MTT deneyi ile sentez ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi: Anticancer Metal Kompleksleri

Özet

Havaya duyarlı bir titanyum ve vanadyum anti-kanser ajanlarının sentezi için bir yöntem olup, MTT testi ile insan kanser hücre çizgisi karşı sitotoksik aktivitenin değerlendirilmesi ile birlikte tarif edilmiştir.

Özet

Titanyum (IV) ve vanadyum (V) komplekslerinin yüksek ölçüde kuvvetli anti-kanser ajanlardır. Bunların sentezinde bir meydan okuma hidrolitik kararsızlık anlamına gelir, bu nedenle bunların hazırlanması bir inert atmosfer altında yapılmalıdır. Bu komplekslerin Antikanser aktivitesinin değerlendirilmesi MTT deneyi ile elde edilebilir.

MTT deneyi, bu canlı hücreler maruz kaldığı zaman formazan MTT molekülün enzimatik azalma dayanan kolorimetrik canlılık deneyidir. Indirgeme sonucu, MTT molekülünün bir renk değişimdir. Bir kontrole göre emme ölçümleri bileşik, anti-kanser aktivitesi ve _IC50 değerlerine çevrilmiştir bir test edilen bileşiğin, değişen konsantrasyonları ile tedavi sonrası canlı kalan kanser hücrelerinin yüzdesini belirlemek. MTT deneyi doğruluğu, hız ve nispi basitliği nedeniyle sitotoksisite çalışmalarda yaygın olarak yaygındır.

Burada biz preHücre plakaların hazırlanması hücreleri ile inkübe bileşiklerin dahil olmak üzere hava duyarlı metal bazlı ilaç ve hücre canlılığı ölçümlerin sentezi için ayrıntılı bir protokol gönderilen, MTT deneyi ve _IC50 değerlerinin tayini kullanılarak canlılığı ölçümleri.

Giriş

Kemoterapi hala çeşitli kanser hastalıkları için klinikte kullanılan tedavilerin temel derslerden biridir ve araştırma böylece büyük miktarda yeni ve geliştirilmiş antikanser ilaçlar geliştirmek amacı ile dünya çapında yapılır. Bu tür çalışmalar, daha çok in vitro sitotoksik biyolojik özelliklerinin değerlendirilmesi ardından bileşiklerin tasarımı ve hazırlığı ile, kimyasal düzeyinde başlar. Hücre canlılığı, hücresel aktivite ^1-2 ile ilgili bilgi sağlayacak çeşitli deneyleri ile değerlendirilebilir.

Cisplatin yaygın olarak testis ve yumurtalık kanserlerinde ^3-4 için ağırlıklı olarak etkili bir tedavi olarak kabul edilir bir kemoterapötik ajan olarak kullanılan bir platin kompleksi bir örnektir. Bununla birlikte, dar bir aktivite yelpazesi ve ciddi yan etkiler diğer kuvvetli geçiş metali komplekslerinin ^5-8 çalışmaları tetikler. Diğerlerinin arasında, titanyum (IV) ve vanadyum (V) kompleksleri, yüksek aktivite ümit verici sonuçlar göstermiştir ve azaltılmıştoksisite ^9-16. Ti (IV) kompleksleri nedeniyle bu özelliklerinden sisplatin sonrasında klinik denemeler girmek için ilk idi, ancak onlar yüzünden formülasyon zorluklar ve hidrolitik istikrarsızlığa denemeler başarısız olmuştur. Su direnci ^15,17-21 yüksek anti-kanser aktivitesi birleşebilmektedir, bu metal komplekslerinin gelişmiş türevlerini geliştirmek için geçerli bir ihtiyaç vardır.

Ti (IV) ve V hazırlanmasında bir sorun (V) kompleksleri öncü reaktifleri hidrolitik kararsızlık anlamına gelir ve bu nedenle, atıl bir atmosfer muhafaza edilmelidir. Ti (IV) ve V (V) bileşiklerinin hazırlanması Bir eldiven kutusu ya da bir Schlenk hat teknikleri kullanılarak N, ₂ veya Ar koşullar altında gerçekleştirilmektedir.

Tahlil - anti-kanser etkinliğinin değerlendirilmesi için yaygın bir yöntem, MTT ((4,5-Dimetiltiazolil) -2,5-difeniltetrazolyum bromür 3) üzerine dayanmaktadır. Bu deney, Mosmann 1983 sunulan bir kolorimetrik canlılık deneyidir^22. Bu, son derece iyi çalışılmış ve karakterize edici özelliği, ve nedeniyle hassas, hız ve hücre çizgilerinin çeşitliliği uygulanacak yeteneği yeni sitotoksik bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek zaman yüksek verimli olarak kabul edilir. Bu deney, bu canlılığı yaşayabilir hücrelerin maruz kaldığı MTT molekülün renk değişikliğine dayanmaktadır. Canlı hücre sayısı ile orantılıdır emme, ve muamele edilmemiş kontroller ile karşılaştırıldığında ölçülmesi, test edilen bileşiğin, hücre büyüme inhibisyonu yetenekleri değerlendirilmesini sağlar.

MTT kolorimetrik deneyi, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde ²³ olarak gerçekleştirilmiştir. Hücreler, test edilen ilaç eklenmesinden önce kuyularda, bir ön kuluçka gerektirebilir. Inkübasyon saatleri hücre hattı özelliklerine bağlı olarak 0-24 saat arasında değişebilir. Hücreler, genellikle, ilaç aktivitesine bağlı olarak 24-96 saat boyunca ilaca maruz kalmaktadır. MTT çözeltisi daha sonra bağırma muamele edilmiş hücrelere ilave edilirow MTT (Şekil 1) ²⁴ canlı hücrelerde işlevsel olan mitokondrial ve sitosolik enzimlerin çeşitli mor formazan indirgenir. MTT molekül ölü hücre ya da kırmızı kan hücrelerinin (metabolik açıdan aktif olmayan hücre), dalak hücreleri (dinlenme hücreleri) ve konkanavalin A ile uyarılan lenfosit (aktif hücreler) ²² ile azaltılmaz. MTT formazan çökeltiler ile inkübasyon 3-4 saat sonra. Formazan oluşumu inkübasyon 0.5 saat sonra başlar, ama en iyi sonuçlar için en az 3 saat ²² boyunca MTT hücreleri ortaya çıkarmak için en iyisidir. Sonuç olarak, yetiştirme ortamı çıkarıldı ve DMSO da ²⁶ kullanılabilir olmasına rağmen, formazan, organik bir çözücü, tercihen de ²⁵ izopropanol içinde eritilir. Ortamın ortadan kaldırılması büyüme ortamı içinde çok yaygın olan fenol kırmızı, bu yana doğru sonuçlar elde etmek, ve proteinler absorbans ölçümü ²⁵ engelleyebilir çökeltilmesi için çok önemlidir. Ne zaman formazan çözelti, çözeltinin absorbansı, bir mikro-plaka okuyucu spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür, homojen ulaşır. 550 nm'de absorbans, oyuk başına 200-50.000 hücre aralığındaki hücre sayısı ile doğru orantılıdır ve bu nedenle hücre çok küçük miktarlarda ²² tespit edilebilir. Absorbans ilaç ile tedavi sonrasında kalan canlı hücre miktarı belirtir ve ilaca maruz bırakılmamış kontrol hücreler absorbans ile karşılaştırılır. Uygun yazılım ile sonuçların analizi IC ₅₀ (inhibisyon konsantrasyon,% 50) içerir ve bunların değerlerinin istatistiksel hatalar ölçümün kaç kez tekrar göre.

MTT deneyi doğruluğu ve göreli basitliği nedeniyle yeni antikanser bileşikleri, taranması için sitotoksisite çalışmalarında yaygın olarak yaygındır. Enzimatik reaksiyon bağlı olan MTT tahlili kullanarak, ancak, bir çeşitli enzim inhibitörleri MTT An indirgenmesini etkileyebilir dikkat edilmesi gereken hususlaryanlış sonuçlara yol ²⁷ d. Buna ek olarak, MTT deneyi, ilacın ² sitotoksik aktivitesinin moleküler mekanizma hakkında herhangi bir bilgi sağlamaz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. V hazırlanması (V) kompleksi (Şekil 2); ¹⁸ davranış bir eldiven kutu içinde 1,1-1,4 adımları, bir eldiven kutusu mevcut değilse, alternatif atlayın 2 (2,1-2,6) adım.
   1. Ligandların 0,42 mmol, kuru THF H ₂ L çözülür ve THF içinde VO eşdeğer miktarda eden karıştırılan bir çözeltiye (O i Pr) ₃ ekleyin.
   2. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında reaksiyon karışımını karıştırın ve vakum altında uçucu maddeler uzaklaştırılmıştır.
   3. Soğuk hekzan ekleyin ve vakum altında çıkarın. Koyu mor renkli bir toz kantitatif bir verimle elde edilmelidir.
   4. Bir Eppendorf şişede elde edilen bileşik 8 mg tartılır. 3. adıma atlayın.
2. Bir Schlenk hat kullanılarak V (V) kompleksi hazırlayın.
   1. Bir septum kapak ile kuru bir Schlenk şişesine kuru THF içinde ligand L _2, H, 0.42 mmol çözülür, bir Schlenk hattına eklemek ve vakum / inert gaz _(N2 veya Ar) ortamlarda dönüşümlü uygulanır; üç s uygulanması önerilirmermi uch ve vakum sahnelerinde 2-5 dakika bekleyin.
   2. Septum kapak ile, şırınga ile kuru THF ekleyin.
   3. VO (O i Pr) eşdeğer miktarda ekleme, hattına uygun bir kuru bir Schlenk şişesi çengel eylemsiz bir ortam uygulanması ve bu için vanadyum çözeltiden, bir şırınga vasıtasıyla, reaktiflerin eklenmesi ile benzer bir şekilde hazırlanmış olan bir THF çözeltisine, ₃ ligand.
   4. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında reaksiyon karışımını karıştırın ve vakum altında uçucu maddelerin ayrılması, kararsız bir ürün endişe ise, atıl bir atmosfer altında uçucu Schlenk tipi damıtma yerine, ön-kurutma edilmiş gerekli cam takmak için atıl gaz akışının kullanımı .
   5. Soğuk hekzan ekleyin ve vakum altında çıkarın. Koyu mor renkli bir toz kantitatif bir verimle elde edilmelidir.
   6. Bir Eppendorf şişede elde edilen bileşik 8 mg tartılır.
3. Ti hazırlanması (IV) kompleksi (Şekil 2); ²⁸ davranış bir eldiven kutu içinde 3,1-3,3 adımları, bir eldiven kutusu mevcut değilse, bunun yerine bir Schlenk çizgi istihdam vanadyum analog (adım 2) için tartışılan alternatif adımları ayarlayın.
   1. , Kuru THF içindeki bir ligand L _2, H 0.35 mmol, THF içinde çözülür ve Ti (O Pr i) ₄ eşdeğer miktarlarının bir karıştırılan çözeltisine ekleyin.
   2. 2 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyon karışımını karıştırdıktan. Kantitatif verimle sarı bir ürün vermek üzere vakum altında uçucu maddeler uzaklaştırılmıştır.
   3. Eppendorf şişede elde edilen bileşik 8 mg tartılır.
4. HT-29 hücreleri, 96 oyuklu plaka hazırlanması
   1. % 1 penisilin / streptomisin antibiyotik,% 1 L-glutamin, ve 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 5 _CO2 ile birlikte içeren RPMI-1640 ortamıyla, 75 cm ² şişede Culture HT-29 hücreleri, .
   2. HT-29 hücreleri (altkültür olmadan her 3-4 gün 90-100%) maksimal confluency ulaştığınızda ortamı çıkarın. 1 ml 'si ile yıkayınıztripsin (% 0.25) / EDTA (% 0.05) çözümü ve çıkarın.
   3. Tripsin 1 ml (% 0.25) / EDTA (% 0.05) çözeltisi ilave edin ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
   4. Şişeden HT-29 hücreleri ayırın ve tripsin aktivitesi devre dışı bırakmak için ortam 10 ml ekleyin. Bir tübe hücreler karışımın 5 ml aktarın.
   5. Sayaç haznesine hücreler karışımın birkaç damla aktarmak için pipet kullanın. Sayaç odası 5 x 5 kare içerir.
   6. Köşelerde 4 kare ve ortasında bir: bir mikroskop kullanılarak 5 temsilci meydanlarda hücreleri saymak.
   7. Mevcut hücre tahmini miktarını hesaplayın. 5 temsilci meydanlarda hücreleri toplamak ve 20'ye bölün.
   8. Adım 4.7 sonuçla 0.6 bölün. Alınan plaka başına gereken hücre karışımı miktarıdır. Bu hesaplama, 0.6 x 10 ⁶ hücre (oyuk başına 9,000 hücre) içeren bir plaka ile ilgilidir.
   9. P başına gereken hücre karışımının miktarını aktarmak için pipet kullanınGeç (bölüm 4.8 hesaplanan) ve orta 13.2 ml ekleyin (kuyunun × 66 kuyu başına 200 ul).
   10. 11 kanallı bir pipet (oyuk başına 200 ul, 6 hatları, toplam 66 kuyu) ile 96 oyuklu plakaya karışımı ekleyin. Her satırın biri de boş kontrolü için boş kalmalıdır.
   11. Hücreler plaka takmak için izin vermek için 24 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
5. Bileşiklerin Ekleme
   1. Aşama 1.4 (ya da 2.6) ve 3.3 'de tarif edildiği gibi her bir bileşiğin 8 mg kuru THF içinde (arzu edilen konsantrasyon aralığı uygun olarak ya da farklı miktarda) 200 ul ekle tartılır. Da, ligand L _2, H 8 mg tartılır.
   2. 9 farklı Eppendorf şişelere THF içinde 60 ul ekleyerek ayrıca her bileşik çözeltisi ile seyreltilir.
   3. 10 farklı konsantrasyonları o kadar çok ilk Eppendorf şişe, tekrar süspansiyon ve bir sonraki şişeye transferi 60 ul, ve Bölüm 5.1 'de karışımdan bir pipet 60 ul transfer(bölüm 5.1 ana karışıma dahil) btained.
   4. Ortamın 180 ul THF içinde her bir konsantrasyonu 20 ul seyreltin.
   5. Sadece THF ile bir kontrol çözelti hazırlayın, her ölçüm ortamı 180 ul THF içinde 20 ul.
   6. Zaten konsantrasyon aralığı olabilir (en fazla 200 mg / L bileşiğinin son konsantrasyonları vermek üzere ortam içinde hücrelerin belirtilen çözeltisi içeren 200 ul her bir oyuğuna, (THF kontrolü dahil) elde edilen çözeltiden 10 ul ekle ) Bileşik aktivitesine göre değiştirilebilir.
   7. Bu bileşiğin çözünürlüğüne bağlı olarak, uygulanan en yüksek konsantrasyonda bir çökeltme görülebilir.
   8. Bileşik 3x (aynı bileşiğin plakasında hat 3) her bir ölçüm tekrar, her bir çizgi içerir: 10 farklı konsantrasyonda, iyi boş için hücreler olmaksızın sadece kontrol ve 1 çözücüsü ile işlemden geçirildi 1 de içeren hücrelerde, bileşik ile muamele edilmiş hücrelerin kontrolü.
   9. _CO2 atmosfer,% 5 37 ° C'de 3 gün için yüklenen plaka inkübe edin.
6. MTT tahlili kullanılarak sitotoksisite ölçümü
   1. Fenol kırmızısı olmadan RPMI-1640 ortamı içinde 200 ml'lik bir solüsyona MTT tozu, 1 g ekleyerek MTT çözeltisi hazırlayın. Stok çözelti, 15 ml tüplere bölünmüştür ve -20 ° C'de saklanabilir
   2. (Adım 4.10 arasındaki hücreleri olmadan boş kontrol çukurları hariç) her bir kullanan 11 kanallı pipet MTT çözeltisinin 20 ul ve ilave 3 saat boyunca inkübe edin.
   3. Her bir ikinci ortam çözeltisini çıkarın.
   4. Formazan'ın çözülmesi için her bir oyuğa 200 ul izopropanol ekleyin. Homojenliğine ulaşıncaya kadar 0.5 saat için plaka karıştırın.
   5. Bir mikro-plaka okuyucu spektrofotometre ile yukarıda sözü edilen solüsyon 200 ul için 550 nm'deki absorbansı ölçülür.
   6. 3 farklı günlerde (ki 3 tekrarlar içeren, adım 5.8) her ölçümü tekrarlayın.
   7. T hesaplamakTHF çözücü kontrol değerinin absorbans ile bölünmesi sonucu, ölçülen değer arasındaki boş kontrol absorbans değerinin düşülmesi ve% 100 ile çarpılması suretiyle hücre canlılığının o yüzdesi.
   8. GraphPad Prism yazılımı (ya da eşdeğeri) kullanılarak _IC50 değerleri hesaplanır.
   9. Başka IC _50, en az üç farklı günlerde toplanan bütün _IC50 değerlerinin ortalama ve hata değeri standart sapmasıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu kompleksler, yerleşik prosedürlere ^18,28 ve saflığı NMR ve element analizi ile değerlendirilebilir göre hazırlanmıştır.

MTT deneyi alınan veriler, bileşiğin ^18,21 sitotoksisitesini değerlendirmek için analiz edilir. İlk olarak, tüm diğer değerleri işlenmemiş kontrol absorbans değerinin çıkarılması gerçekleştirilir. İkinci olarak, çözücü THF kontrol değeri bileşiği herhangi bir büyüme inhibe edici olarak ilave edildi,% 100 canlı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda tarif edildiği gibi bir yöntem, biyolojik hücre canlılığı deneyi ile, kimyasal sentez birleştirir. Canlı hücreler ile ilgili herhangi bir biyolojik yöntemlerle olduğu gibi, laminar bir kaput çalışma ve steril organik çözücülerin kullanılması dahil olmak üzere steril koşullar korumak için çok önemlidir. Ayrıca, hidrolitik olarak stabil olmayan metal bazlı ilaçların hazırlanması ve depolanması için olan bir eldiven kutusu ya da bir Schlenk hat teknikleri kullanılması gerekmek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Hexane AR	Gadot	830122313	Dried using a solvent drying system
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38
Isopropanol AR	Gadot	830111370
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
Penicillin/streptomycin antibiotics	Biological Industries	03-031-1B
RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine	Sigma-Aldrich	R8758
RPMI without phenol red	Biological Industries	01-103-1A
Tetrahydrofuran (THF) AR	Gadot	830156391	dried using a solvent drying system
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	moisture sensitive
Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	moisture sensitive
Equipment
12-channel pipette 30-300 μl	Thermo Scientific
12-channel pipette 5-50 μl	Finnpipette
75 cm2 flask	NUNC	156472
96-well plate with lid (flat bottom)	NUNC	167008
CO2 Incubator	Binder	APT.line C150
Counter chamber	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf vial	KARTELL
Glove box	M. Braun
Laminar flow hood	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
Microplate reader spectrophotometer	Bio-Tek	El-800
Microscope	Nikon	Eclipse TS100
Pipette 20-200 μl	Finnpipette
Pipette 5-50 μl	Finnpipette