für die Ausbildung Versuche möglich:

Erste Gruppe	CS1 / (+) - CS2 / (-)	Gegenseitige Gruppe	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

Um systematische Wirkungen von Reizen im umgebenden experimentellen Umgebung zu verhindern, sollte man den Test in einer Hälfte der Fälle, dass Oktober auf der linken Seite dargestellt und AM nach rechts durchzuführen. In der anderen Hälfte der Fälle FSK sollte auf der linken und auf der rechten Oktober präsentiert.

3. Tests für Task-relevanten Sensory-Motor Fakultäten

Die Gestaltung der oben beschriebenen Experimente zur Analyse ermöglicht geruchsbindende Zucker Lernen in Wildtyp Zuführen ^3. Larvenstadium auf eigene. Jedoch in täglichen Lebens lab Forscher benutzen normalerweise zwei oder mehr verschiedenen Versuchsgruppen von Larven zu vergleichen, wenn olfaktorischen Lernen hängt auf einer Stufesondere Gen, einem bestimmten Satz von Neuronen, eine Mutante Lager, eine spezielle Diät, unterschiedliche Haltungsbedingungen, toxische Chemikalien zugesetzt während der Entwicklung, usw. Somit wird in allen Fällen, wenn zwei oder mehr Gruppen von experimentellen Larven getestet werden ein bis a tun hat gesetzt der obligatorischen Bekämpfung Experimenten zu überprüfen, ob die verschiedenen Gruppen von Larven richtige sensomotorische acuities zeigen. Diese Pflicht wird als potentielle Phänotypen nicht unbedingt aufgrund der reduzierten oder abgeschafft Fähigkeiten Associate Gerüche mit Zucker. Vielmehr könnte Potential Lern ​​Defekten auf Defekte in einem beliebigen Schritt des sensomotorischen Schaltung in der Verarbeitung von Gerüchen und / oder Zucker basieren. Oder in anderen Worten, wenn eine Mutante Larve ist nicht in der Lage zu erfassen Zucker, kann es nicht zu etablieren einen Zucker Speicher. Aber dies bedeutet nicht erlauben dem Schluss, dass die Larve kann man nicht lernen. Im Einzelnen sind folgende Kontrolle Experimente haben zu tun, um für die ordnungsgemäße Oktober, AM und Fructose Verarbeitung von transgenen Larven zu testen.

Ein. Test für naiv Oktober preferenz

Sammle 30 Fütterung 3 ^rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Waschen Sie sie sorgfältig in Leitungswasser wie in 2.1 beschrieben. Legen Sie eine einzelne Oktober Geruch Container auf einer Seite einer Agarose Petrischale, fügen die Larven in die Mitte der Petrischale, den Deckel schließen und warten, 5 min, so dass die Larven können sich auf der Petrischale und orientieren in Richtung Oktober kriechen Geruchsquelle. Anschließend zählt die Anzahl der Larven auf der linken Seite, in der Mitte und auf der rechten Seite des Prüflings Petrischale.

2. Test für naiv AM Präferenz

Sammle 30 Fütterung 3 ^rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Waschen Sie sie sorgfältig in Leitungswasser wie in 2.1 beschrieben. Legen Sie eine einzelne Uhr Geruchs-Container auf einer Seite einer Agarose Petrischale, fügen die Larven in die Mitte der Petrischale, den Deckel schließen und warten 5 Minuten, so dass die Larven können sich auf der Petrischale und orientieren in Richtung der Uhr kriechen Geruchsquelle. Anschließend zählt die Anzahl der larvae auf der linken Seite, in der Mitte und auf der rechten Seite des Prüflings Petrischale.

3. Test für naiv Zucker Präferenz

Sammle 30 Fütterung 3 ^rd Larven aus einem Lebensmittel Fläschchen. Waschen Sie sie sorgfältig in Leitungswasser wie in 2.1 beschrieben. Planen Petrischalen, die 2,5% Agarose enthält, in die eine Hälfte und einer 2M Fructose-Agarose Mischung in der anderen Hälfte. Fügen Sie den Larven auf die Petrischale, den Deckel schließen und für 5 min, so dass die Larven können sich auf der Petrischale und orientieren in Richtung fructosehaltigen Seite kriechen warten. Anschließend zählt die Anzahl der Larven auf der linken Seite, in der Mitte und auf der rechten Seite des Prüflings Petrischale.

Vorbereitung der halbe-halbe Petrischalen: Bereiten normalen Agaroseplatten wie oben beschrieben in Abschnitt 1,2. Wenn die Agarose gefüllt Petrischalen abgekühlt sind, sorgfältig ausgeschnitten die Agarose entlang der vertikalen Achse mit einem Skalpell. Entfernen einer Hälfte des Agarosegel aus der Petrischale. Add ein heißes Fructose-Agarose-Lösung (zur Herstellung siehe 1,3) auf die leere Hälfte der Petrischale. Achten Sie darauf, dass beide Hälften und passen nicht bilden eine definierte Kante - das wirkt sich auf die Larven Wahlverhalten und macht einen Verhaltensanalysen ziemlich schwierig ^4..

Sham Ausbildung

Trotz Prüfung, ob transgene Fütterung 3 ^rd Larven in der Lage, auf einem Wildtyp-Ebene zwischen Oktober und Luft (3,1), AM und Luft (3,2) und Zucker und reine Agarose (3,3), ein zusätzlicher Satz von Test-Experimenten zu unterscheiden sind, hat vor kurzem eingeführt (zur Diskussion siehe Gerber und Stocker, 2007). Die Begründung für diesen Experimenten ist die folgende. Während der Ausbildung Larven durchlaufen massiven Handhabung und aufeinander Geruch und Zucker Stimulation. Somit ist es auch möglich, dass die beobachteten Phänotyp Lernen irreführend ist (obwohl naiven Geruch und Zucker Wahrnehmung Tests sind auf einem Wildtyp Niveau!). Tatsächlich ist es möglich, dass die transgenen Tiere differ von Wildtyp-Larven mit Bezug auf Belastbarkeit, Motivation, Müdigkeit, sensorische Anpassung kontextuellen Lernen und Veränderungen in der Sättigung. So führte Michels et al. (2005) Steuerelemente, die testen, ob eine bestimmte Mutante in der Lage, (1) zu erkennen ist, im Vergleich zu einem leeren Geruch Behälter Uhr, wenn Sie die Larven genau wie beim Training, außer dass Sie weglassen die Belohnung und lediglich um sowohl aussetzen zu behandeln Gerüche, (2) erkennen Oktober nach dem gleichen Regime, (3) erkennen Uhr gegenüber einem leeren Geruch Container, wenn Sie die Larven in einem Training-like Weise, außer dass man auch die Gerüche und lediglich auf die Belohnung aussetzen zu behandeln, und (4 ) erkennen Oktober nach dem gleichen Schema. Für eine umfassende Diskussion und weitere Details zu den Methoden finden Sie Michels et al (2005) und Gerber und Stocker (2007).

4. Datenanalyse für Zucker Belohnung Learning

1. Um die Daten des Zuckers Belohnung Lernen Protokoll auszuwerten berechnen Oktober Präferenz Index (PREF OCT) für jede der beiden reziprokentisch geschult Gruppen:
   Für die erste Gruppe, die OCT / (+) erhalten - AM / (-) Ausbildung:
   PREF Oktober (Oktober + / AM-) = (Anzahl der Larven auf Oktober Seite - Anzahl der Larven auf AM Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen
   Für die zweite Gruppe, die AM / (+) erhalten - Oktober / (-) Ausbildung:
   PREF AM (AM + / OCT-) = (Anzahl der Larven auf AM Seite - Anzahl der Larven auf Oktober auf dieser Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen

2. Berechnen Sie einen Performance-Index (PI) für die beiden PREF Werte von 4,1). Die PI stellt assoziativen Lernens durch Auslöschen Störwirkung von Geruch und Bestrafung Belichtung Laufe der Zeit und Handhabung:
   PI = (PREF Oktober (Oktober + / AM) + PREF AM (AM + / Oktober)) / 2
   So PIs können von -1 bis 1 liegen. Deutlich negative Werte repräsentieren aversive lernen, während deutlich positive Werte appetitive Lernen zu beschreiben. Ein komplettes Experiment umfasst in der Regel von 10 oder mehr PIs. Daten werden visualisiert, wie Boxplots including alle Werte einer Versuchsgruppe. 50% der Werte innerhalb der Box befindet, der Median-Performance-Index wird als fette Linie innerhalb der Box-Plot angezeigt.

5. Datenanalyse für Task-relevanten Sensory-Motor Fakultäten

1. Zur Auswertung der Daten bei der Prüfung auf ordnungsgemäße Oktober Geruch Verarbeitung Berechnung eines OCT Geruch Präferenz-Index wie folgt:
   Geruch PREF Oktober = (Anzahl der Larven auf Oktober Seite - Anzahl der Larven auf der anderen Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen
2. Zur Auswertung der Daten bei der Prüfung auf ordnungsgemäße AM Geruchswahrnehmung berechnen AM Geruch Präferenz-Index wie folgt:
   Geruch PREF AM = (Anzahl der Larven auf AM Seite - Anzahl der Larven auf der anderen Seite) / # aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen
3. Zur Auswertung der Daten bei der Prüfung auf ordnungsgemäße Fructose Wahrnehmung berechnen Fructose Präferenz-Index wie folgt:
   PREF Fructose = (Anzahl der Larven auf Fruktose Seite - # von Larven auf der anderen Seite) / # Aller Larven innerhalb der linken, rechten und mittleren Zonen
4. Details zum Schein Ausbildung sind in Michels et al. 2005.

Ergebnisse

1A zeigt einen Überblick über die experimentellen Verfahren für die Larven olfaktorischen assoziativen Lernens. Durch Koppeln eines der beiden vorgestellten Gerüche mit einem Zucker Belohnung Larven erfassen das Verhalten Potential, um ein attraktives Verhalten gegenüber dem belohnten Duft im Vergleich zum unbelohnt Geruch abzugeben. Zwei Gruppen von Larven sind immer entweder durch Paarung der Verstärker mit dem Geruch Oktober oder AM geschult. Die Leistung (PI) misst die assoziativen Funktion al...

Diskussion

Die beschriebene Einrichtung in Drosophila-Larven erlaubt die Untersuchung von assoziativen Lernen olfaktorischen innerhalb eines vergleichsweise elementaren Gehirn. Der Ansatz ist einfach, billig, einfach, in einem Labor zu etablieren und benötigt keine High-Tech-Ausrüstung ^9. Wir präsentieren eine Variante des Experiments, um appetitive assoziativen Lernens durch Fructose Belohnung ¹¹ verstärkt zu studieren. Die beschriebene Setup basiert auf einer Reihe von parametrischen Stud...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	CAS-Nummer
Fructose	Sigma	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
Agarose	Sigma	A5093	9012-36-6
1-Octanol	Sigma	12012	111-87-5
Amylacetat	Sigma	46022	628-63-7
Petroleum	Sigma	18512	8012-95-1