הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Summary

הכנת גלולה חיידקים מהירה מתרבית דם חיובית יכולה לשמש כמדגם עבור יישומים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF, צביעת גראם, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת PCR מבוססת. התוצאות ניתן להעביר במהירות לרופאים כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

Abstract

זיהומים ואלח דם דם הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. התוצאה המוצלחת של חולים הסובלים מבקטרמיה תלויה בזיהוי מהיר של הגורם המדבק להנחות טיפול אנטיביוטי אופטימלי. הניתוח של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יכול להתנהל במהירות וכבר להשפיע על המשטר האנטיביוטי באופן משמעותי. עם זאת, זיהוי מדויק של הגורם המדבק עדיין יידרש לקבוע את הטיפול האופטימלי ממוקד. אנו מציגים כאן הכנת גלולה חיידקים פשוטה ומהירה מתרבית דם חיובית שיכול לשמש כדוגמה לכמה יישומים במורד הזרם חיוניים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF MS, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) על ידי assay דיפוזיה דיסק או מערכות AST אוטומטיות ועל ידי אוטומטי PCR מבוסס בדיקות אבחון. הביצועים של מערכות זיהוי וAST אלה שונים מיושמים ישירות על כדורי חיידקי תרבית הדם הוא מאוד siמילר לביצועים בדרך כלל מתקבל ממושבות מבודדות גדלו על צלחות אגר. בהשוואה לגישות קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים מפחיתה באופן משמעותי את הזמן כדי לדווח על זיהוי שני וAST. לפיכך, החיוביות הבאה דם התרבות, זיהוי על ידי MALDI-TOF ניתן לדווח בתוך שעה פחות מ 1 ואילו תוצאות של AST ידי מערכות AST אוטומטיים או מבחני דיפוזיה הדיסק בתוך 8 עד 18 שעות, בהתאמה. באופן דומה, התוצאות של assay PCR מבוסס מהיר ניתן להעביר לרופאים פחות משעה 2 בעקבות הדו"ח של בקטרמיה. יחד, תוצאות אלו מראות כי ההכנה המהירה של גלולה חיידקי תרבית דם יש השפעה משמעותית על זמן זיהוי ותפנית AST ובכך על התוצאות המוצלחות של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

Introduction

זיהומים בדם ואלח דם בחולים מאושפזים הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. כך, תמותה הקשורים לזרם דם זיהומים הוא ציין ב% על 14 ל37% ממטופל מאושפז ועלולה להגביר 35% ביחידות לטיפול נמרצים לחולי ^1-3. זיהוי המהיר של הגורם המדבק הוא מרכזי שינחה את טיפול מיקרוביאלית אופטימלי ולהגדיל את התוצאה המוצלחת של ^4,5 טיפול האנטיביוטי. הניתוח המהיר של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יש כבר השפעה משמעותית על ההסתגלות של טיפול האנטיביוטי ^6,7 אבל זיהוי מדויק של הגורם המדבק נדרש לספק הטיפול האנטיביוטי המותאם הטוב ביותר לחולים. למשל, משטרי טיפול אנטיביוטי שונים צריכים להיות מיושמים, לאחר בקטרמיה עם Enterococci וסטרפטוקוקוס שקשה להבחין על ידי צביעת גראם. באופן דומה, זיהוי במיני לבאל דרוש כדי לאתר enterobacteria השלילי גרם קידוד גן ampC כרומוזומליות מקנות התנגדות מוגברת לβ-lactams ^8.

עם תרבית דם חיובית, הגישה לאבחון הקונבנציונלית היא תת הגורם המדבק על צלחות אגר שונות, אשר דורש כמה שעות של זיהוי לפני דגירה נוספת עם גישות שונות, כוללים בדיקות ביוכימיות, צמיחה בתקשורת סלקטיבית שונה ומערכות זיהוי חיידקים אוטומטיות. הזמן לתוצאות של גישת אבחון קונבנציונלית הוא של כ 1 עד 3 ימים.

הופעתה של טכנולוגית הלייזר desorption בסיוע מטריקס / ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסת יינון (MALDI-TOF) לזיהוי מהיר של מיקרואורגניזמים סיפקה כלי חדש כדי לזהות במהירות מיקרואורגניזמים ממושבות גדלו על צלחות אגר אלא גם ישירות מהדם חיובי תרבויות (איור 1) ^9-12. השימוש בדואר של MALDI-TOF לזהות גורם מזהם מתרביות דם צמצם באופן משמעותי את הזמן לתוצאות לכמה דקות במקום שעות וימים הנדרשים על ידי שיטות מסורתיות. כפי שנאמר על ידי Croxatto et al. ^13, את היעילות של זיהוי MALDI-TOF מסתמכת על פרמטרים שונים כולל טוהר של מיקרואורגניזם וכמות. שני קריטריונים אלו מתקבלים בקלות ממושבות דיסקרטיות גדלו על צלחות אגר אבל נדרשו טיפול קדם אנליטיים להעשרת חיידקים וטיהור מדגימות מורכבות כגון תרבות דם, אשר מכילות מרכיבים תאיים וחלבון מרובים שעלולים להפריע לזיהוי MALDI-TOF.

שיטות צנטריפוגה שיטות בידוד מיקרואורגניזמים שונים מתרבות דם כבר בשימוש במספר המחקרים כולל saponin או שיטת חומרי ניקוי עדין אחרת להפקת חיידקים ^9,14, שיטה מפריד בסרום ^10, תמוגה ¹² ופתרונות מסחריים כגון ערכת sepsityper. המעבדה לאבחון בקטריולוגיה פיתחה הכנת גלולה חיידקים בדם תרבות פשוטה המבוססת על כדורית אדומה-תמוגה אמוניום כלוריד המאפשר זיהוי מהיר של חיידקים ושמרים על ידי MALDI-TOF ומערכות זיהוי אוטומטי (איור 2) ^15. הכנת גלולה דם תרבות זו גם מספקת לדוגמה עבור יישומים במורד הזרם ישירים אחרים כגון צביעת גראם, בדיקות אבחון המבוססת על PCR אוטומטיים כגון POCT-PCRs לזיהוי המהיר של methicillin עמיד Staphyloccocus aureus (MRSA), ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה עם מערכות אוטומטיות AST ו / או על ידי מבחני דיפוזיה דיסק על צלחות אגר (איור 3).

בעבודה זו, אנו מתארים את השלבים השונים של הכנת גלולה חיידקים בדם התרבות כפי שהוסבר על ידי Prod'hom et al. ¹⁵ (איור 4). אנו גם דהסופר הפרוטוקולים עבור שלושה היישומים העיקריים שיכול להתבצע על גלולה תרבות דם: זיהוי על ידי ¹⁵ MALDI-TOF, זיהוי (ID) ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) עם המערכות האוטומטיות ¹⁶ לEnterobacteriaceae וstaphylococci וPCR- האוטומטי בדיקת אבחון המבוסס על זיהוי של MRSA ^17.

Protocol

פרוטוקול זה פותח ומאומתים הבא תהליכי המחקר ופיתוח וכללי אתיקה של המוסד שלנו לפני שמיושם ככלי שגרתי.

.1 הכנת תרבות הדם בקטריאלי גלולה ידי נוהל כלוריד כדורית אדומה-lysing אמוניום

1. הכנת תרבית דם חיובית לצנטריפוגה שלאחר מכן.
   1. לעקר את כובע תרבית דם. הוספת 70% אתנול בכובע של הבקבוק ולשרוף אותו.
      הערה: אל תבצע את הצעד הזה תחת הזרימה למינרית.
   2. הזז את הבקבוק לזרימה למינרית. לאסוף 5 מ"ל של תרבית הדם עם מזרק 20 G.
   3. הוסף 5 מ"ל של תרבית דם בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל מכיל 45 מ"ל של מים סטריליים (H ₂ O) ולערבב את המדגם.
2. הכנה של גלולה חיידקי תרבית דם על ידי צנטריפוגה תמוגה.
   1. צנטריפוגה המדגם XG ב 1000 ל10 דקות ב RT.
   2. רמוve supernatant (המכיל בעיקר H ₂ O ותאי דם) עם משאבת ואקום מעבדה.
   3. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של אמוניום כלוריד תוצרת הבית lysing פתרון (0.15 M NH ₄ Cl, 1 מ"מ KHCO _3). לשבור את הכדור על ידי גירוד ועל ידי vortexing הצינור צנטריפוגות המדגם ב140 XG ל10 דקות ב RT.
   4. בטל supernatant שמכיל בעיקר תאי דם אדומים פסולת.
      1. אם גלולה נותרה מדממת, resuspend גלולה ב2 מ"ל של H סטרילי והמזוקק ₂ 0 עד lyse נוסף תאי דם אדומים שיורית ולשטוף את הכדור. צנטריפוגה המדגם ב140 XG 10 דקות ב RT וזורקים supernatant.
   5. Resuspend גלולה ב200 μl של H ₂ O
3. תת תרבות דם על תקשורת אגר סלקטיבי ולא סלקטיבי שונים.
   1. לאסוף 1 מ"ל של תרבית הדם עם מזרק 20 G.
   2. לחסן 1 טיפה של int תרבות הדםo ארבעה רבעים על אגר דם, אגר שוקולד, אגר McConkey ואגר Schaedler.
   3. לדגור על 37 ° C אגר הדם וצלחות אגר שוקולד באווירה 5% CO _2, אגר McConkey באווירה רגילה והצלחת אגר Schaedler בתנאים אנאירוביים.
   4. עקוב צמיחת חיידקים על מדיה שונה.
   5. הגעה לטוהר חיידקים.

.2 זיהוי על ידי MALDI-TOF MS

1. זיהוי ישיר מגלולת הדם.
   1. העברת 1 μl של גלולה הדם על צלחת יעד MALDI ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס.
   2. כיסוי המדגם עם 1 μl 70% חומצה פורמית ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס.
   3. כיסוי המדגם עם 1 μl של מטריצת MALDI (רווי פתרון של α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה ב50% אצטוניטריל-2.5% חומצת trifluoroacetic) ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס.
   4. המשך MALניתוח DI-TOF MS עם מערכת MALDI-TOF MS כפי שתואר על ידי היצרנים.
   5. אם ציון ההזדהות אינו חוקי, ברמת המין (למשל עם ציון <2), לבצע הפקת חלבון של מדגם גלולה דם.
2. זיהוי לאחר מיצוי חלבון מגלולת תרבות דם.
   1. מערבבים 20 μl של גלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול ו צנטריפוגות ב XG 13,000 עבור 2 דקות ב RT.
   2. בטל supernatant ולהוסיף 25 μl של 70% חומצה פורמית ו25 μl של אצטוניטריל 100% לגלולה. וורטקס במרץ לresuspend את כדורים. Resuspend כדורים קשים על ידי פירוקם עם טיפים פיפטה לפני vortexing.
   3. צנטריפוגה ב13,000 XG למשך 2 דקות ב RT. העברת 1 μl של supernatant (המכיל חלבונים המופקים) על צלחת יעד MALDI ולתת לו להתייבש על פלטפורמת חימום 42 מעלות צלזיוס. המשך כמתואר ב2.1.2.

.3 בקטריאלי Identification ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה עם אוטומטית של מערכת מיקרוביאלית

1. הכנת השעיה חיידקים לזיהוי חיידקים וAST עם מערכת חיידקים אוטומטית.
   1. הכן צינור פלסטיק המכיל 3 מ"ל של 0.45% פתרון NaCl סטרילי תואם למערכת החיידקים האוטומטית.
   2. הוספת נפח מספיק של גלולה תרבות דם ב0.45% פתרון NaCl לקבל השעיה חיידקים המתאימה לעכירות מק 'פרלנד של 0.6-0.8. מדוד את העכירות באמצעות מכונה densitometer.
      הערה: הנפח של גלולה חיידקי תרבית הדם משתנה 50-200 μl להשיג עכירות מק 'פרלנד של 0.6-.8.
2. לחסן כרטיסים האוטומטיים גראם חיובי (GP) או גראם שלילי (GN) לזיהוי וכרטיסי AST האוטומטיים לבדיקת רגישות מיקרוביאלית של חיידקי Cocci גראם חיובי וגראם השלילי כפי שתואר על ידי היצרן.
   הערה: identification עם GP או כרטיסי GN אינו מיושם אם ערך ציון הזדהות MALDI-TOF MS הוא> 2. בדוק את טוהר של ההשעיה חיידקים על ידי subculturing ההשעיה חיידקים על אגר דם (GP וGN) וצלחות אגר MacConkey (GN).

.4 אנטיביוטי רגישות בדיקה על ידי Assay דיפוזיה דיסק

Assay דיפוזיה הדיסק מתואר על ידי הוועדה האירופית לבדיקת רגישות מיקרוביאלית (EUCAST, הגרסה 3.0, אפריל 2013, www.eucast.org).

1. הכנת השעיה חיידקים לבצע בדיקת רגישות מיקרוביאלית על ידי assay דיפוזיה דיסק.
   1. הכן שפופרת זכוכית המכילה 3 מ"ל של .0.9% פתרון NaCl סטרילי.
   2. הוספת נפח מספיק של גלולה תרבות דם ב0.9% פתרון NaCl לקבל השעיה חיידקים המתאימה לעכירות מק 'פרלנד של 0.5. מדוד את העכירות באמצעות מכונה densitometer.
      הערה: הנפח של תרבות הדםגלולה חיידקים משתנה 50-200 μl להשיג עכירות מק 'פרלנד של 0.6-.8.
   3. מערבולת ההשעיה החיידקים.
2. הרכבה של השעיה חיידקים על גבי אגר Mueller-Hinton (MH) או אגר אורגניזמים אגר אנין Mueller-Hinton (MHF) (MH בתוספת 5% דם defibrinated סוס ו20 מ"ג / L של dinucleotide אדנין β-Nicotinamide).
   1. טובלים מקלון צמר גפן סטרילי בהשעית החיידקים ולהסיר בעדינות את נוזלים עודפים על ידי הפיכת הספוגית על הקיר הפנימי של צינור הזכוכית.
   2. מורחים את ההשעיה החיידקים באופן אחיד על כל פני השטח של הצלחת אגר MH / MHF על ידי שטיפה בשלושה כיוונים או באמצעות מסובב צלחת אוטומטית.
3. יישום של דיסקים מיקרוביאלית על צלחות אגר מחוסנת.
   1. החל מקרוב הדיסקים על פני השטח של יבשות צלחות אגר מחוסנת באופן ידני או על ידי שימוש במתקן רגישות דיסק.
   2. דגירה את הצלחת על טמפה המתאימהrature ואווירה כפי שמתואר בשיטת דיפוזיה EUCAST דיסק בדיקת רגישות מיקרוביאלית (3.0 גרסה, אפריל 2013, www.eucast.org).

.5 האוטומטי PCR מבוסס בדיקת אבחון לאיתור של MRSA

1. באמצעות micropipette, להעביר 50 μl של גלולה תרבות דם לתוך הבקבוקון מגיב מדגם מסופק עם MRSA האוטומטי ערכת PCR מבוססת אבחון בדיקה ומערבולת במהלך 20 שניות.
2. באמצעות micropipette 1 מ"ל, לוותר המדגם ליציאת הדגימה של המחסנית. הכנס את המחסנית לתוך מערכת PCR האוטומטית ולהתחיל assay כפי שתואר על ידי היצרן.

תוצאות

במחקר שבוצע על ידי Prod'hom et al. ^15, כדורי חיידקים המתקבלים על ידי צנטריפוגה תמוגה אמוניום כלוריד של 122 תרבות דם חיובית מ78 חולים נותחו על ידי MALDI-TOF MS. מתוך 122 תרבות דם חיובית, 95 (77.9%) זוהו בצורה נכונה, ברמת המין ואחד (0.8%) ברמת הסוג. 26 כדורי תרבות דם הנותרים (21.3%) לא נתנ...

Discussion

בהשוואה לגישות אבחון תרבית דם החיובית קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים על ידי שימוש בגישת צנטריפוגה אמוניום כלוריד תמוגה לצמצם את הזמן לדווח זיהוי על ידי 16 עד 24 שעה והזמן לדווח AST ידי 24 עד 48 שעה (איורים 1 ו 3).

?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G needle	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar