À haut débit, l'extraction automatisée de l'ADN et de l'ARN dans des échantillons cliniques utilisant la technologie TruTip sur des robots de manipulation de liquide commune

Résumé

TruTip est une technologie d'extraction de l'acide nucléique simple au moyen duquel une matrice de liaison poreuse monolithique est insérée dans un embout de pipette. Par conséquent, le format de la préparation de l'échantillon est compatible avec les instruments de manipulation les plus liquides, et peut être utilisé pour de nombreuses applications cliniques à moyen et à haut débit et types d'échantillons.

Résumé

TruTip est une technologie d'extraction de l'acide nucléique simple au moyen duquel une matrice de liaison poreuse monolithique est insérée dans un embout de pipette. La géométrie du monolithe peut être adapté pour des embouts de pipette spécifiques variant en volume de 1,0 à 5,0 ml. La grande porosité du monolithe permet échantillons visqueux ou complexe pour passer facilement à travers elle avec un minimum de contre-pression fluidique. Flux bidirectionnel maximise le temps de séjour entre le monolithe et l'échantillon et permet de grands volumes d'échantillons à traiter dans un seul TruTip. Les étapes fondamentales, quel que soit le volume de l'échantillon ou de la géométrie de TruTip, notamment la lyse cellulaire, un acide nucléique se liant aux pores intérieurs de l'TruTip monolithe, élimination par lavage de composants de l'échantillon non liés et des tampons de lyse, et à éluer les acides nucléiques purifiés et concentrés dans un tampon approprié. Les attributs et l'adaptabilité de TruTip sont démontrées dans trois protocoles de traitement des échantillons cliniques automatisés utilisant un epMotion Eppendorf 5070, Hamilton STAR et StarPlus robots de manipulation de liquides, y compris l'isolement d'ARN à partir aspiration du nasopharynx, l'isolement de l'ADN génomique à partir de sang total, et l'extraction de l'ADN fœtal et à l'enrichissement de grands volumes de plasma maternel (respectivement).

Introduction

Purification des acides nucléiques est nécessaire pour le diagnostic moléculaire plus, la recherche uniquement et les applications des sciences de la vie. Diverses approches ont émergé depuis l'époque des extractions au phénol / chloroforme, dont beaucoup sont basés sur le principe fondamental de l'acide nucléique se liant à la silice en présence de sels chaotropiques ^1. Le processus d'extraction a été rationalisé et automatisé par l'utilisation de différents formats et perles à base de membranes, de filtres à spin, perles magnétiques et d'approches connexes qui dominent le secteur des sciences de la vie (voir les exemples dans ^2-13). Bien qu'ils soient efficaces, les particules et les membranes ont connu des limitations lorsqu'ils sont confrontés à des matrices cliniques difficiles. Par exemple, des membranes et des colonnes à base de billes sont conformes, avoir de petites tailles de pores (ainsi, les hautes pressions du dos), et d'exiger un certain type de support afin d'être traitées par un système de centrifugeuse ou un aspirateur. Les caractéristiques physiques des membranes et des perles colonnes résultat enrésistance fluidique significative, ce qui limite le type d'échantillons qui peut être traitée de façon efficace sans colmatage du consommable, et / ou le total (entrée) du volume d'échantillon qui peut être unidirectionnelle traitées à travers le trajet d'écoulement. Inversement, les particules magnétiques doivent être réparties tout au long de l'échantillon par agitation. La nécessité de répartir de façon homogène des particules magnétiques dans une solution limite le volume de l'échantillon d'entrée totale qui peut être traitée avec des consommables de perles les plus magnétiques. Attributs de l'échantillon clinique (telles que la viscosité ou la complexité) peuvent conduire à la concentration des particules magnétiques inefficace sur le côté d'un tube ou d'une tige. En outre, la silice particules fines peuvent se détacher des perles pendant le processus d'extraction, de perdre leur aimantation et de contaminer l'échantillon final.

La technologie TruTip a été développé pour surmonter certaines de ces contraintes d'acides nucléiques de l'échantillon de traitement et les limites ^14. En incorporant un monolithe poreux d'unpointe de la pipette, fluidique contre-pression est abaissée, ce qui permet le contrôle de flux par le vide (ie pipette aspiration). Cette fonction permet au processus d'extraction et de l'instrumentation nécessaire pour purifier les acides nucléiques à partir de types d'échantillons difficiles à être grandement simplifiée (Figure 1). La géométrie et de la porosité du monolithe est adaptée pour minimiser le colmatage, tandis que l'épaisseur du monolithe présente une capacité de liaison d'acide nucléique suffisante pour des volumes d'échantillon allant de 1,0 à 5,0 ml. Écoulement bidirectionnel pendant l'aspiration de l'échantillon et de distribution permet des temps de séjour prolongés entre l'extrait d'échantillon et le monolithe de liaison pour la récupération efficace de l'acide nucléique et d'élution, et permet relativement grands volumes d'échantillons à traiter qui dépasse la capacité du volume de la pointe de pipette elle-même. Nous avons déjà signalé l'élaboration et l'application d'une procédure de TruTip manuel pour purifier l'ARN de la grippe à partir d'échantillons naso-pharyngés en utilisant un seul ou multi-canal Rainin pipette ^15. Rendements d'extraction équivalents ont été obtenus entre automatisé QIAcube et les méthodes de TruTip manuelle ⁶ à 10 copies du gène de la grippe A ml aspiration du nasopharynx par. L'objectif de cette étude était de démontrer les procédures à moyen et à haut débit, automatisés TruTip Purification des acides nucléiques pour aspiration du nasopharynx (NPA) et d'autres types d'échantillons cliniques pertinentes, l'utilisation de robots de manipulation de liquides communément trouvées dans les laboratoires cliniques de référence.

Protocole

Trois protocoles d'extraction de TruTip automatisés sont décrits et démontrés ici: 1) débit moyen extraction de l'ARN du NPA sur un Eppendorf epMotion 5070; 2) à haut débit génomique extraction d'ADN à partir de faibles volumes de sang total sur la Hamilton STAR, et 3) l'isolement sélectif et l'enrichissement de l'ADN fœtal fragmenté de grands volumes de plasma maternel sur le StarPlus Hamilton. Scripts automatisés sont disponibles à partir de Akonni et seuls les descripteurs de programme de haut niveau sont fournis ici. Les réactifs d'extraction et d'élution sont automatiquement distribuées dans des auges de réactifs en vrac sur des plaques à 96 puits par le script automatisé (s) avant que les échantillons cliniques sont traitées.

1. Automated extraction d'ARN à partir de Aspirate nasopharynx

La méthode manuelle décrite précédemment TruTip ¹⁵ est maintenant adaptée pour fonctionner sur un Eppendorf epMotion 5070 robot de manipulation de liquide, en utilisant une grande matrice de TruTip des pores intégré dans 1,0 ml tube Eppendorftte conseils, une plaque ml 2 puits profond (USA Scientific), Akonni TruTip réactifs d'extraction, et la NPA comme le type d'échantillon. L'epMotion 5070 robot de manipulation de liquide peut contenir jusqu'à 8 trucs en même temps, si un protocole automatisé de référence est décrite pour 8 extractions parallèle. Toutefois, jusqu'à 24 échantillons peuvent être traités lors d'un programme unique dans une plaque échantillon de 96 puits en puits profond. Un programme de epMotion séparé est disponible (et obligatoire) afin de traiter les 16 ou 24 échantillons. Le protocole décrit ci-dessous est un exemple de script automatisé 8.

Configuration

1. Amener les échantillons naso-pharyngés à RT avant de commencer l'extraction.
2. Distribuer 100 ul aspiration du nasopharynx plus 150 pi d'eau sans nucléase dans la colonne 1 de la plaque d'échantillons (figure 2A).
3. Placer la plaque d'échantillon en position B1 sur la table de travail de epMotion (figure 2B).
4. Placez les pointes de pipette, TruTips et 30 ml creux de réactifs sur leur Worktab epMotion respectiveLE positions (figure 2B).
5. Ouvrez le logiciel Eppendorf epBlue, sélectionnez le fichier d'exécution fourni par Akonni pour 8 échantillons, et charger la méthode en cliquant sur le bouton RUN sur l'onglet RUN.
6. Sous Paramètres de capteurs de niveau, sélectionner des niveaux et des conseils, et cliquez sur le bouton RUN.
7. Entrez le volume de l'échantillon dans le logiciel et cliquez sur Exécuter.
8. Le script de epMotion demandera à l'utilisateur d'ajouter extraction et l'élution réactifs aux réservoirs de réactifs situés à la position B2 sur la table de travail. Ajouter les volumes recommandés de chaque réactif à l'auge respective. Pour 8 échantillons, les volumes de réactifs minimales sont les suivantes:

Réactif	Volume (ml)	Trough Position
Éthanol à 95%	3.5	2
Tampon de lavage D	9.0	3
Tampon de lavage E	9.0	4
Elution Buffer A2	1.3	5
Lysis et Binding Buffer D	11.0	6

9. Introduire les volumes de réactifs dans le tableau présenté par le logiciel de epMotion lors de l'invite provenant de l'étape 8 ci-dessus. La valeur d'entrée doit tenir compte de la quantité réelle de mémoire tampon distribuée par l'utilisateur dans chaque réservoir de réactif respectif, et doit être supérieur ou égal au volume minimum indiquées ci-dessus. Entrées de volume incorrecte peut entraîner des volumes incorrectes fournies par le matériel epMotion à chaque tube ou puits de la plaque de 96 puits (s).

Programme automatisé

10. Sélectionnez Exécuter pour démarrer la méthode automatisée. Le script automatisé se déplace à travers les étapes suivantes, sans intervention de l'utilisateur:
    lyse de l'échantillon et de la distribution du réactif:
    1. Distribuer 375 ul de tampon de lyse D dans la colonne 1 et mélanger pendant 10cycles (apirate + dispense = 1 cycle). Cette étape démarre le processus d'incubation de lyse tandis que les autres réactifs sont aliquotes.
    2. Distribuer 1,6 ml de tampon de lavage D dans la colonne 2.
    3. Distribuer 1,6 ml de tampon de lavage E dans la colonne 3.
    4. Distribuer 50 ul de tampon d'élution A dans la colonne 4.
    5. Pause pendant 6 minutes pour compléter les 10 min échantillon incubation dans le tampon de lyse D.
    6. Ajouter 375 ul d'éthanol à chaque puits dans la colonne 1, en mélangeant chaque échantillon avec de l'éthanol à travers 10 cycles de pipetage.
    Extraction:
    7. Chargez 8 TruTips de la position A2 sur la table de travail, et de commencer le processus d'extraction décrit dans la figure 1.
    8. Aspirer et distribuer mélange échantillon / tampon / éthanol lyse de la colonne 1 de la plaque de l'échantillon pendant sept cycles de lier l'acide nucléique à la TruTip monolithe. Bien que l'écoulement de l'échantillon à travers le TruTip variable (à cause de différences de viscosité de l'échantillon clinique), le rendement en acide nucléique pour ces échantillons a pas eut affecté par les variations de débit. Options pour améliorer l'écoulement de l'échantillon sont décrits dans la discussion.
    9. Déplacez TruTips à échantillon colonne de plaque 2, et le cycle de tampon de lavage D 5x sur le monolithe de retirer le tampon de lyse résiduelle et de la matrice de l'échantillon.
    10. Déplacez TruTips à échantillon colonne de la plaque 3, et le cycle de tampon de lavage E 5x sur le monolithe pour éliminer les protéines et d'autres contaminants de l'acide nucléique lié.
    11. Déplacer TruTips au réactif position vide du réservoir 1 (en position Worktable B2) et le cycle 80x (à une vitesse d'écoulement rapide) pour sécher le monolithe. Il est important de bien sécher le TruTip, comme solvants résiduels dans les préparations d'acides nucléiques élues auront une incidence négative sur les enzymes telles que la transcriptase inverse et l'ADN polymérase Taq.
    12. Déplacer TruTips à échantillon plaque colonne 4 et le cycle de 5x à élution tampon A. L'acide nucléique extrait et purifié est présent dans le tampon d'élution dans la colonne l'échantillon 4 puits de la plaque.
    13. Ejecter TruTips dans la poubelle de epMotion.
    14. Quand le programme est terminé, retirez manuellement la plaque d'échantillon de l'appareil et transférer l'acide nucléique purifié dans de nouveaux tubes pour le stockage à long terme ou une utilisation ultérieure. Utilisateurs epMotion avancés peuvent ajouter des instructions dans le fichier Run pour transférer des échantillons élues dans des tubes de stockage séparés ou plaques PCR, si désiré.

Le programme pour un total de 16 échantillons sera répétez les étapes 10.1 à 10.13 en utilisant des colonnes de la plaque d'échantillons 5-8. Pour le programme de 24 échantillons, les étapes 10.1 à 10.13 sont répétées 2x utilisant échantillon colonnes de plaques 5-8 et 9-12, respectivement.

2. 96 puits d'extraction de l'ADN génomique à partir de sang

A STAR robot de manipulation de liquides Hamilton est utilisé pour démontrer extraction automatique de 96 échantillons simultanément à partir de sang total. Le Hamilton STAR diffère du système de epMotion en ce qu'un chauffage en option / unité vibrante est disponible sur le pont, ce qui est important pour la digestion enzymatique de certaines cliniquesmatrices ques, tels que le sang entier. Parce que le système peut être équipé d'une tête de pipette 96 canaux, il ya une plaque de 96 puits dédié pour chacune des étapes de TruTip et réactifs.

Configuration

1. Allumez l'instrument STAR et l'ordinateur.
2. Ouvrez le logiciel de contrôle d'exécution Hamilton.
3. Ouvrez le fichier d'exécution fourni par Akonni pour 96 échantillons.
4. La place du matériel de laboratoire sur le pont de STAR comme le montre la figure 3.
5. Distribuer des réactifs dans leurs bacs correspondants (volumes représentent le minimum requis pour traiter 96 échantillons):

Réactif	Volume (ml)	Trough Position
Lysis et Binding Buffer F	75	5
Éthanol à 95%	100	6
Tampon de lavage J	175	7
LavezTampon K	175	8
Elution Buffer A2	12	9
Protéinase K (20 mg ml -1)	8	15

6. Laisser les échantillons s'équilibrer à température ambiante.

7. Placer les tubes d'échantillon dans les porte-bagages d'exemples (position de pont 4 de la figure 3). Placer l'échantillon 1 à l'arrière de la porte à l'extrême gauche et déplacer en baisse séquentielle de chaque transporteur avec l'échantillon 96 se termine dans la position avant droit.

Programme automatisé

8. Sélectionnez le bouton Lecture dans le coin supérieur gauche de la fenêtre de fichier Run et entrez le nombre d'échantillons à traiter. Le script automatisé se déplacera ensuite à travers les étapes suivantes, sans intervention de l'utilisateur:
   lyse de l'échantillon et de la distribution de réactifs
   1. Transférer 200 ul de chaque tube d'échantillon de la plaque d'incubation à la position 14 sur l'ilater / module à secousse (Figure 3).
   2. Distribuer 80 ul protéinase K dans chaque échantillon de la plaque d'incubation.
   3. Distribuer 600 ul de tampon de lyse F dans chaque puits de la plaque d'incubation.
   4. Mélanger la solution pendant 10 cycles, puis incuber pendant 20 min à 70 ° C et 500 rpm. Les 70 ° C prévue résultats de température dans une ~ 60 ° C température de l'échantillon à l'intérieur de la plaque de puits profonds, qui se situe dans la gamme d'activité protéinase K. Bien que les échantillons sont en incubation, le système de manipulation de liquide continue à fonctionner par la distribution de réactifs dans leurs assiettes et les puits correspondants:
      • 100 pi Elution Buffer A dans chaque puits de la plaque puits profond à la position 13.
      • 800 pi d'éthanol dans chaque puits de la plaque puits profond à la position 10.
      • 1,6 ml de tampon de lavage K dans chaque puits de la plaque puits profond à la position 12.
      • 1,6 ml de tampon de lavage J dans chaque puits de la plaque puits profond à la position 11.
   5. Après 20 minutes d'incubation, le mélange de l'échantillon est transférée de la plaque d'incubation de la plaque à puits profond en position 10, et on le mélange à travers 12 cycles de pipetage.
   6. Ejecter conseils de réactifs dans la poubelle.
      Extrait
      Cette partie de la procédure de sang gDNA est très similaire au protocole de la grippe epMotion, à l'exception de la composition des réactifs de lavage et les numéros de cycle. Les conseils TruTips Hamilton sont noirs, de sorte que le flux de liquide à travers le TruTip n'est pas visible.
   7. Chargez 96 TruTips de la position du pont 3.
   8. Aspiration et de distribution de l'échantillon / tampon / éthanol mélange de lyse en position 10 pour 10 cycles de lier les acides nucléiques à la TruTip monolithe.
   9. Déplacez TruTips à la position 11 et le cycle de tampon de lavage J 5x sur le monolithe de retirer le tampon de lyse résiduelle et de la matrice de l'échantillon.
   10. Déplacez TruTips à la position 12 et le cycle de tampon de lavage K 5x pour éliminer les protéines et d'autres contaminants de l'acide nucléique lié.
   11. Cycle du TruTip 40x à grande vitesse à l'air sec.
   12. Déplacez TruTips à la position 13 et le cycle 5x dans Elution Buffer A2. L'acide nucléique extrait et purifié est présent dans le tampon d'élution dans la plaque à puits profond.
   13. Ejecter TruTips dans la poubelle.

Lorsque le programme est terminé, retirez la plaque d'élution de l'appareil et transférer les échantillons prélevés dans les tubes appropriés pour le stockage ou les applications en aval.

3. Extraction d'ADN sur de grands échantillons de plasma de volume

L'instrument StarPlus Hamilton est utilisé pour démontrer un protocole automatisé pour extraire librement circuler l'ADN foetal à partir de 5 ml de plasma maternel. Le système StarPlus peut prendre en charge deux bras du canal de pipettes automatiques, une avec 8 x 5 canaux ml et une avec 8 x 1 voies ml. Ces armes peuvent fonctionner en parallèle pour le traitement échelonné en lots de 8 échantillons chacune. A 5 ml TruTip est utilisé pour le L initialextraction arge-volume, et une ml TruTip 1 est utilisé pour la séparation selon la taille et la poursuite de la concentration de l'acide nucléique extrait.

Set-up

1. Allumez l'instrument StarPlus et l'ordinateur.
2. Ouvrez le logiciel de contrôle d'exécution Hamilton.
3. Ouvrez le fichier d'exécution fourni par Akonni pour 8 grands échantillons de plasma de volume.
4. La place du matériel de laboratoire sur le pont StarPlus comme indiqué dans la Figure 4.
5. Distribuer des réactifs dans leurs réservoirs correspondants:

Réactif	Volume (ml)	Trough Position
CN-W1	17	5A
NC-W2	17	5B
CN-W4	21	5C
Protéinase K (20 mg ml -1)	5	6A
EBB	17	6B
EBA2	5	6C
NC-W3	5	6D
CN-B2	5	6E
CN-B3	5	6F
CN-L1	52	7
CN-B1	175	8

6. Laisser l'échantillon s'équilibrer à température ambiante.
7. Placer les tubes d'échantillon dans les porte-bagages d'exemples (position de pont 3 de la figure 4). Placer l'échantillon 1 à l'arrière et se déplacer de manière séquentielle vers l'avant de la plate-forme.

Programme automatisé

En raison du grand volume d'échantillon d'entrée, étapes de lyse et d'homogénéisation doivent être effectués hors de l'instrument StarPlus Hamilton dans un bain d'eau. Les étapes nécessitant l'intervention de l'utilisateur dans le protocole automatisé sont indiqués par un astérisque (*) à la beginning de la peine, et en caractères gras.

lyse de l'échantillon et de la distribution du réactif: L'échantillon est incubé avec de la protéinase K et du tampon de lyse pour homogénéiser l'échantillon et libérer l'ADN.

8. Sélectionnez le bouton Lecture dans le coin supérieur gauche de la fenêtre du fichier d'exécution. Entrée du nombre d'échantillons à traiter, la localisation de pointes de pipettes sur la plate-forme, et l'emplacement de TruTips sur le pont.
9. Le script automatisé ajoute 615 ul protéinase K, 5 ml de plasma et de 6,2 ml de tampon de lyse CN-L1 à chaque tube conique de 50 ml, et sera ensuite PAUSE.
10. * Retirer les tubes coniques de 50 ml à partir de la plate-forme de l'échantillon, vortex pendant 30 sec à haute vitesse, et incuber hors ligne pendant 30 min à 60 ° C dans un bain-marie ou du bloc chauffant. Après les tubes coniques sont retirées de la plate-forme de Hamilton, reprendre le script automatisé pour poursuivre la distribution des réactifs dans leurs plaques et des puits (figure 4B et 4C) respectives:
    • 2 ml CN-W1 à tous les autres en position 9 et colonne 1.
    • 2 ml NC-W2 à chaque autre et en position 9 colonne 2.
    • 2 ml CN-W4 à chaque autre et en position 9 colonne 3.
    • 250 EBA2 ul à chaque autre bien en position 9 colonnes 4 et 5.
    • 495 pi CN-B2 pour tous les autres bien en position 10 la colonne 1.
    • 1 ml EBB à chaque autre et en position 10 la colonne 2.
    • 500 pi CN-W3 à tous les autres bien en position 10 la colonne 3.
    • 500 pi CN-W4 à tous les autres bien en position 10 la colonne 4.
    • 50 EBA2 ul à chaque autre bien en position 10 la colonne 5.

Parce que les canaux 5 ml sont trop larges pour utiliser les puits adjacents pour chaque échantillon, le programme automatisés distribue des réactifs dans tous les puits de la plaque de puits profonds dans la position du pont 9. Le bras mécanique utilisé pour les canaux 1 ml nécessite également l'utilisation de tous les autres puits dans des plaques de réactifs pour l'exclusion et st concentrationeps du Protocole.

Après réactifs de dosage, le programme PAUSE.

11. * Après 30 min, 60 ° C incubation, placer les tubes coniques de 50 ml sur la glace pendant 5 min.
12. * Remettre les tubes coniques de 50 ml à leurs positions initiales dans le porte-bagages de l'échantillon à la position du pont 4, et de reprendre le script automatisé.
13. Ajouter 12 ml Binding Buffer CN-B1 pour chaque tube d'échantillon et mélanger 10x.

Grand Extraction Volume: 5 ml TruTips sont utilisés pour l'extraction de l'ADN total à partir de l'échantillon de plasma lysée.

14. Ramassez 5 TruTips ml de la position 2 pour l'extraction d'acide nucléique de grand volume.
15. Cycle de l'échantillon mixture15 fois dans le tube conique de 50 ml, à partir de la partie inférieure du tube et se déplaçant 3 mm supérieur après chaque cycle de pipetage. Cette étape se lie l'acide nucléique total à la TruTip monolithe.
16. Déplacez TruTips aux plaques à puits profonds à la position 6 colonne 1, et cycle 1x dans le tampon de lavage CN-W1.
17. Déplacez TruTips à la position 9 colonne 2 et le cycle 1x Wash dans CN-W2.
18. Déplacez TruTips à la position 9 colonne 3 et 2x cycle de lavage CN-W4.
19. Déplacez TruTips à la position 9 colonne 4 et le cycle de 40x à grande vitesse pour sécher matrice de liaison.
20. Déplacez TruTips à la position 9 colonne 5 et le cycle 10x pour éluer les acides nucléiques liés des 5 ml TruTips. C'est élution de grand volume n ° 1.
21. Déplacer TruTips à la colonne 6, et répéter l'étape de la deuxième fraction aliquote de tampon d'élution. C'est élution de grand volume n ° 2.
22. Transfert élution n ° 2 en position 9 colonne 5 à combiner avec élution n ° 1, et jeter les TruTips.

Exclusion et Concentration: L'ADN de haut poids moléculaire est retiré de l'échantillon extrait, et l'ADN restant est isolé et concentrées.

23. Ajouter éluant combinées de l'étape 22 à la position 10 la colonne 1 et bien mélanger 10x.
24. Relever 1 ml trutips de la position 13 et le cycle 20x pour lier l'ADN de haut poids moléculaire pour le monolithe.
25. Déplacez les TruTips à positionner 10 2 de la colonne et le cycle 5x pour rincer la pointe et éliminer l'ADN de haut poids moléculaire. Les TruTips sont conservées et replacées dans le rack de pointe à la position 13.
26. Avec des conseils de réactifs de position 12, ajouter 575 ul de tampon de liaison CN-B3 à l'échantillon en position 10 la colonne 1 et mélanger 10x.
27. Ramassez les TruTips de l'étape 25, retour à la position 10 la colonne 1 et le cycle 20x pour lier l'ADN reste de l'échantillon à la TruTip ml 1.
28. Déplacez TruTips à positionner 10 la colonne 4 et le cycle 1x Wash dans CN-W3 pour éliminer les inhibiteurs restants.
29. Déplacez les TruTips à positionner 10 la colonne 5 et le cycle 1x Wash dans CN-W4 pour rincer les sels résiduels de CN-W3.
30. Levez TruTips sur la position 10 la colonne 5 et l'air de faire défiler les conseils 35x pour sécher le monolithe.
31. Déplacez TruTips pour positionner la colonne 6 et 10 cycles 10x dans EBA2 pour éluer le purifiée, taille-sélectionTed et acide nucléique concentré.
32. Jeter TruTips.
33. Transférer l'échantillon élué de la colonne 6 tubes de 1,5 ml en position 11. Les échantillons extraits sont prêts pour le stockage ou la transformation en aval.

Résultats

Données de la PCR en temps réel pour la grippe extraction d'ARN à partir de NPA sont présentés dans la figure 5A. Estimation de l'efficacité d'extraction d'acide nucléique est comparable aux résultats obtenus avec la version manuelle du protocole ^15. Une réponse linéaire en moyenne les valeurs de C _T est observé entre 10 ⁴ et 10 ⁶ gène copies ml ^-1 modifié la grippe (R ₂ = 0,99 et 0,98 pour la grippe A et B, respectivement), avec des écarts types de la moyenne C _t valeurs inférieures à 1 cycle. L'absence de contamination croisée avec le système epMotion est démontré dans la figure 5B, où 12 échantillons positifs NPA contenant 10 ⁶ gène copies ml ^-1 NPA étaient entrecoupées de 12 espaces de mémoire tampon. La moyenne C _t pour les contrôles positifs était 30,16 ± 0,14, et tous les espaces tampons étaient négatifs. La durée totale du traitement de l'échantillon est de 16, 28 et 40 min pour 8, 16 et 24 échantillons, respectivement.Parce que une aspiration du nasopharynx clinique typique ou un tampon contiendra 10 ⁷ gène copies ml ^-1 (en supposant que 1000 virions par DICT ₅₀ ¹⁶ et> 10 ⁴ DICT ₅₀ ml ^-1 grippe ^17), est prévu au protocole de epMotion automatisé pour être efficace sur la majorité des spécimens NPA cliniques.

Compte tenu de la gamme de tests moléculaires effectuées sur l'ADN génomique humain, l'objectif principal de l'extraction des acides nucléiques à partir de sang total est de produire de l'ADN génomique contaminant sans poids moléculaire élevé. Le protocole automatisé de 96 échantillons est terminée en 1 heure, ce qui est une amélioration par rapport à d'autres systèmes automatisés (par exemple Promega MagneSil = 90 min et Qiagen QIAamp DNA sang BioRobot système MDx = 2,5 h). Figure 6A montre les profils d'absorbance UV / VIS 45 échantillons sanguins positifs traités simultanément avec 45 blancs de réactifs sur le protocole Hamilton STAR, avec une moyenne A _{260/280 ratio de 1,96 et moyenne un ratio 260/230 de 1,93. Un A 260/280 rapport entre 1,7-2,0 et un ratio 260/230> 1.7 indiquent en général des ADN très pur, exempt de sels résiduels, des protéines ou des solvants, et acceptable pour les applications moléculaires plus en aval. Le gel à 1% d'agarose dans la figure 6B montre que le résultant d'ADNg est de poids moléculaire élevé (> 24 kb), avec un minimum de cisaillement. Le rendement de l'acide nucléique moyenne de l'ensemble des 45 échantillons positifs est de 5,26 ± 0,46 pg d'ADN humain par 200 pi de sang total, basé sur les technologies Quantifiler Kit de quantification de l'ADN Human Life. Études de contamination croisée similaires à ceux de la figure 5B ont été réalisées avec contrôle négatif blancs tampons entrecoupées avec les échantillons positifs et extrait en parallèle, tous les blancs étaient de nouveau négatif par PCR (non représenté). La purifié gDNA convient également pour de nombreuses autres analyses basées sur la PCR (non représenté).}

Résultats en temps réel de huit réplicats d'un échantillon de plasma maternel commun traitées avec la procédure de TruTip grand volume sont présentés dans la figure 7. Le protocole complet (y compris hors ligne protéinase K incubation) est terminée en environ 2,5 heures, semblable au manuel Qiagen circulation Kit d'acides nucléiques (pas de kits d'extraction automatisés comparables sont encore disponibles). Les valeurs moyennes C _t sur ​​toutes les répétitions sont 34,58 ± 0,66 et 29,76 ± 0,50 pour les hommes fœtale (CHY) et l'ADN total (CH1), respectivement, ce qui démontre une excellente reproductibilité de la méthode d'extraction automatique. La concentration de l'ADN fœtal dans le pool total de l'ADN (en équivalents génomiques), est calculée sur la base ajustement comparaison de l'analyse des points aux normes, à la moyenne% d'ADN fœtal résultant dans tous les échantillons de 2,8%. L'ADN fœtal réelle% de cet échantillon est inconnu parce que les échantillons ont été regroupés avant d'effectuer l'extraction. Composition de l'ADN fœtaléchantillons de plasma en non-regroupées extraites en utilisant la méthode de TruTip sont généralement 1,5 fois plus élevé par rapport aux résultats obtenus avec un kit d'acides nucléiques circulant Qiagen (non représenté).

Figure 1. Le procédé d'extraction de TruTip et le flux de travail, indépendamment du système de manipulation de liquide. Autre préparation de l'échantillon ou des étapes de manipulation de liquides peuvent être incorporés dans des routines automatiques en fonction des capacités de l'instrument spécifique de traitement des liquides et des logiciels.

Figure 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 échantillon disposition de la plaque. (B) Arrangement de réactifs / Consumables sur la table de travail. la plaque d'échantillons peuvent être configurés pour un maximum de 24 échantillons (colonnes 1, 5 et 9, respectivement), bien que le epMotion ne traitera un maximum de 8 échantillons simultanément. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Plan de pont Hamilton STAR pour la purification d'ADN génomique à partir de sang total (pas à l'échelle) Pont Position 1 = Hamilton 1 ml des conseils filtré;. 2 = Hamilton 1 ml conseils non-filtré; 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 TruTips mm; 4 = Entrée porte-échantillons de sang (tubes de prélèvement de sang ou des microtubes); 5-9 = 290 ml creux de réactifs pour Lysis Buffer F, l'éthanol, le tampon de lavage J, tampon de lavage K et Elution Buffer A2, respectivement, 10 = 96 dEEP plaque bien reliure; 11 = 96 puits profond Laver J; 12 = 96 puits profond Laver K; 13 = 96 plaque d'élution puits profond; 14 = Hamilton HHS2 chauffage / shaker avec Nunc 96 plaque d'incubation puits profond; 15 = 50 ml de réactif creux contenant de la protéinase K. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4. Hamilton plan de pont StarPlus pour purifier l'ADN de grands échantillons de plasma de volume (pas à l'échelle). Le système est équipé de 8 x 5 canaux ml et 8 canaux x 1 ml (non représenté sur le plan de pont). Pont Position 1 = Hamilton 4 ml des conseils filtré; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips, 3 = échantillons de plasma de source; 4 = 50 ml tubes coniques; 5 = 120 creux de réactifs ml contenant CN-W1, NC-W2 et CN-W4 reagents; 6 = creux de réactifs à faible volume contenant de la protéinase K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB et CN-W3 réactifs; 7 = 290 ml creux de réactif contenant réactif CN-L1; 8 = 290 ml de réactif bac contenant CN -B1 réactif; 9 = 96 plaques à puits profonds pour l'étape 1, 10 = 96 assiettes creuses et pour l'étape 2, 11 = transporteurs de l'échantillon pour purifié, produit final; 12 = Hamilton 1 ml conseils non filtrés, 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5. (A). Résultats de la PCR en temps réel provenant de l'extraction de TruTip automatisé des virus de la grippe ajoutés dans aspiration du nasopharynx (NPA). Le volume NPA entrée = 100 pi, le volume d'élution = 50 pi. Résultats sont la moyenne de 3 e répétitionxtractions de 5 milieux NPA distincts (n = 15) par niveau de dilution et la cible de la grippe. qPCR a été effectuée sur le système LightCycler 480 avec des conditions d'essai décrites précédemment ^15. (B) Pas de contamination croisée est détectée lorsque 12 échantillons NPA positifs sont entrecoupées de contrôles sans matrice et soumis à la procédure d'extraction automatisé. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6. Résultats de l'extraction de l'ADN génomique humain à partir de sang total a.) Traces UV-visible à partir de 1000 NanoDrop (ThermoFisher) de 10 choisis au hasard répétitions. B) gel à 1% d'agarose de TruTip purifié gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Les pistes 1 - 4 = ~ 100 ng purifié gDNA de quatre choisis au hasard répétitions. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 7. Résultats de la PCR en temps réel de huit extractions TruTip répétition de circuler librement ADN du plasma. Échantillons indiqués par des astérisques (* ou **) ont été extraits à des jours différents. CHY quantifie l'ADN fœtal masculin et CH1 quantifie l'ADN total actuel (maternelle et fœtale). qPCR a été effectuée sur un système LightCycler 480 (Roche) avec des essais publiés précédemment ciblant CHY et CH1 ^18.

Discussion

La simplicité du concept de TruTip et de workflow (Figure 1) rendre facilement adapté, automatisé et efficace pour un certain nombre de matrices d'échantillons cliniques, les volumes d'échantillon d'entrée et les systèmes de manipulation de liquides. Il faut reconnaître, cependant, que chaque échantillon clinique est unique et varie d'un à l'autre de la viscosité, les particules, le mucus, les contaminants de surface, de microbes et / ou fonds génétiques humaines. Compte tenu des variations attendues dans la composition de l'échantillon clinique et des usages prévus d'un protocole de préparation des échantillons de TruTip automatisé, il peut donc être nécessaire de modifier certaines étapes d'une procédure de TruTip afin d'atteindre les résultats souhaités pour un type d'échantillon spécifique. Quel que soit le type d'échantillon, cependant, les paramètres TruTip qui ont généralement le plus d'impact sur la pureté de l'acide nucléique et / ou de récupération sont les suivants:

1. Exemple de mélange et d'homogénéisation avec un tampon de lyse (et l'alcool). Bien TruTips ont un relativement grande taille des pores, l'homogénéisation et la liquéfaction est très important pour la lyse cellulaire efficace, et des mesures contraignantes ultérieurs à la TruTip monolithe. Avec un lysat homogène et bien liquéfié, les échantillons peuvent se déplacer à travers le TruTip avec des débits plus élevés, ce qui réduit le temps global de traitement des échantillons. Le protocole plasma grand Volume démontre le potentiel pour les utilisateurs d'homogénéiser et de fluidifier les échantillons difficiles (en ligne ou hors ligne), malgré le grand volume d'échantillon d'entrée.
2. débits. des débits plus lents lors de la fixation de l'acide nucléique ou élution entraînent généralement des rendements plus élevés d'acides nucléiques, même si c'est au détriment du temps de traitement total. Des débits plus lents peuvent également réduire l'ampleur de cisaillement de l'ADN.
3. nombre de cycles. Le nombre optimal d'aspiration et de distribuer des cycles dépend du type d'échantillon, le volume total de l'échantillon et des débits. Étape 1 sur la figure 1 est typiquement le point auquel numbe de cyclers (et débits) peut nécessiter une optimisation empirique, avec des échantillons comme aspiration du nasopharynx (figure 5) représente l'une des lysats plus difficiles à optimiser en raison de la gamme des viscosités NPA de différents patients.
4. Séchage. Séchage complet du TruTip monolithe est impératif d'éviter les solvants organiques résiduelles de co-élution avec l'échantillon purifié d'acide nucléique et des procédés en aval inhiber ou de tests. Parce TruTip n'est pas séché par centrifugation ou filtration sous vide, il est important d'optimiser à la fois le débit et le nombre de cycles au cours de l'étape de séchage. Parfois, il ya une goutte résiduelle de solution de lavage sur le terminus du TruTip après les cycles de séchage sont terminées. Le Hamilton robot a la capacité d'accomplir une "pointe contact" sur le côté du puits pour libérer la goutte, assurant ainsi une élution sans solvant. Le système de epMotion n'a pas cette fonctionnalité, mais un pré-rinçage du terminus de TruTip en eltampon ution peut être programmé pour obtenir le même effet.

En raison de la géométrie, la matière de la pointe de pipette, et un procédé de fixation sur les bras robotiques de canal sont propres à chaque constructeur de l'appareil, une construction d'TruTip différente est nécessaire pour chaque système de manipulation de liquides. Les dimensions du monolithe TruTip (diamètre, l'épaisseur et la taille des pores) ne sont en corrélation avec la capacité de liaison des acides nucléiques (et l'efficacité d'élution), comme il est prévu pour une technique d'extraction en phase solide. Alors épaisses (> 4 mm) matrices peuvent être intégrées dans un TruTip 1 ml d'augmenter la capacité de liaison de l'acide nucléique pour les échantillons de grand volume et / ou égaliser la capacité de liaison à travers des formats de TruTip spécifiques, il existe un compromis entre l'épaisseur de TruTip et des débits au cours de l'étape de liaison initial (en présence de lysats bruts). Ainsi, il est parfois avantageux d'incorporer des monolithes de plus grand diamètre en grand volume des embouts de pipette pour les étapes initiales d'un protocole automatisé (par exemple </ Em> les 5 ml Hamilton / Akonni TruTips pour les extractions de grand volume). Étant donné les configurations de TruTip spécifiques dictées par les fabricants de robots de manipulation des liquides, cependant, nous ne nous attendons pas nécessairement le rendement des acides nucléiques TruTip soient identiques sur toutes les plateformes de manipulation de liquides de différents fabricants, ou à travers différentes tailles de TruTip.

Les échantillons cliniques (par définition) contiennent des quantités importantes d'ADN génomique humain, sauf s'ils sont acquis à partir de sites normalement stériles (par exemple liquide céphalo-rachidien). Parfois, l'ADN génomique humain est souhaitée (voir Figure 6), tandis que dans d'autres applications de l'ADN humain représente un fond de génomique indésirable (comme pour la figure 5). La présence de l'ADN de fond est en général pas un problème dans la mesure où la quantité totale d'acide nucléique dans l'échantillon ne dépasse pas la capacité de liaison du monolithe, et l'ADN de fond, peut servir de support si l'acide nucléique cible souhaitéel'acide est présent à l'état de traces. L'objectif du protocole d'extraction de plasma à haut volume (figure 7) est d'isoler (fragmenté) ADN foetal en présence d'un excès d'un facteur 10 à 20 de l'ADN de la mère, qui est similaire à l'objectif de préparation d'échantillons de tests de maladies infectieuses, sauf que les séquences sont très congruent et ne se distinguent que par des tests moléculaires très spécifiques et / ou discrimination de taille. Dans ce cas, l'ADN circulant total est isolé à l'aide d'un ml TruTip 5, et l'ADN fœtal ultérieure poids moléculaire élevé et de faible poids moléculaire sont séparés par la suite liaison et d'élution à un ml TruTip 1 en modifiant les conditions de tampon de liaison. Séparation granulométrique sélective et l'enrichissement des acides nucléiques cibles en fonction de leur liaison et les propriétés d'élution à un monolithe de silice est un mode d'action différent de manière significative que celui obtenu par des membranes ou des colonnes de spin d'exclusion de taille. séparation des tailles et l'enrichissement de l'ADN microbien à partir d'ADN génomique humain peut être unccomplished dans de futures applications via la personnalisation de liaison TruTip et tampons d'élution.

Les protocoles automatisés démontré ici l'accent sur l'utilité de la TruTip monolithe lui-même pour le traitement des échantillons cliniques différents, et comment il peut être adapté pour les gros volumes et les robots de manipulation de liquides spécifiques. Les méthodes simplifiées entraînent généralement des protocoles d'extraction plus rapide par rapport à d'autres systèmes automatisés. La simplicité de la technologie de TruTip, cependant, offre aussi certains avantages de coûts pour ceux qui s'intéressent à l'achat d'un nouveau système de purification des acides nucléiques automatisé, parce que le matériel primaire nécessaire pour l'automatisation des procédures TruTip est le bras pipette de canal lui-même plutôt que de barres magnétiques, systèmes de vide ou centrifugeuses à bord. Utilisant plaques de réactifs pré-remplies peuvent également réduire l'espace et consommables nécessaires, et de doubler le débit par course. Minimiser l'espace de pont avec les protocoles TruTip permet également aux utilisateurs avancés d'intégrer en amont ou en dprocessus automatisés ownstream avec le TruTip. Par exemple la solution de easyBlood de Hamilton à fractionner le sang total peut être incorporé à la méthode d'extraction de TruTip automatisé, ce qui permettrait de rationaliser considérablement les processus bio-banque. Processus post-extraction telles que la quantification des acides nucléiques, la normalisation, la PCR set-up, ou séquençage de l'ADN sont également facilement intégrés avec TruTip sur les plates-formes de manutention de liquides importants.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-11120
95% Ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
99% Acetone	Sigma-Aldrich	270725-4L
DEPC-treated water	Life Technologies	AM9906
Reagent Reservoir, 30 ml	Eppendorf	960050100
Deep well plate 96/2,000 μl	USA Scientific	30502302
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl	Eppendorf	960050100
			Equipment
epMotion 5070 System	Eppendorf	5070 000.000
Dispensing tool TM1000-8		960001061
Reservoir rack		960002148
			Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA.
			Reagent/Material
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	300-20341
95% ethanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC615110040
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235905
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack	Hamilton Robotics, Inc.	235904
50 ml Reagent Trough	Hamilton Robotics, Inc.	187297
Deep Well 2 ml plate	USA Scientific	1896-2800
Nunc 96 DWP-2 ml	Thermofisher	27874
Reagent Trough	Fisher	14-222-412
			Equipment
Hamilton STAR System	Hamilton Robotics, Inc.	173027
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173050
1 ml 96-channel head	Hamilton Robotics, Inc.	199090
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
Sample Carriers/Inserts	Hamilton Robotics, Inc.	173400/182238
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
HHS2 Heater Shaker Unit	Hamilton Robotics, Inc.	199033
Rack Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188047
			Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood.
			Reagent/Material
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips)	Akonni Biosystems, Inc.	Call to inquire
100% ethanol	Sigma-Aldrich	459828-1L
Isopropanol	Acros Organics/ThermoFisher Scientific	AC327270010
Proteinase K	AMRESCO LLC	E195
Filtered 4 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	184022
Unfiltered 1 ml Tips	Hamilton Robotics, Inc.	235939
96-Deep Well Plates	USA Scientific	1896-2800
50 ml Conical Tubes	Corning/ThermoFisher Scientific	05-526B
50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	187297
120 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	182703
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs	ThermoFisher Scientific	14-222-412
			Equipment
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module	Hamilton Robotics, Inc.	173025/190012
1 ml Independent Pipette Channels / Arm	Hamilton Robotics, Inc.	173081/173052
5 ml Independent Channel / Modular Arm	Hamilton Robotics, Inc.	184090/173050
Plate Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182090
Multiflex Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	188039
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs	Hamilton Robotics, Inc.	188047
120 ml Reagent trough carrier	Hamilton Robotics, Inc.	185290
Tip Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182085
50 ml Tube Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	182245
24 Position Sample Carriers	Hamilton Robotics, Inc.	173400
32 Position Sample Carrier	Hamilton Robotics, Inc.	173410
			Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma.