L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Riepilogo

Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l'imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.

Abstract

Drosophila melanogaster è un sistema potente modello che è stato ampiamente utilizzato per chiarire una varietà di processi biologici. Ad esempio, gli studi sia del femminile e linee germinali maschili di Drosophila hanno contribuito notevolmente alla comprensione corrente della meiosi e biologia delle cellule staminali. Protocolli eccellenti sono disponibili in letteratura per l'isolamento e l'imaging di Drosophila ovaie e testicoli ^3-12. Qui, metodi per la dissezione e la preparazione dei testicoli Drosophila per l'analisi microscopica sono descritti con un video dimostrativo accompagnamento. Un protocollo per isolare testicoli dall'addome dei maschi adulti e preparare vetrini di tessuto reale per l'analisi al microscopio a contrasto di fase e un protocollo per il fissaggio e immunocolorazione testicoli per l'analisi al microscopio a fluorescenza sono rappresentati. Queste tecniche possono essere applicate nella caratterizzazione di mutanti di Drosophila che esibiscono defects nella spermatogenesi e nella visualizzazione delle localizzazioni subcellulari di proteine.

Introduzione

Testicoli Drosophila sono un sistema modello ideale per lo studio di molti processi biologici che comprendono la regolazione delle cellule staminali, meiosi e sviluppo dello sperma ^13-18. Gli spermatociti ed i loro fusi meiotiche sono grandi e quindi conveniente per l'analisi citologica e rilassato checkpoint del ciclo cellulare durante la spermatogenesi facilitano lo studio delle mutazioni nei geni del ciclo cellulare. Diversi tipi di cellule possono essere osservati in progressione ordinata lungo la lunghezza dei testicoli, e qualsiasi problema nella spermatogenesi può portare a cambiamenti in questa disposizione complessiva. Queste caratteristiche combinate con strumenti genetici Drosophila hanno facilitato l'analisi mutazionale della spermatogenesi ^21-23.

Le fasi di spermatogenesi Drosophila sono stati ben definiti. Cellule germinali che si sviluppano all'interno sincrono cisti progrediscono sequenzialmente attraverso le fasi della spermatogenesi lungo la lunghezza del testicolo. Durante both mitotico e divisioni meiotica delle cellule germinali maschili, citochinesi si verifica incompleto tale che le cellule figlie rimangono collegati da ponti citoplasmatici noti come canale chiamato (Figura 1). La punta apicale del testicolo contiene una popolazione di cellule staminali germinali che dà origine a spermatogoni, che subiscono quattro divisioni mitotiche con citochinesi incompleto per generare cisti 16 cellule di spermatociti primari. Dopo la fase di premeiotic S, spermatociti primari entrano G2, un periodo di crescita prolungato di ~ 90 ore durante il quale aumenta il volume cellulare ~ 25 volte. Progressione attraverso meiosi I e meiosi II porta alla formazione di cisti 32 cellulari di spermatociti secondari e cisti 64 cellulari di spermatidi aploidi, rispettivamente. I, spermatidi rotondi immaturi sottoposti a numerosi rimodellamento cellulare per formare spermatozoi maturi. Cellule post-meiotiche, in particolare i fasci di allungamento e spermatidi maturi, occupano gran parte del volume del testicolo.

Tegli trasporto successo di sperma funzionale alla linea femminile richiede un coordinamento tra le diverse parti del sistema riproduttivo maschile, che è composto da varie strutture accoppiati (i testicoli, vescicole seminali e ghiandole accessorie) e un unico condotto eiaculatorio (Figura 2). Spermatozoi sono prodotti nei testicoli e memorizzati all'interno delle vescicole seminali fino copulazione ^24. Le ghiandole accessorie contengono cellule secretorie che producono liquido seminale. Lo sperma migrazione dalle vescicole seminali sono mescolati con liquido seminale all'interno del condotto eiaculatorio, che è collegato ad entrambe le vescicole seminali e ghiandole accessorie. Questa miscela di sperma e fluido seminale viene infine pompato fuori del maschio nella vagina della femmina volare attraverso il bulbo eiaculatorio situato all'estremità posteriore del maschio addome ^25. Le proteine ​​all'interno del liquido seminale sono essenziali per la conservazione prolungata di spermatozoi all'interno degli organi specializzati noto come spermateche in reptratto roductive di Drosophila femmine ^26.

Metodi eccellenti per l'isolamento dei testicoli Drosophila e visualizzazione delle cellule nelle varie fasi della spermatogenesi sono disponibili nella letteratura scientifica ^3-12. Noi qui aggiungiamo a questo corpo di conoscenze con la presentazione di esempi di questi protocolli con un video dimostrativo di accompagnamento. Il protocollo per la preparazione dei testicoli vivi campioni per la microscopia a contrasto di fase si basa su un metodo precedentemente descritto ^27. Il protocollo per formaldeide fissazione e immunocolorazione di testicoli si basa su un metodo descritto in precedenza ^28. I metodi qui descritti sono stati utilizzati in molti studi di Drosophila spermatogenesi (ad esempio, per valutare i ruoli di dineina, un motore microtubuli Minus estremità rivolta, durante la spermatogenesi Drosophila).

Oltre ai protocolli di base, suggerimenti riportati varying la dissezione per arricchire di spermatogoni, spermatociti, o spermatozoi maturi. Diversi metodi di elaborazione dei testicoli tali che le cisti sia rimangono intatti o sono interrotti come necessario descritti. Un vantaggio nell'uso testicoli Drosophila come sistema modello è che, rispetto ai ovociti ed embrioni di Drosophila, anticorpi e coloranti possono facilmente penetrare nelle cellule dopo la loro dispersione dai testicoli, e sono necessarie meno fasi di lavaggio, quindi, protocolli possono essere effettuate in un tempo relativamente breve tempo.

Protocollo

1. Testicoli Dissection

1. Anestetizzare mosche in una bottiglia o flacone utilizzando un flusso di CO ₂ e trasferire ad un pad mosca.
2. In ordine mosche sotto un microscopio da dissezione utilizzando un pennello piccolo, e raccogliere un numero appropriato (seconda dell'esperimento) di maschi di Drosophila dei genotipi desiderati. I maschi giovani (0-2 giorni) sono l'ideale per l'esame delle cellule durante i primi stadi della spermatogenesi (ad esempio spermatogoni, spermatociti e spermatidi precoci post-meiotiche), mentre i maschi leggermente più anziani (2-5 giorni) sono l'ideale per l'esame di cellule nelle fasi finali della spermatogenesi (in particolare, maturo sperma).
3. Usare pinze per rimuovere le ali di ogni volo (per evitare che le mosche dal galleggiante nel liquido durante la dissezione).
4. Aggiungere ~ 500 ml di tampone fosfato salino (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3 mM NaH ₂ PO _4; PBS) in una goccia di un piatto dissezione siliconata suuno sfondo nero. Altre soluzioni acquose sono state usate con successo per testicoli dissezione ^3.
5. Punto pinza verso la parte anteriore della mosca, afferrarlo dal torace, ed immergerlo nella goccia PBS. Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, utilizzare un altro paio di pinze per afferrare e tirare la genitali esterni (struttura marrone scuro che si trova alla fine posteriore dell'addome ventrale) posteriormente fino a quando si stacca dall'addome. Nella maggior parte dei casi, i testicoli, vescicole seminali e ghiandole accessorie verranno rimossi dall'addome insieme ai genitali esterni, se necessario, introdurre una sola coppia di pinze in addome e giro fuori testicoli.
6. Testicoli separati da ghiandole accessorie e genitali esterni con due coppie di pinze nei menu PBS (Figura 2). Wild-type testicoli sono facilmente distinguibili dai tessuti bianchi vicini per il loro colore giallo. Procedere immediatamente alla fase 2.
7. Per isolare testicoli dai maschi pharate (i.. E racchiuso nel bozzolo), una fase aggiuntiva deve essere eseguita prima che comporta la rimozione della mosca dal bozzolo; questo passo è stato precedentemente descritto altrove ^31. Procedere con dissezione come per i testicoli adulti che iniziano nella fase 1.2.
8. Per isolare testicoli dai maschi larvali, eseguire una modifica di un protocollo per isolare ovaie larve di Drosophila ^32. Brevemente, larve maschio può essere distinto da larve femmina dalla presenza di una coppia di grandi strutture chiare ovali (testicoli larvali) incorporati nel terzo posteriore del corpo grasso. Per isolare testicoli larvali, parzialmente scorticato aprire la larva maschio per isolare i testicoli e il corpo grasso circostante dall'addome come descritto per l'isolamento delle ovaie larvali. Procedere immediatamente alla fase 2 del protocollo qui descritto, i testicoli possono poi essere rimossi dal corpo grasso appena prima del montaggio (passi 2.3 o 3.14) come descritto per le ovaie ^32.

2. Preparazione del campione e dal vivo Imaging

1. Utilizzare un paio di pinze per inserire delicatamente 2-3 paia di testicoli in una goccia di 4-5 ml di PBS in una piazza copertura in vetro antiscivolo. Si noti che il rapporto tra numero di testicoli di volume di PBS può essere necessario regolare: troppo liquido impedire alle cellule di diffondere correttamente quando schiacciato, mentre troppo poco liquido indurre le cellule a scoppiare quando schiacciato. Facoltativo: Utilizzare copertura siliconata scivola per ridurre al minimo l'aderenza del tessuto per coprire scivolare nella fase 3.2.
2. Usare un paio di pinze per lacerare ogni testicolo in una posizione appropriata in modo da massimizzare la presenza dei tipi di cellule germinali desiderati nella preparazione (si noti che il contenuto del testicolo saranno principalmente uscita dalla regione lacerata sul vetrino durante lo schiacciamento passo.) Per arricchire di spermatogoni e spermatociti, strappare aprire il testicolo adiacente alla sua estremità apicale (livello 1, Figura 2B). Per arricchire di spermatociti e spermatidi, strappo aprire il testicolo in un position leggermente basale al livello 1 (livello 2, Figura 2B). Per arricchire le cellule germinali più mature, strappare aperto il testicolo più vicino a dove la curvatura inizia (livello 3, Figura 2B).
3. Posizionare delicatamente un vetrino per microscopio sul vetrino di schiacciare i testicoli; non applicare pressione manualmente come il solo peso della copertura antiscivolo è sufficiente per ottenere un campione correttamente schiacciata. Cercate di evitare di intrappolare bolle d'aria. Facoltativo: Utilizzo poli-L-lisina rivestite vetrini da microscopio per promuovere l'adesione del tessuto a scorrere nel passaggio 3.2.
4. Utilizzare preparazione immediatamente (idealmente entro 15 minuti dalla preparazione) per osservare cellule vive mediante microscopia a contrasto di fase, per le mosche transgeniche con l'espressione di proteine ​​con targhetta modo fluorescente nei testicoli, cellule vive possono essere esaminate al microscopio a fluorescenza in questa fase. In alternativa, procedere alla fissazione e colorazione anticorpo (Protocol 3).
5. Stoppino delicatamente il liquido in eccesso da sotto il vetrino con una pulizia wipe consentire appiattimento della preparazione finché le cellule germinali sono chiaramente a fuoco.

3. Formaldeide fissazione e colorazione anticorpale

1. Snap congelare ogni diapositiva contenente testicoli schiacciati (dal protocollo 2) usando un paio di pinze di metallo per immergere brevemente in azoto liquido (fino azoto liquido si ferma bubbling).
2. Rimuovere immediatamente la polizza di copertura con una lama di rasoio.
3. Utilizzare pinze di metallo per trasferire le diapositive in una prechilled portavetrini bicchiere pieno di ghiaccio-freddo etanolo al 95% (grado spettrofotometrica, privo di metanolo). Conservare a -20 ° C per 10 min.
4. Utilizzare metallo molle a trasferire vetrini per un rack scorrevole in vetro riempita con formaldeide al 4% in PBS più 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Conservare a temperatura ambiente per 7 min.
5. Utilizzare pinze di metallo per trasferire le diapositive di un rack scorrevole in vetro riempita con PBS. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 1x. Eseguire tutti i lavaggi scartando la soluzione nel rack vetrino ( Ie. versando fuori) e sostituzione con soluzione fresca.
6. Eliminare il PBS e immergere i vetrini in PBS-T per 30 min a temperatura ambiente per permeabilize membrane cellulari.
7. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 2x.
8. Blocco passo (opzionale): Immergere i vetrini in PBS più 1% BSA per 45 minuti a temperatura ambiente.
9. Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio sul vetrino intorno tessuto schiacciato (facilmente visibile a occhio) al fine di limitare le soluzioni di anticorpi (aggiunte in fasi 3.9 e 3.11). Il tessuto deve essere tenuto umido in ogni momento durante l'esecuzione di immunoistochimica.
10. Aggiungere 30-40 ml di anticorpo primario (diluito in PBS-T, 1:400 a 1:50, secondo anticorpo) al tessuto all'interno del cerchio. Se è stato eseguito il blocco, diluire l'anticorpo primario in PBS-T più 1% BSA. Anti-gamma-tubulina anticorpo (per la colorazione di cntrosome in Figura 4) è stato diluito 1:100. Incubare in un umido, camera oscura (scatola di plastica per es. Chiusocon asciugamani umidi di carta) per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
11. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a 3x camera di temperatura. Se è effettuata blocco, lavare due volte in PBS-T e una volta in PBS (5 min a temperatura ambiente ciascuna).
12. Aggiungere 30-40 ml di anticorpo secondario coniugato con fluoroforo (diluito 1:400 in PBS) per il tessuto e incubare al buio per 1-2 ore a temperatura ambiente.
13. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 2x.
14. Aggiungere 30-40 ml di soluzione di DAPI (0,2 mg / ml in PBS) per il tessuto all'interno del cerchio.
15. Posizionare delicatamente una scivolata copertura in vetro sopra il tessuto, avendo cura di evitare di intrappolare bolle d'aria. Se devono apparire bolle d'aria, muoversi con attenzione intorno la polizza di copertura senza distruggere la zucca fino a quando le bolle sfuggire ai lati del vetrino.
16. Utilizzare una pulizia wipe per cancellare l'eccesso DAPI dai bordi della diapositiva.
17. Sigillare la polizza di copertura al vetrino con smalto trasparente.
18. Utilizzare questa preparazioneentro i prossimi 3-4 ore per vedere le cellule immunostained mediante microscopia a fluorescenza. Per la conservazione a lungo termine di diapositive (almeno fino a diverse settimane), utilizzare un supporto di montaggio dura a base di glicerolo-con DAPI, e conservare i vetrini a -20 ˚ C.
19. In alternativa, i campioni fissare in metanolo al posto di formaldeide (secondo l'antigene). Dopo aver completato l'intero protocollo di passaggio 3.2, immergere i vetrini di testicoli schiacciati in metanolo per 10 minuti a -20 ° C e procedere con passo 3.5 in poi.

Risultati

Un esempio di una coppia correttamente sezionato di organi riproduttivi maschili Drosophila è mostrato in Figura 2A. Testicoli rimossi dall'addome della mosca maschio adulto sono tipicamente collegati al condotto eiaculatorio (marrone, Figura 2A ') ed una coppia di ghiandole accessorie (verde, Figura 2A') tramite una coppia di vescicole seminali (blu, Figura 2A ') . Per separare i testicoli dalla maggior parte del tessuto somat...

Discussione

Anche se i testicoli di wild-type mosche possono essere facilmente identificati grazie al loro colore giallo (in contrasto con i tessuti bianchi vicini), i testicoli di mosche mutanti bianchi sono bianchi e quindi può occasionalmente essere confusi con l'intestino. Ceppi più transgenici, tipicamente in uno sfondo bianco, hanno anche testicoli bianchi perché il mini-bianco gene trovato P-elementi non promuove l'accumulo di pigmento nei testicoli. Quando testicoli Drosoph...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Name of Equipment	Company
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40x objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40x objective	Carl Zeiss