Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Zusammenfassung

Wir verwenden hier retrovirale Transduktion und Transfektion konkatemeren eine Zelllinie, die die Komponenten eines lentiviralen Vektors (LV) in der Abwesenheit von Tetracyclin Ausdruck zu erstellen. Das LV kodiert GFP und mit einem Glykoprotein, SVGmu, die spezifisch für einen Rezeptor auf dendritischen Zellen pseudotypisiert.

Zusammenfassung

Lentiviralen Vektoren (LVs) sind ein mächtiges Mittel zur Bereitstellung von genetischem Material, viele Arten von Zellen. Wegen Sicherheitsbedenken mit diesen HIV-1 abgeleiteten Vektoren verbunden sind, große Mengen von LVs ist eine Herausforderung. In diesem Beitrag berichten wir über ein Verfahren zur Herstellung hohe Titer von Selbst-inaktivierende LVs. Wir retroviral transduzieren das tet-off stabilen Erzeuger-Zellinie GPR eine Zelllinie, GPRS, die alle viralen Komponenten, einschließlich einer dendritische Zellen spezifische Glykoprotein SVGmu Ausdruck erzeugen kann. Dann verwenden wir konkatemeren DNA Transfektion zur Transfektion der LV Transferplasmid Codierung ein Reportergen GFP in Kombination mit einem Selektionsmarker. Einige der resultierenden Klone können LV mit einem Titer 10-fach größer als das, was mit der transienten Transfektion erreichen erzeugen. Außerdem diese Viren effizient transduzieren dendritischen Zellen in vitro und erzeugen eine starke T-Zell-Immunantwort zu unserem Reporter-Antigen. Diese Methode kann eine gute Option sein, for Herstellung starke LV-basierte Impfstoffe für klinische Studien von Krebs oder Infektionskrankheiten.

Einleitung

Viele Vektor-Systeme für den Gentransfer entwickelt worden. Vektoren auf Basis von Lentiviren haben unter den am häufigsten untersuchten viralen System gewesen. Diese Vektoren sind vorteilhaft, weil sie effizient Transduktion sowohl sich teilende und nicht teilende Zellen ^1, eine langfristige Expression durch die Integration in das Wirtsgenom, weisen eine geringe natürliche Anti-Vektor-Immunität in den meisten menschlichen Populationen ² und haben ein geringes Potenzial für Genotoxizität von Insertionsmutagenese ^3,4.

Produktion von Lentiviren wurde stets von Sicherheitsbedenken wurde gefärbt. Lentivirale Vektoren sind in der Regel von HIV-1, dem Erreger von AIDS abgeleitet. Die transiente Transfektion von einzelnen Komponenten des lentivector (Transfer, Umschlag und Verpackung Plasmide) ist eine häufige und flexible Mittel zur Bereitstellung von genetischem Material in Labor-Einstellungen. Allerdings ist Scaling-up transienten Transfektionen für klinische Anwendungen schwerfällig und may für die Entwicklung von Replikations-kompetente lentivirus ^5,6 führen. Um diese Hürden zu überwinden, wurden mehrere stabile Verpackung und Produzent Zelllinien ^6-11 entwickelt. Eine dieser Linien, die GPR Verpackungslinie ^11, hat den Vorteil, dass sie attraktiv durch Tetracyclin reguliert. In diesem Beitrag zeigen wir, wie man dieses System anzupassen, um selbst-inaktivierenden lentiviralen Vektoren, die speziell auf dendritische Zellen (DC-LVs) ¹² sind gezielt zu erzeugen.

Dendritische Zellen (DCs) sind die robust Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems. Sie haben das Thema von großem Interesse in der Krebs-Impfstoff-Entwicklung, weil sie direkt initiieren, Programm und regulieren Tumor-spezifische Immunantworten ^13. Die Aufnahme einer Impfung Protokoll gehören DCs hat das Potenzial, eine stärkere Immunantwort als Antitumor-Peptid oder DNA-Impfstoffe zu entlocken. Vor kurzem haben wir einen lentiviralen Vektor entwickelt, specifically zielt dendritischen Zellen durch eine modifizierte Sindbisvirus Glykoprotein, SVGmu ^14. Diese Vektoren sind einzigartig, weil sie eine hohe Spezifität für dendritische Zellen zeigen und erzeugen stärkere Immunantwort als unspezifische, VSVg-pseudotypisierten Vektoren.

Hier berichten wir über ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen dieser DC-bezogene lentiviralen Vektoren. Wir zeigen, dass diese DC-LVs können DCs infizieren und erzeugen starke CD8 ⁺ T-Zell-Immunantwort. Alle Verfahren, die Tiere wurden artgerecht, unter Zustimmung des USC Intitutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. Um in vivo und klinische Versuche durchzuführen, ist es wichtig, eine Zelllinie, die Viren mit einer hohen Titer produzieren zu erstellen. Die Durchführung der Transduktion und Transfektion Schritte genau wie beschrieben maximiert die Chancen der Erzeugung eines solchen Klons.

Protokoll

DC-LV stabileres Zellen werden auf der Grundlage der GPR Verpackungs-Zelllinie ^11, die die notwendigen Komponenten lentiviralen GagPol, rev und das Tet-Off-System enthält konstruiert. Zuerst wird retrovirale Transduktion verwendet, um eine GPRS Verpackungs-Zelllinie, die eine tet-abhängigen SVGmu Glykoprotein kodiert erzeugen. Dann wird Konkatemers Array Transfektion verwendet, um das GPRS-Zelllinie mit einem lentiviralen Vektor Transgen wie GFP transfiziert. Diese stabilen Erzeuger-Zellinie, wie LV-mGFP bezeichnet, können in vitro und in vivo auf ihre Fähigkeit, eine DC-LV Impfstoff gegen GFP erzeugen getestet werden.

1. Generieren eines Tet-abhängigen SVGmu Zelllinie

Plasmid PRX-SVGmu ist ein Konstrukt, in dem DC-spezifische Glykoprotein SVGmu stromabwärts des tTA-advanced-Promotor von retroviralen Plasmid pRetroX-Tet-off ¹ (Abbildung 1C) geklont. Kultur 293T-Zellen in D10 (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin). Kultur GPR Verpackungs-Zelllinie in D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 pg / ml). Alle Zellen werden in einem befeuchteten 37 ° C-Inkubator mit 5% CO ₂ kultiviert.

1. 16-18 Std. vor transienten Transfektion Platte 2 × 10 ⁶ 293T-Zellen in 4 ml D10 in einer 6-cm Zellkulturschalen so dass die Zellen 90% Konfluenz nähern zum Zeitpunkt der Transfektion.
2. Transfektion von retroviralen Plasmide: mix 100 ul 1,25 M CaCl _2-Lösung, steril Milli-Q-Wasser und die folgenden Plasmide: 5 ug PRX-SVGmu, 2,5 ug pgag-Pol, 2,5 ug pVSV-G. Das Endvolumen beträgt 500 ul. Zu einem 5 ml Polystyrol mit rundem Boden Rohr, 500 ul 2X HBS (50 mM HEPES, 10 mM KCl, 12 mM Dextrose, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, pH 7,05). In das Plasmid Mischung tropfenweise in die 2X HBS-Puffer während sprudelnden den Puffer kräftig mit einem Glas Pasteur Pipette. Nach dem Hinzufügen der mixture weiterhin sprudeln für weitere 30 sec. Dann fügen Sie die gesamte Mischung auf die 293T-Zellen in 6-cm Kulturschale und Inkubation bei 37 ° C
3. 4 Stunden nach der Transfektion sorgfältig ersetzen das Medium in der Kulturschale mit 4 ml vorgewärmten D10.
4. Spin-Infektion: 48 Stunden nach der Transfektion Ernte SVGmu kodierende retrovirale Partikel im Überstand, indem der Überstand durch ein 0,45-um-Filter. Teller die GPR Verpackung Zellen in einer 24-Well-Platte mit 2 x 10 ⁴ Zellen / well. In abfiltrierten Überstands GPR Verpackungszellen in der Schale (2 ml / Vertiefung) und Zentrifuge Zellen für 90 min bei 1050 × g und 25 ° C. Ändern Medium in frischen D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) nach Spin-Infektion (2 ml / well).
5. 72 Stunden nach der Transfektion, erweitern Sie die Kultur der transduzierten Zellen in Verpackungen D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 ng / ml).
6. Um die Expression von SVGmu, Kultur die Zellen ohne Doxycyclin für 48 Stunden bestätigen. Messen Oberfläche expression von SVGmu mit Durchflusszytometrie unter Verwendung anti-Sindbis Serum. Diese Zellen werden als GPRS Verpackungs-Zelllinie bezeichnet.

2. Construct DC-LV Producer-Zellen durch Transfektion Concatemer Array

Lentivirale Transferplasmid TL20-GFP ist ein selbst-inaktivierenden lentiviralen Transfer Vektorplasmid basierend auf pCL20c-MSCV-GFP mit einer Dox-regulierbaren virale RNA-Genom Ausdruck und Austausch des Cytomegalovirus (CMV)-Enhancer mit 7 tet-Operatoren (1C) ^{11 , 12,15.} Plasmid PGK-ble ist ein beständig Bleomycin (BLE) Kassette durch eine schwache PGK-Promotor ² angetrieben.

1. Digest 20 ug Plasmid TL20-GFP mit dem Restriktionsenzym SfiI bei 50 ° C Digest 20 ug Plasmid PGK-ble mit PflMI bei 37 ° C
2. Reinigen der DNA-Fragmente (die PGK-ble Kassette ist 1011 bp und der Vektor TL20-GFP ist 6861 bp) durch Agarosegelelektrophorese.
3. Ligieren die TL20-GFP-Vektor und PGK-BLE Kassette in einem Molverhältnis von 25:1 (NEB T4 DNA Ligase). Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur.
4. Nachdem über Nacht Ligation reinigen DNA aus dem Ligationsansatz (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit). Sicherstellen, dass die Menge des gereinigten DNA ist etwa 5 ug.
5. 16-18 Stunden vor der Transfektion Platte GPRS Verpackungszellen in einer 6-cm Zellkulturschalen, dass die Konfluenz werden etwa 90% zum Zeitpunkt der Transfektion.
6. Verwendung der Calciumphosphat-Transfektion Verfahren in Schritt 1.2 bis 5 ug des gereinigten konkatemeren DNA in die Verpackungszellen GPRS in 6-cm Zellkulturschalen zu transfizieren. 4 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie vorsichtig das Medium und ersetzen mit 4 ml vorgewärmten D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml).
7. 48 Stunden nach der Transfektion ändern das Medium in D10 mit Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 pg / ml). Wählen Sie für transfizierte Klone durch Zugabe von Zeocin (50 ug / ml) in dem Kulturmedium. Kultur die Zellen für ca. 2 Wochen bis Zelle colonies können an der Unterseite des Geschirrs zu sehen.
8. Beschriften Sie die Zelle Kolonien an der Unterseite des Geschirrs. Nehmen Sie 24-well Zellkulturschalen, die Anzahl der Brunnen, und fügen Sie in jede Vertiefung 2 ml D10 mit Zeocin (50 ug / ml), Doxycyclin (1 ng / ml), und Puromycin (2 pg / ml). Saugen Sie das Medium der transduzierten Zellen, dann einen Tropfen Trypsin auf jede der Kolonien für weniger als eine Minute. Dann fügen Sie eine oder mehrere Tropfen D10 auf den gleichen Kolonien. Pick up Kolonien eine nach der anderen mit einer Pipette und übertragen Sie sie in separate Vertiefungen der 24-Well-Platte Gewebekulturen.
9. Kultur und erweitere alle Zellklone in D10 mit Zeocin (50 ug / ml), Doxycyclin (1 ng / ml) und Puromycin (2 pg / ml) für die Bewertung der viralen Fähigkeit zur Produktion.

3. Bewerten Viral Produktion jeder Zelle Clone

1. Trypsinize die Produzenten-Zellen und Platte um 4x10 ⁶ Zellen in 6-cm Gewebekulturschale in D10 ohne Doxycyclin, so dass die Konfluenz90% übersteigt. Ersetzen Sie das Medium durch frisches vorgewärmte D10 täglich zu sammeln und das Medium für den Titer-Test 72 Stunden nach dem Entfernen dox.
2. Ernte der viralen Überstand durch Filtration des Mediums mit einem 0,45-um-Filter.
3. Teller Zielzellen exprimieren den Rezeptor DC-SIGN (zB 293T.hDC-SIGN oder Knochenmark der Maus abgeleitet dendritischen Zellen ¹⁶⁾ und 293T als negative Kontrolle in 96-Well-Kulturschalen, 1 x 10 ⁴ Zellen / well. In 2-fach serielle Verdünnungen des viralen Überstand in die Vertiefungen (100 ul / well). Üblicherweise werden 6-8 Verdünnungen ausreicht, um den Bereich, in dem GFP-positiven Zellen in einer linearen Beziehung zu der Menge an Virus hinzugefügt transduziert erreichen.
4. Zentrifuge Zellen und ersetzen Sie das Medium wie in Schritt 1.4 beschrieben. BMDCs sollte in RPMI-Medium mit 10% FBS und GM-CSF (1:20 J558L konditioniertes Medium) kultiviert werden.
5. Messen Sie die GFP-Expression in Zellen mittels Durchflusszytometrie 4-6 Tage nach der Transduktion transduzierten. Lentivirales vector-Titer in den Vektor Verdünnungsbereich berechnet, wenn der Prozentsatz von GFP-positiven Zellen und Vektor Betrag in einer linearen Beziehung stehen. Wählen Sie die Zell-Klon mit der höchsten Produktion viraler für spätere Anwendungen.

4. Produzieren und Konzentrat Lentivirusvektoren

1. Kultur der Produzent Zelllinie (LV-mGFP) in 15-cm-Zellkulturschalen.
2. Trypsinize die Produzenten-Zellen und Zellen Platte in 15-cm-Zellkulturschalen bei mehr als 90% Konfluenz in frischen D10 ohne Doxycyclin. Ändern Medium mit frischem, vorgewärmten D10 täglich.
3. Zum Zeitpunkt des Peak virale Produktion (vom Anwender bestimmt), ernten die virale Überstand und filtern es mit einem 0,45-um-Filter. Laden Sie die gefilterten Überstand in dickwandigen 32,5 ml Ultrazentrifugenröhrchen, mit Parafilm versiegeln und Zentrifuge bei 50.000 xg, 4 ° C für 90 min. Gründlich das Pellet in 50 ul oder einem geeigneten Volumen PBS oder HBSS abhängig von der Anwendung.

5. Impfen Mäuse in vivo und Analysieren Antigen-spezifische Immunantwort

1. Produzieren mit hohem Titer-Virus, wie in Kapitel 4 beschrieben.
2. Spritzen BALB / c-Mäuse (6-8 Wochen alt, weiblich) über einen Wegelagerer Route mit dem Vektor Suspension (25 ul pro Fußballen).
3. 2 Wochen nach der Immunisierung isolieren Milz und Ernte Splenozyten. Kultur Splenozyten mit GFP-Epitop-Peptide und Analyse der Gegenwart von GFP-spezifische CD8 ⁺ T-Zellen mit intrazellulärem Zytokinfärbung, wie zuvor ¹⁷ (3B) beschrieben.

Ergebnisse

Die stabile Zelllinie in diesem Verfahren beschriebenen können große Mengen von lentiviralen Vektoren, die spezifisch an dendritischen Zellen ausgerichtet sind. Wie in 1B gezeigt, ergab Isolierung einzelner Klone stabiler Zelllinien unterschiedlicher Qualität ^12. Unter 26 getesteten Klonen erzeugt 8 lentivirale Partikel mit einem Titer von mehr als 10 ⁶ Transduktion Einheiten pro ml (TU / ml), die ein typisches Benchmark für SVG-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren durch tra...

Diskussion

Hier haben wir ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von lentiviralen Vektoren mit 293T-Zellen, die stabil transduzierten mit allen lentiviralen Komponenten unter der tet off Regelungssystem beschrieben. Bisher stützen sich die meisten Protokolle lentiviralen Vektoren zu erzeugen auf Standard-Calciumphosphat transiente Transfektion (siehe ^18, beispielsweise). Dieser Ansatz ist erfolgreich auf einem klinischen Maßstab, aber es kann von einigen Einschränkungen nicht vorhanden sein können bei der Ausw...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Mediatech Inc.	10-013-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Mediatech Inc.	25-005-Cl
Doxycycline	Clontech Laboratories, Inc.	631311
Zeocin	Invitrogen	R250-01	Toxic
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506