Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Zusammenfassung

Ein einfaches Protokoll, um die neutrale Lipidgehalt der Algenzellen zu bestimmen, mit einer Nil-Rot-Färbung Verfahren beschrieben. Diese zeitsparende Technik bietet eine Alternative zu herkömmlichen gravimetrischen basierten Lipid Quantifizierung Protokolle. Es ist für die spezielle Anwendung der Überwachung Bioprozess Leistung ausgelegt.

Zusammenfassung

Algen gelten als ausgezeichnete Kandidaten für erneuerbare Energiequellen aufgrund ihrer natürlichen Lipidspeichermöglichkeiten. Robust Überwachung von Algenfermentationsprozesse und das Screening nach neuen ölreichen Stämme erfordert eine schnelle und zuverlässige Protokoll zur Bestimmung der intrazellulären Lipidgehalt. Aktuelle Praktiken beruhen weitgehend auf gravimetrische Methoden zur Ölgehalt zu bestimmen, entwickelten Techniken vor Jahrzehnten, die zeitaufwendig und erfordern große Probenvolumina. In diesem Papier wird Nile Red, ein Fluoreszenzfarbstoff, der verwendet wurde, um das Vorhandensein von Lipidkörper in zahlreichen Arten von Organismen zu identifizieren, in ein einfaches, schnelles und zuverlässiges Protokoll zum Messen der neutralen Lipidgehalt Auxenochlorella protothecoides, eine grün einge Alge. Die Methode verwendet Ethanol, ein relativ mildes Lösungsmittel, um die Zellmembran vor der Färbung und eine 96-Well-Mikroplatte, die Probenkapazität bei Messungen der Fluoreszenzintensität zu erhöhen permeabilisieren. Es ist Entwurfed mit der spezifischen Anwendung der Überwachungs Bioprozess-Leistung. Zuvor getrockneten Proben oder lebende Proben aus einer wachsenden Kultur kann in dem Assay verwendet werden.

Einleitung

Aufgrund ihrer Fähigkeit, Lipidkörper unter bestimmten Stress-Bedingungen zu speichern, Algen haben eine große Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als potenzielle erneuerbare Energiequelle ^1,2 erhielt. Neutrale Lipide können über 60% des Trockengewichts der Zellen unter geeigneten Wachstumsbedingungen ³ entfallen. Doch die Industrie nicht eine einfache, saubere, schnelle und zuverlässige standardisiertes Protokoll zur Lipidgehalt der Algenzellen, um Bioprozess-Performance-Bildschirm für neue Stämme angemessen überwachen, Kulturen zu analysieren und zu quantifizieren.

Die Bligh-Dyer gravimetrischen Methode entwickelt, vor rund 50 Jahren noch zu den häufigsten Techniken heute ^4,5 verwendet. Während dieses Verfahren ist einfach, zuverlässig und einfach durchzuführen, ist es zeitraubend, erfordert große Probenvolumina, und macht Gebrauch von toxischen Lösemitteln. Es ist nicht praktisch für die Analyse von vielen Proben aus einer Fermentationslauf oder die Selektion von neuen ölreichen Stämme. Andere Verfahren haben been entwickelt, aber in der Regel verlangen, moderne Ausrüstung und wurden nicht standardisiert ^6.

Eine Alternative, die ein großes Interesse erregt hat ist der Nil Rote Fleck. Nile Red, ein Farbstoff, bevorzugt in unpolaren Umgebungen fluoresziert, wurde verwendet, um in verschiedenen Organismen einschließlich Nematoden ^{7, 8} Hefe-, ^{Bakterien-9, 10-19} und Algen zu identifizieren oder zu quantifizieren Lipidkörper. Erste Techniken mit Nile Red waren meist qualitative oder semi-quantitative, die Kombination der Fleck mit Single-Küvette Spektrophotometrie oder Durchflusszytometrie. Darüber hinaus sind einige Klassen von Algen wie Grünalgen haben dicke Zell Brunnen, die meist undurchlässig für den Farbstoff, der den Bereich der Technik ¹⁰ begrenzt sind.

Die jüngsten Verbesserungen an den Nil Rot-Färbung wurde berichtet, dass die anfängliche Mängel des Protokolls ^10,11 umgehen. Färbung der Zellen in der Gegenwart einer Carrier Lösungsmittel wie DMSO oder Ethanol ^{10 10,11} linearisiert die Beziehung zwischen Ölgehalt und Absorption, so dass für eine zuverlässige quantitative Messungen. Das Lösungsmittel hilft permeabilisieren die Zellmembran, so dass die Nile Red-Moleküle passieren können. Darüber hinaus, mit einem Spektralphotometer mit Mikro-Platte Lesefähigkeiten ermöglicht Hochdurchsatz-Protokolle geeignet für die quantitative Analyse.

In diesem Artikel werden wir ausführlich eine einfache Methode zur Messung der Ölgehalt der Algenzellen durch Färbung mit Nile Red Kulturen in Gegenwart von Ethanol, einem milden Lösungsmittel. Um möglichst genau entfallen Hintergrundrauschen in den Messungen wird eine Standardkurve korreliert Fluoreszenzintensität auf Ölgehalt Algenzellen mittels bekannter Ölzusammensetzung entwickelt. Das Verfahren wird von zuvor veröffentlichten Protokolle ^10,11 angepasst. Durch die Verwendung eines 96-Well-Spektrophotometer, ist man in der Lage, die gleiche Menge von Proben in einer Stunde tha analysierent würde Tage dauern, um durch gravimetrische Methoden überwachen. Weiterhin wird durch die Kalibrierung mit repräsentativen Stichproben des gewünschten Algenarten erzeugt dieses Verfahren relativ genaue Messungen, die direkt interpretierbar sind. Es gibt viele Protokolle skizziert Methoden der Färbung Algen mit Nil-Rot für unterschiedliche Belastungen und Anwendungen optimiert; Die hier vorgestellten Protokoll wurde ursprünglich von de la Hoz Siegler et al. ¹¹ Auxenochlorella protothecoides entwickelt, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus und Scenedesmus obliquus, obwohl es wahrscheinlich ist geeignet für viele Arten und Klassen. Es wurde mit der spezifischen Anwendung der Überwachungs Bioprozess Leistung konzipiert und funktioniert gleichermaßen gut für Proben zuvor getrocknet und nassen Proben von einer wachsenden Kultur.

Protokoll

1. Isolierung von Dry Algenbiomasse als Standards für die Fluoreszenz-Messwerte Gebraucht werden

1. Entfernen Sie ein Probenvolumen von der wachsenden Algenkultur, die mindestens 200 mg Trockenbiomasse bieten wird, ist 400 bis 600 mg, bevorzugt.
2. Zentrifuge Probe bei 4 ° C für 10 min bei 10.000 x g. Verwerfen des Überstandes und Waschen des Pellets mit einem gleichen Volumen Phosphat-Puffer auf den gleichen pH-Wert wie das Wachstumsmedium formuliert.
3. Wiederholen Sie Schritt 1.2 für insgesamt 3 Waschschritte.
4. Re-suspend das Pellet in de-ionisiertes Wasser und Transfer zu einem vorher gewogen wiegen Gericht. Trocknen lassen bei 50 ° C für 48 Stunden. HINWEIS: Trocknen im Vakuum wird die Trocknungszeit zu verringern und Trocknen der Kultur bei Temperaturen über 50 ° C kann Aufwirbelung erschweren.
5. Speicher getrockneten Algenkulturen bei Raumtemperatur für eine zukünftige Verwendung.

2. Gravimetrische Quantifizierung von neutralen Lipiden durch Hexan-Extraktion (von Bligh und Dyer ⁴ Angepasst)

1. Messen Sie ca. 50 mg Trockenalgenbiomasse in einem wiegen Gericht. HINWEIS: Messen Bereich 40-80 mg ohne Verlust der Reproduzierbarkeit eingesetzt werden.
2. Übertragen Sie die Biomasse in einem Mörser mit Hexan vorgewaschen. Falls erforderlich, waschen Sie die wiegen Gericht mit einer kleinen Menge (1 ml) Hexan mit einer Pasteurpipette, um die Biomasse vollständig zu übertragen, um den Mörtel. HINWEIS: Hexan ist eine leicht flüchtige und toxische Substanz. Es muss im Abzug mit der richtigen Schutzkleidung behandelt werden.
3. Schleifen Sie die Algenbiomasse für 5 min mit einem Stößel. Beginnen Sie mit sanften Schleifen und Intensität schrittweise zu erhöhen. Grind die Biomasse in einer feinen und glatten Paste in der 5-Minuten-Zeitraum. Wenn überschüssiges Hexan wird verwendet, wenn die Übertragung der Biomasse in den Mörser, ist es am besten zu warten, bis das Hexan vor der Mahlung verdampfen.
4. Fügen Sie ein paar ml Hexan zu dem Mörser und mischen Sie die resultierende Schlamm mit dem Stößel, bis sie homogenisiert wird. Sicherstellen, dass alle Zellreste an den Wänden des mor geklebttar sind kostenlos und klopfte in der Flüssigkeit suspendiert.
5. Übertragung der Hexan-Zellmasse Mischung in ein Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Der Zentrifugenröhrchen entweder Glas oder ein geeignetes Polymer mit Hexan wie Teflon kompatibel sein.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5, bis die gesamte Biomasse in das Zentrifugenröhrchen (3-5x) übertragen.
7. Zentrifuge die Probe bei 4 ° C für 20 min bei 10.000 x g.
8. Vorsichtig den Überstand Pipette in ein vorgewogen Metall wiegen Gericht. Bewahren Sie in der Abzugshaube.
9. Führen ^2. Hexan-Extraktion durch Zugabe von 3 ml Hexan zu dem Pellet und Verwirbeln 1 min kräftig.
10. Wiederholen Sie die Schritte 2.7 und 2.8. Wenn nötig, führen Sie die Proben für 30 min in der Zentrifuge in der zweiten Extraktion zu gewährleisten, alle Zelltrümmer vollständig absetzt. Bestimmung der Massen von Öl gravimetrisch nach Hexan extrahiert vollständig verdampft.

3. Fluorometric Quantifizierung von neutralen Lipiden Mit Nile Red (als Reporten von de la Hoz Siegler et al. ¹¹⁾

HINWEIS: Nur 10 ul einer Algensuspension mit 5 g / L für die Fluoreszenzmesswert benötigt. Im Allgemeinen ist die Isolierung des trockenen Algenbiomasse aus 1,5 ml Kulturbrühe mehr als ausreichend. Auch kann die Lichtintensität der Lampe in dem Spektrophotometer im Laufe der Zeit verschlechtern. Es wird empfohlen, Standards in jedem Test eingeschlossen, um sicherzustellen, daß Veränderungen in dem Instrument keine unnötigen Fehler den Messungen hinzuzufügen.

1. Vorbereitung einer Nile Red-Lösung bei einer Konzentration von 10 ug / ml in analysenreinem Alkohol Ethanol gelöst. Bewahren Sie diese Lösung im Dunkeln bei 4 ° C
2. Bereiten Sie eine 30% (v / v) Ethanol-Lösung in VE-Wasser und bei 4 ° C
3. Algen bereiten alle Proben gleichzeitig Biomassekonzentration (5 g / l empfohlen) und in der gleichen Weise wie die bei der Messung verwendeten Standards. Tun Sie dies, indem Sie entweder die Aussetzung vorgetrockneten Proben in der entsprechenden MengePhosphat-Puffer (0,6 g / l dibasisches Kaliumphosphat, 1,4 g / l monobasisches Kaliumphosphat) oder das Einstellen der Konzentration des wachsenden Algenkultur bis 5 g / L Phosphat-Puffer mit nach Messung der Trübung. HINWEIS: Messungen an lebenden Algenkulturen durchgeführt haben oft größere Fehler mit sich in Abhängigkeit von der Präzision des Trübungskalibrierungskurve zugeordnet. Resuspendieren getrockneten Proben kann die Verwendung eines Homogenisators, um die Biomasse vollständig zu dispergieren.
4. Für jede Probe, Mischen von 80 ul der 30% igen Ethanollösung, 10 ul der Nile Red-Lösung und 10 ul der Algensuspension in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte. Um richtig entfallen die Variabilität der Fluoreszenzmessung durch 5 Wiederholungen jeder Probe.
5. Führen Sie einen Zweipunkt-Kalibrierung mit Standards Kurve zuvor, um für den Tag-zu-Tag Variationen in der Instrumenten und Vorbereitung Konto vorbereitet. Bereiten Sie die Standards für die Fluoreszenzmessung mit dem same Verfahren wie die Proben. HINWEIS: In zwei Punkten ist ausreichend zur Nachkalibrierung des Gerätes können drei Punkten ausgeführt, um die Linearität zu überprüfen.
6. Führen Fluoreszenzmessungen in einer Multi-Well Plattenlesegerät Spektrophotometer. Folgende Bedingungen wurden gefunden, um die konsistente Ergebnisse ¹¹ ergeben:
   1. Schütteln bei 1200 rpm, Orbit 3 mm, für 30 Sekunden.
   2. Inkubieren bei 40 ° C für 10 min.
   3. Schütteln bei 1200 rpm, Orbit 3 mm, für 30 Sekunden.
   4. Rekord Fluoreszenz, Anregung bei 530 nm, Emission bei 604 nm auf.
7. Konvertieren Sie die Fluoreszenzmessungen an Ölgehalt unter Verwendung der Ergebnisse aus den internen Standards.

4. Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik

HINWEIS: Die in Abschnitt 3 beschriebenen Färbungsprotokoll wird für die quantitative Analyse entwickelt, es kann aber auch nützlich, um visuelle Darstellungen von Edel-basierte Techniken für Bildungs-und illustrativen pu liefernrposes. Um Bilder der Probenfluoreszenz ein produzieren erfordert ein optisches Mikroskop mit traditionellen Übertragung und zusätzliche Epifluoreszenz Beleuchtungsquellen. Anregungs-und Emissionslicht-Filter in der 530 nm (grün) und 604 nm (rot)-Bereich sind jeweils für die Nil-Rot-Färbung sowie ein Mikroskop angebrachte Kamera mit zugehöriger Software benötigt. Die in dieser Studie (Fig. 1) gezeigten Bilder wurden unter Verwendung einer Hellfeld-Mikroskop mit einer Kamera-und Monochrom-RGB-Umsetzereinheit ausgestattet erworben. Das Verfahren zur Herstellung von Nile Red Fluoreszenzbilder mit diesen Werkzeugen ist nachfolgend aufgeführt:

1. Bereiten Sie eine Kulturprobe mit der Nile Red-Färbung nach § 3 des Protokolls. HINWEIS: eine Probe in der 5 g / L-Konzentrationsbereich produziert Folien ausreichender Zelldichte ohne Überfüllung.
2. Nach Abschluss von Schritt 3.6 des Färbungsprotokoll, bereiten ein Mikroskop-Objektträger der verarbeiteten Probe nach Standard-Laborverfahren.
3. Beginnend mit dem Mikroskop in Transmission, laden Sie die Folie vorbereitet in das Mikroskop, und suchen Sie die Zellen mit der gewünschten Vergrößerung (Bilder in diesem Artikel gezeigt wurden mit dem Ziel erworben 100X).
4. Sobald konzentriert, schalten Sie das Mikroskop von Senden auf Epi-Fluoreszenz-Beleuchtungsmodus. Die Lichtquelle sollte nun direkt von der Objektivlinse kommenden (dies kann visuell durch Beobachtung der Raum zwischen der Folie und der Objektivlinse bestätigt).
5. Legen Sie eine grüne Anregungsfilter in die Lichtquelle und einem roten Emissionsfilter in den Beobachtungsstrahlengang; die Fluoreszenz der angefärbten Zellen sollte nun direkt durch das Okular sichtbar sein.
6. Schalten Sie das Mikroskop Beobachtungsmodus vom Okular auf die Kamera montiert und Betrachtungssoftware verwenden, um ein Bild der fluoreszierenden Zellen zu erfassen. Je nach Empfindlichkeit der Kamera kann die Probe zunächst nicht im Vorschaufenster angezeigt werden (dh der Bildschirm wirdschwarz sein); Um dem abzuhelfen, Einstellen der Belichtungszeit und der Verstärkung der Kamera auf ein Niveau, wo die Zellen sichtbar sind. Spezifische Einstellungen werden mit Instrumenten, Geräten und Zelltypen variieren.

Ergebnisse

Repräsentative Algenzellen mit Nile Red Farbstoff gefärbt sind in Abbildung 1 dargestellt. Teile A und B der Figur 1 zeigen Bilder von A. protothecoides in überschüssigen Stickstoff gewachsen, was zu sehr niedrigen intrazellulären Lipidakkumulation. In den Teilen C und D wurden Proben von A. protothecoides unter Stickstoffbeschränkung gewachsen sind gezeigt. Unter Lichtbeleuchtung können die Lip...

Diskussion

Die in der Standardkurve verwendet Algen müssen die gleichen Spezies unter den gleichen Versuchsbedingungen wie die gemessenen kultiviert werden. Wesentliche Veränderungen in der Medien Zusammensetzung, Anbautechnik und Färbungsprotokoll können die Intensität des Fluoreszenzlese beeinflussen. Extraktion in Hexan (in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben) wurde verwendet, um die neutrale Lipidgehalt der Proben in der Standardkurve verwendet wird zu bestimmen. Für genaue Messungen der Fluoreszenzintensität, müssen a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur Glass Pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (Alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8