Pelle tatuaggio come un nuovo approccio per la consegna del DNA vaccino

Riepilogo

Tatuaggio della pelle è un modo potente e sicuro per la consegna del DNA vaccino intradermica. Qui, un plasmide EGFP codifica DNA viene consegnato da tatuaggio alla pelle di un topo di laboratorio, e l'espressione di EGFP in cellule della pelle viene poi controllata mediante microscopia confocale.

Abstract

A base di acido nucleico vaccinazione è un argomento di crescente interesse, in particolare del DNA plasmidico (pDNA), che codifica gli antigeni immunologicamente importanti. Dopo la pDNA ingegneria è somministrato ai vaccini, si trascritta e tradotta in proteine ​​immunogeno che possono suscitare risposte dal sistema immunitario. Molti modi di fornitura di vaccini a DNA sono stati indagati, ma ogni percorso di consegna ha i suoi vantaggi e le insidie. Tatuaggio della pelle è una nuova tecnica che è sicuro, economico e conveniente. Inoltre, le punture inflitte da dell'ago potrebbe anche servire come un potente adiuvante. Qui, a) dimostrare l'erogazione intradermica di codifica DNA plasmidico maggiore proteina verde fluorescente (PCX-EGFP) in un modello di topo usando un dispositivo di tatuaggi e b) confermare l'espressione efficace EGFP nelle cellule della pelle utilizzando la microscopia confocale.

Protocollo

1. Purificazione del DNA plasmidico

1. Trasformare il eucariotica plasmide DNA codificante EGFP (pcx-EGFP) in DH5a cellule E.coli competenti. Il vettore vuoto PCX può anche essere utilizzato come controllo negativo.
2. Cultura e raccogliere le cellule E.coli DH5a e purificare il pDNA secondo il Manuale Purificazione EndoFree Qiagen Plasmid.
3. Filtrare la soluzione attraverso un pDNA 0,22 micron PVDF filtro sterile, e conservarlo a -20 ° C fino all'uso.

2. Preparazione del sistema Tattoo

1. Collegare l'unità palmare e il pedale di controllo per l'unità di alimentazione per le istruzioni del produttore.
2. Impostare la frequenza di oscillazione dell'ago a circa 100 Hz. Per il dispositivo tatuaggio che abbiamo scelto (Sistema Tattoo Stealth Rotary), il selettore della tensione di alimentazione deve essere impostato a 4 volt. Fare riferimento al manuale utente o il supporto tecnico per i sistemi di tatuaggio altri.
3. Sterilizzare l'ar agoray prima dell'uso. Si consiglia di utilizzare un array di aghi per animale. Gli aghi possono essere riutilizzati dopo essere stati puliti con acqua e sapone e in autoclave.
4. Installare l'array ago nel palmare e liberamente fissare il manico in plastica.
5. Regolare la profondità dell'ago in maniera appropriata spostando il manico in plastica verso l'alto o verso il basso. Abbiamo usato una profondità dell'ago di circa 0,5 mm per il nostro esperimento mouse.
6. Stringere la presa di plastica quando la profondità dell'ago è impostato correttamente, e il sistema tatuaggio è pronto per l'uso.

3. Animal Rasatura

1. Scegliere il sito per il trattamento tatuaggio. Il sito dovrebbe essere una zona relativamente stabile, liscio, e carnosa della pelle, per esempio, il lato della gamba posteriore dell'animale.
2. Anestetizzare un topo BALB / c con una miscela di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) in funzione del peso corporeo dell'animale. Per gli animali, fare riferimento alle linee guida anestesia della vostra istituzione.
3. Controllare ildell'animale riflessi di pizzicare il piede per confermare l'animale è adeguatamente anestetizzato.
4. Usare il trimmer elettrico a rintuzzare i capelli posteriori dell'animale lentamente e con attenzione. Rimuovere i capelli dal sito tatuaggio previsto e la zona circostante.
5. Rimuovere il pelo corto residua con il rasoio di sicurezza monouso. Fare attenzione a non tagliare la pelle dell'animale. Si noti che la crema depilatoria può essere utilizzato in alternativa depilazione metodo, tuttavia, si preferisce barba sopra crema depilatoria.
6. Rimuovere peli tagliati randagi dalla pelle con l'aria compressa, se necessario.

4. Consegna di DNA plasmidico con un tatuaggio

1. Se un protocollo di immunizzazione è stato stabilito in precedenza, la dose e il volume di soluzione di DNA da applicare deve essere calcolato di conseguenza. Si consiglia di utilizzare il minor volume pratico per rendere il processo di tatuaggio più gestibile. In questa dimostrazione EGFP, abbiamo utilizzato 7,5 ml di soluzione di DNA in un conconcentrazione di 0,25 mg / ml, che è stato applicato su una zona tatuaggio di circa 1 cm ^2. Per gli esperimenti di immunizzazione, concentrazioni più elevate pDNA può essere richiesto per indurre una forte risposta immunitaria ^1,2.
2. Applicare la soluzione di DNA pipettando direttamente sul sito tatuaggio. In alternativa, caricare la soluzione di DNA nella presa di plastica pipettando, in modo che il liquido è sospeso tra l'ago e la punta della presa di plastica. Vedere il video per una dimostrazione. Abbiamo osservato alcun notevole differenza tra i due metodi. Tuttavia, caricare la soluzione nella presa di plastica può essere vantaggioso su superfici verticali della pelle, per esempio.
3. Avviare l'oscillazione dell'ago e posizionare la matrice ago con una leggera pressione sulla pelle dell'animale al sito tatuaggio. Quindi spostare l'ago oscillante delicatamente e lentamente in modo lineare per fornire DNA plasmidico su tutta l'area tatuaggio intero. Mantenere un angolo di 90 gradi tra l'ago e la pelle per evitarelacerazioni alla pelle.
4. Osservare la pelle. Abrasione e l'infiammazione sono normali. Se l'emorragia si verifica, interrompere il processo di tatuaggio e diminuire la profondità dell'ago.
5. Continua il movimento dell'ago per circa 1 minuto, e quindi arrestare il processo di tatuaggio.
6. Usare un tampone di cotone pulito per applicare un sottile strato di analgesico topico sul sito tatuaggio. Analgesici topici come Crema sulfadiazina d'argento (SSD Cream) o pomate Neosporin può contribuire ad alleviare il dolore o la sofferenza degli animali, e, pertanto, si consiglia di applicare prima l'anestesia svanisce. Osservare gli animali il giorno successivo per i segni di dolore o disagio (cambio di andatura, inattività). Riapplicare la crema analgesica se i segni persistono.

5. Conferma di espressione dell'antigene

1. 48 ore dopo il trattamento tatuaggio (si noti che diversi costrutti pDNA possono richiedere tempi di espressione diversi), il mouse è eutanasia da CO ₂ narcosi. Per altrigli animali, fare riferimento alle linee guida di eutanasia della vostra istituzione.
2. Staccare la pelle al sito di tatuaggi, e fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% a 4 ° C per una notte.
3. Lavare il tessuto con il 70% di etanolo, e le trasferisce in PBS 1X per l'imaging.
4. Esaminare il tessuto intero utilizzando un microscopio confocale per verificare la presenza di segnali di EGFP. In alternativa, il tessuto della pelle può essere incorporato in paraffina ed esaminati in sezioni al microscopio a fluorescenza.

Risultati

L'espressione di EGFP con un picco di eccitazione a 488 nm e picco di emissione a 509 nm può essere osservata in cellule di topo. Da una dose di 1,875 pg di DNA, contenente circa 3 × 10 ¹⁷ copie del plasmide, si osserva tipicamente 10-20 segnali eGFP in 1 cm ² tatuato zona. Questo numero relativamente basso di cellule trasfettate è coerente con i risultati di uno studio precedente ^3. L'espressione EGFP (Figura 1) fornisce la prova che è stato consegnato plasm...

Discussione

Vaccinazione DNA è considerato più sicuro di strategie di vaccinazione tradizionali in quanto non richiede la manipolazione dei, o esporre i vaccini a patogeni, vivi o attenuati ^4. Tuttavia, il risultato della vaccinazione DNA dipende fortemente percorso di consegna. Pelle è abbondante in cellule presentanti l'antigene, come le cellule di Langerhans e cellule dendritiche ^1, e quindi un luogo ideale per l'immunizzazione in termini di immunogenicità e facilità di accesso ^5,6. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
pcx-EGFP DNA plasmidico	Clontech
STEALTH Sistema Tattoo Rotary	Tattoo Supply tutto il mondo	STEALTH-L
Aghi per tatuaggio	Tattoo Supply tutto il mondo	1207RSB
EndoFree Kit Maxi Plasmid	Qiagen	12362
0,22 um PVDF filtro sterile	Millipore	SLGV013SL
capelli trimmer elettrico	Disponibile in commercio
monouso rasoi di sicurezza	Disponibile in commercio
ArgentoSulfadiazine Crema	Watson	NDC 0591-0810-55
Ketamina HCL		NDC 0856-2012-01
Zylazine soluzione sterile		NADA 139-236