Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Riepilogo

Larve di Drosophila sono in grado di associare stimoli odore con la ricompensa gustativa. Qui descriviamo un semplice paradigma comportamentale che permette l'analisi di appetitivo apprendimento associativo olfattivo.

Abstract

Nel seguito sono descritti i dettagli metodologici appetitiva apprendimento associativo olfattivo nelle larve Drosophila. La configurazione, in combinazione con interferenza genetica, fornisce una maniglia per analizzare i fondamenti neuronali e molecolari di apprendimento specificamente associativo in un cervello semplice larvale.

I microrganismi possono utilizzare l'esperienza passata per regolare il comportamento presente. Tale acquisizione del potenziale comportamentale può essere definito come l'apprendimento, e le basi fisiche di questi potenziali come tracce di memoria ^1-4. I neuroscienziati cercare di capire come questi processi sono organizzati in termini di cambiamenti molecolari e neuronali nel cervello, utilizzando una varietà di metodi in organismi modello che vanno dagli insetti ai vertebrati ^5,6. Per tali sforzi, è utile usare sistemi di modelli che sono semplici e accessibili sperimentalmente. La larva Drosophila è rivelato soddisfare queste richieste basate sula disponibilità di solidi saggi comportamentali, l'esistenza di una varietà di tecniche transgeniche e l'organizzazione elementare del sistema nervoso che comprende solo circa 10.000 neuroni (anche se con qualche concessione: limitazioni cognitive, poche opzioni comportamentali, e la ricchezza di esperienza discutibile) ^7-10 .

Larve di Drosophila possono formare associazioni tra odori e appetitiva rinforzo gustativa come lo zucchero ^11-14. In un saggio standard, stabilita nel laboratorio di Gerber B., gli animali ricevono due odore formazione reciproca: Un primo gruppo di larve è esposto ad un odore Un insieme ad un rinforzo gustativo (ricompensa zucchero) e viene successivamente esposto ad un odore B senza armatura ^9. Nel frattempo, un secondo gruppo di larve riceve una formazione reciproca, mentre vivendo un odore senza armatura e, successivamente, di essere esposti a B odore con rinforzo (premio zucchero). In seguito entrambi i gruppi sono testa per la loro preferenza tra i due odori. Preferenze relativamente più elevati per l'odore premiato riflettere apprendimento associativo - presentato come un indice di prestazione (PI). La conclusione in merito alla natura associativa dell'indice di prestazione è convincente, perché a parte la contingenza tra odori e sostanze sapide, altri parametri, come ad esempio l'odore e l'esposizione ricompensa, passare del tempo e la gestione non differiscono tra i due gruppi di ^9.

Protocollo

1. Preparazione

1. Drosophila wild-type larve vengono sollevate a 25 ° C e 60% ​​-80% di umidità in un ciclo di 14/10 chiaro / scuro. Per controllare l'età esatta delle larve sempre 20 femmine sono messi con 10 maschi in un flaconcino (6 cm di altezza e 2,5 cm di diametro) che include circa 6 ml di cibo mosca standard. Le mosche possono deporre le uova per 12 ore e sono trasferiti in un nuovo flaconcino il secondo giorno. 5-6 giorni dopo la deposizione delle uova larve raggiungere l'alimentazione 3 ^° fase instar se sollevato a 25 ° C e può essere utilizzata per l'esperimento comportamentale. Tuttavia, si deve assicurare prendere solo larve che sono ancora in cibo non e le larve dal lato del flaconcino. Queste larve hanno già raggiunto il "vagabondaggio 3 ^° fase instar" - poco prima impupamento - e il loro impiego complica l'interpretazione dei risultati.
2. Preparazione del 2,5% agarosio capsule di Petri (altri laboratori utilizzare anche le concentrazioni di agar all'1% per tutto l'esperimento, comeconcentrazioni sempre più basse possono consentire l'alimentazione 3 ^° larve instar a scavare nel substrato): Sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH ₂ O. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nel forno a microonde fino a quando tutti agarosio è sciolto. Versare la soluzione calda di agarosio in piastre Petri tali che il fondo delle piastre di Petri è completamente coperto e la soluzione di agarosio forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi.
3. Preparazione di 2M fruttosio piastre di Petri: sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH ₂ O (ancora una volta, l'uso della concentrazione di agar 1% è possibile, ma può autorizzare l'alimentazione 3 ^° larve instar a scavare nel substrato). Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nella microonda finché tutto agarosio è sciolto. Aggiungere con cautela 35 g di fruttosio nella soluzione calda, lentamente agitare la miscela fino a quando lo zucchero è sciolto per evitare ritardo ebollizione. Versare il fruttosio hot-agarosio soluzione in piastre Petri tali che il fondo è completamente coperto e il fruttosio-agarosio soluzione forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi.
4. Preparazione di 1-ottanolo (OCT) contenitori odore: riempire 10 ml di puro ottobre in un contenitore su misura odore teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l'evaporazione dell'odore. Una descrizione dettagliata dei contenitori viene dato in Gerber e Stocker 2007. Preparare tre contenitori odore di ottobre Contenitori odore consentire l'evaporazione delle sostanze chimiche inseriti, ma evitare che le larve possono contattare direttamente loro. Pertanto, gli esperimenti qui descritti specificamenteaffrontare l'apprendimento olfattivo nelle larve senza perturbare effetti collaterali gustative.
5. Preparazione di Amilacetato (AM) contenitori odore: Diluire AM 1:50 in olio di paraffina. Riempire 10 ml di diluizione in un contenitore personalizzato fatto odore Teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l'evaporazione dell'odore. Preparare tre contenitori odore per AM. La diluizione è importante per ragioni pratiche, ossia evitare una forte preferenza per uno sopra l'altro odore che può mascherare un apprendimento dipendente dalla variazione nella preferenza relativa tra i due odori. L'attrazione uguale per entrambi gli odori possono devono essere confermati in laboratorio prima che l'esperimento applicando il test in seguito descritto (2.5) con gli animali naïve. Il valori qui presentati si basano su varie pubblicazioni del laboratorio di Gerber che sono stati recentemente riprodotti dal nostro laboratorio ^9,15,16.
6. Etichettatura delle piastre di Petri: prima gli esperimenti comportamentali tutte le piastre di Petri devono essere codificati. Ciò significa chefruttosio contenente piastre di Petri devono essere contrassegnati, ad esempio con una "X" oppure un "A" e agarosio solo piastre di Petri con una "Y" o "B". Questo codice deve essere rivelato al sperimentatore solo dopo che tutti i dati siano stati registrati. Eseguendo gli esperimenti "cieco" non è dunque possibile che le aspettative del sperimentatore può influire sulle prestazioni delle larve. Per facilitare la comprensione per i lettori ampio seguito si parla solo gli odori come stimoli condizionati (CS1 e CS2), che siano ricompensati quando viene presentato su un piatto Petri fruttosio (+) o non-premiata quando ha presentato su un solo agarosio Petri (-).

2. Zucchero Training Ricompensa e Test

1. Raccogliere 30 di alimentazione 3 ^° larve instar da un flaconcino cibo. Trasferirli ad un primo piatto Petri contenente alcune gocce di acqua di rubinetto e con cura muoversi avanti e indietro con un pennello. Trasferimento ad un secondo piatto di Petri che contiene anche alcune gocce di rubinetto water per controllare che non pasta alimentare rimane sul bodywall delle larve, altrimenti le larve sarebbe in grado di provare l'odore cibo durante l'esperimento. Ciò probabilmente oscurare il processo di apprendimento e le loro prestazioni in situazione di test.
2. Formazione: Formare larve di odori associati con una stecca di zucchero appetitivo il seguente regime viene applicato. Posizionare un contenitore odore ottobre sul lato sinistro e destro di una "X" segnato - in tal modo, ricompensa contenente fruttosio (+) Petri (esperimento "cieca", per i dettagli vedere 1.6). Posizionare il gruppo di alimentazione 30 3 ^rd larve instar sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a ottobre Assicurarsi che le larve non sono intrappolati all'interno della goccia d'acqua e può superare la tensione superficiale di esso. Con che le larve possono muoversi liberamente sulla piastra di Petri e sperimentare stimoli olfattivi e / o gustativa.
3. Formazione: Rimuovere le larve dalla piastra di Petri con un pennello inumidito e trasferire ilm su un secondo piatto Petri che è etichettato con una "Y" - quindi, solo agarosio (-) contenente piastra Petri - e ha un contenitore AM odore situato sul lato sinistro e destro. Chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a AM.
4. Formazione: Ripeti 2.2) e 2.3) per due volte, in modo tale che tutte le larve di 30 Esperienza tre cicli di formazione: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM.
5. Test: Un posto AM e un contenitore odore ottobre sui siti opposti di un agarosio sola piastra di Petri. Trasferire gli animali addestrati al centro del piatto di prova Petri. Chiudere il coperchio ed attendere 5 min. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, il lato destro e centrale del piatto di prova Petri.
6. Ripetere i passaggi da 2.1) a 2.5) con un secondo gruppo di 30 di alimentazione 3 ^° larve instar ma scambiare i ruoli sperimentali di AM e PTOM, in modo tale che gli animali ricevano la formazione seguente: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM.
7. Modalità possibili per la formazione. Sopra vi presentiamo una formazione che esiste di tre studi di formazione di entrambi OCT / (+) - AM / (-) o nel gruppo di reciproca anche tre prove di formazione di AM / (+) - Ottobre / (-). Tuttavia, per evitare effetti sequenza dipendente durante la formazione è importante variare la sequenza degli stimoli in ripetizioni seguenti dell'esperimento completo. Variando l'ordine CS1 o CS2 e anche la presentazione ricompensa nella prima piastra o secondo presentato, quattro sequenze diverse per i processi di formazione sono possibili:

Primo gruppo	CS1 / (+) - CS2 / (-)	Reciproco gruppo	CS2 / (+) - CS1 / (-)
	CS1 / (-) - CS2 / (+)		CS2 / (-) - CS1 / (+)
	CS2 / (+) - CS2 / (-)		CS1 / (+) - CS2 / (-)
	CS2 / (-) - CS1 / (+)		CS1 / (-) - CS2 / (+)

Per evitare effetti sistematici di stimoli nell'ambiente circostante sperimentale, si dovrebbe effettuare la prova in una metà dei casi che ottobre viene presentato sulla sinistra e sulla destra AM. Nell'altra metà dei casi AM devono essere presentati sulla sinistra e sulla destra ottobre.

3. I test per attività rilevanti per senso-motorie Facoltà

La progettazione di esperimenti sopra descritti consente l'analisi di odori zucchero apprendimento nel tipo selvatico alimentazione 3 ^° larve instar da solo. Tuttavia, nella vita quotidiana ricercatori laboratorio solito usano due o più differenti gruppi sperimentali di larve di confrontare, se l'apprendimento olfattivo dipende da una pargene colare, un insieme specifico di neuroni, uno stock mutante, una dieta speciale, diverse condizioni di allevamento, prodotti chimici tossici aggiunto durante lo sviluppo, ecc Così, in tutti i casi in cui due o più gruppi sperimentali di larve vengono testati si deve fare una serie di esperimenti di controllo obbligatorie per verificare, se i diversi gruppi di larve mostrano proprie senso-motorie acuità. Questo diventa obbligatorio come fenotipi potenziali non sono necessariamente a causa di capacità ridotta o abolita per gli odori associati con lo zucchero. Piuttosto, i potenziali difetti di apprendimento potrebbe essere basato su difetti in ogni fase del circuito senso-motorio nella lavorazione di odori e / o zucchero. O in altre parole, se una larva mutante non è in grado di zucchero senso, non è possibile stabilire una memoria zucchero. Ma questo non consente di concludere che la larva non può imparare. In particolare i seguenti esperimenti di controllo devono essere fatte per testare il corretto PTOM, AM e la trasformazione di fruttosio di larve transgeniche.

1. Test per ingenuo ottobre preferiscarenza

Raccogliere 30 di alimentazione 3 ^° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un contenitore odore ottobre su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l'ottobre odore sorgente. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri.

2. Test per ingenuo preferenza AM

Raccogliere 30 di alimentazione 3 ^° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un odore AM contenitore su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l'AM odore sorgente. Successivamente contare il numero di larvae sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri.

3. Test per la preferenza zucchero ingenuo

Raccogliere 30 di alimentazione 3 ^° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Preparare piatti Petri contenenti 2,5% agarosio in una metà e una 2M fruttosio-agarosio miscela nell'altra metà. Aggiungere le larve sul piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso il lato contenente fruttosio. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri.

Preparazione di mezzo mezzo piastre di Petri: Preparare normali piastre di agarosio come descritto in precedenza nella sezione 1.2. Quando i pieni agarosio piastre Petri sono raffreddati, tagliare l'agarosio lungo l'asse verticale con un bisturi. Rimuovere una metà del agarosio dalla piastra Petri. Ladd un hot-fruttosio agarosio soluzione (per la preparazione cfr 1,3) al mezzo vuoto della piastra Petri. Fare attenzione che entrambe le metà partita e non formano un bordo definito - questo influisce sul comportamento larvale scelta e rende l'analisi del comportamento piuttosto difficile. ^4.

Sham formazione

Nonostante il test se l'alimentazione transgenica 3 ^° instar larve sono in grado di distinguere con un livello di selvaggia tra ottobre e aria (3.1), AM e aria (3.2) e lo zucchero e puro agarosio (3.3), un ulteriore set di esperimenti di prova è stato recentemente introdotto (per la discussione cfr. Gerber e Stocker, 2007). Il razionale di questi esperimenti è il seguente. Durante la formazione larve subiscono manipolazione massiccia e odore successive e zucchero stimolazione. Così, è ben possibile che il fenotipo osservato apprendimento è fuorviante (anche se l'odore ingenuo e prove percezione zucchero sono con un livello selvaggio!). Infatti, è possibile che gli animali transgenici differ da larve wild type rispetto alla resistenza allo stress, la motivazione, la fatica, adattamento sensoriale, l'apprendimento contestuale, e cambiamenti di sazietà. Così, Michels et al. (2005) ha introdotto controlli che verificare se un mutante dato è in grado di rilevare (1) AM rispetto a un contenitore vuoto odore se si trattano le larve esattamente come durante l'allenamento, tranne che si omette il premio e solo esporre sia odori, (2) rilevare ottobre dopo che il regime stesso, (3) rilevano AM contro un contenitore vuoto odore, se si trattano le larve in una formazione simile modo a meno che si omette gli odori e semplicemente esporre la ricompensa, e (4 ) rilevano ottobre dopo lo stesso dosaggio. Per una discussione completa e ulteriori dettagli sui metodi di vedere Michels et al (2005) e Gerber e Stocker (2007).

4. Analisi dei dati per l'apprendimento di zucchero Ricompensa

1. Per valutare i dati del protocollo di apprendimento zucchero ricompensa calcolare un indice di preferenza OCT (PREF OCT) per ciascuno dei due reciprocitàgruppi automaticamente formati:
   Per il primo gruppo che ha ricevuto OCT / (+) - AM / (-) formazione:
   PREF OCT (OCT + / AM-) = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato AM) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale
   Per il secondo gruppo che ha ricevuto AM / (+) - Ottobre / (-) formazione:
   PREF AM (AM + / OCT-) = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato ottobre) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale

2. Calcolare un indice di prestazione (PI) per i due valori PREF da 4.1). Il PI rappresenta apprendimento associativo da annullando effetti perturbatori di odore e di esposizione punizione, passare del tempo e la gestione:
   PI = (PREF ottobre (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTOM)) / 2
   Così PI può variare da -1 a 1. Valori significativamente negativi rappresentano avversione di apprendimento, mentre valori significativamente positivi descrivere l'apprendimento appetitiva. Un esperimento completo comprende di solito di 10 o più inibitori della proteasi. I dati sono visualizzati come sap casella di trameg tutti i valori di un determinato gruppo sperimentale. 50% dei valori essendo situato all'interno della scatola, l'indice di prestazioni mediana è indicata come una linea in grassetto nella particella casella.

5. Analisi dei dati per l'attività rilevanti senso-motorie Facoltà

1. Per valutare i dati durante il test per il corretto trattamento degli odori ottobre calcolo di un indice odore ottobre preferenze come segue:
   Odore PREF ottobre = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale
2. Per valutare i dati durante il test per una corretta percezione degli odori AM calcolare un indice di odore AM preferenze come segue:
   Odore PREF AM = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale
3. Per valutare i dati durante il test per la percezione fruttosio corretto calcolare un indice di preferenza fruttosio come segue:
   PREF fruttosio = (# di larve lato fruttosio - # di larve dall'altra) / N ° di tutte le larve all'interno delle zone di sinistra, destra e centrale
4. Dettagli per la formazione farsa sono in Michels et al. 2005.

Risultati

La figura 1A mostra una panoramica delle procedure sperimentali per l'apprendimento olfattivo larvale associativo. Accoppiando uno dei due odori presentati con un premio larve zucchero acquisire il potenziale comportamento di esprimere una risposta attraente verso l'odore ricompensati rispetto al unrewarded odore. Due gruppi di larve sono sempre formati da una associazione il rinforzo con l'odore PTOM o AM. L'indice di prestazioni (PI) misura la funzione associativa come la differenza di...

Discussione

La configurazione descritta in larve di Drosophila permette lo studio di apprendimento associativo olfattivo all'interno di un cervello relativamente elementare. L'approccio è semplice, economico, facile da stabilire in un laboratorio e non richiede attrezzature ad alta tecnologia ^9. Vi presentiamo una versione dell'esperimento, per studiare appetitiva apprendimento associativo rafforzato dalla ricompensa fruttosio ^11. La configurazione descritta si basa su una serie di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Numero CAS
Fruttosio	Sigma	47740	57-48-7
NaCl	Fluka	71350	7647-14-5
Agarosio	Sigma	A5093	9012-36-6
1-ottanolo	Sigma	12012	111-87-5
Amilacetato	Sigma	46022	628-63-7
Olio di paraffina	Sigma	18512	8012-95-1