接口3D工程神经细胞微电极阵列:一种创新<em&gt;体外</em&gt;实验模型

摘要

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

摘要

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

引言

体外二维（2D）神经耦合到微电极阵列（MEAs）的网络正像空通过研究神经元动力学和底层连接之间的相互作用黄金标准实验模型。在发展过程中，神经细胞再造的复杂网络，其显示效果也很好definedspatio，temporalpatternsof活性^1,2（ 即阵阵，网络阵阵，随机扣球活动）。多边环境协定记录的电生理活动从许多网站（从几十到几千微电极），使表达的动态在网络层进行详细的调查。另外，使用解离的培养物的不可能性使得设计工程-网络。这是比较容易用这种方式来理解和所记录的电生理活动之间的功能关系样细胞密度^3，模块化^4,5的程度，异构神经流行的存在的网络组织的参数ulations ⁶等。然而，所有在体外研究上解离的培养细胞是基于二维的神经元网络。这种方法导致过分简单化相对于所述体内 （本质三维，三维）系统:（i）在二维模型中，胞体和生长锥变平及轴突-树突生长不能散布在所有方向^7。 （二）2D 体外网络表现出刻板通过爆破涉及大部分的网络⁸的神经元的活动为主的电动力学。

最近，不同的解决方案已经开发了允许在体外构建3D解离的神经元网络。在共同的理念在于创造一个支架，其中神经元可以在一个三维的方式成长。这样的支架可以实现与聚合物凝胶和固体多孔基质^9-13通过利用聚合物的机械性能，有可能以嵌入内采取这些细胞Ë结构定义神经球¹¹的3D文化的统一块。这种方法的主要特征是神经球^9,12的刚性的机械性能。然而，这些材料具有有限的孔隙率，并且他们不保证基质内细胞迁移。为了克服这个缺点，一种可能的解决方案包括在切片矩阵变成'单元'的模块。不幸的是，颗粒的大小和形状的多样性会妨碍包装成规则的层状结构。 ^7，Cullen和同事设计内的生物活性细胞外基质为基础的支架由神经元和/或星形胶质细胞的神经元的三维结构。这种工程化神经组织允许在体外的调查研究和操作中的3D微环境的神经生物学反应。这个模型包括神经元和神经胶质细胞在整个细胞外基质（ECM）和/或水凝胶支架（500-600微米厚）分布的。在这种合作ndition，最佳细胞存活率（大于90％），发现通过在约3750的最终密度电镀细胞- 5000 ^细胞 / mm3。必须指出的是，这样的密度值小于一个在体内条件下，其中小鼠大脑皮质的细胞密度为约90000个细胞/ ^mm 3的¹⁴低得多。为了克服这个限制Pautot和同事¹⁵实现其中的细胞密度和网络连接被控制在体内条件类似于同时使网络的实时成像一个三维的体外系统 。实际上，该方法是基于解离培养的神经元是能够生长在硅胶上微珠的概念。这些珠子提供生长表面的神经元胞体坚持和他们arborizations成长，成熟，扩展和定义突触联系到其他神经元足够大。这种方法利用了单分散珠自发组装性能FORM 3D分层含不同层，不同的珠子神经元之间的约束连接神经元的不同的子集六角形阵列。用这种方法所达到的细胞密度为约75000个/ mm ^3。

最近，我们已适应Pautot的方法来多边环境^16:所获得的结果表明，该三维电生理学活性呈现比所述一个二维网络表示活动更宽剧目。 3D成熟的文化表现出增强的动态，其中两个网络的突发和随机秒杀活动并存。同样，汤-Schomer和同事¹⁷实现可维持原代皮层体外培养数月丝蛋白质基多孔支架，并通过一个钨电极的装置记录的电生理活性。

在这项工作中，实验步骤建立联接到多边环境三维神经元网络进行说明。

研究方案

实验方案是按照DL一千九百九十二分之一百一十六和热那亚（普罗特大学的指导方针获得了欧洲动物保护立法（2010年/ 63 / EU），由卫生意大利外交部。N. 13130​​，五月2011）。所作的所有努力减少动物项目的数量，并尽量减少他们的痛苦。

1.准备材料，并支持

1. 构建模具由CNC（计算机数控）磨粉机的方式来构建PDMS（聚二甲基硅氧烷）的约束。这种模具被实现在聚碳酸酯与聚四氟乙烯中央筒（PTFE）。这种材料允许容易提取荫罩一旦与PDMS已硬化。
   注:该模具的设计已经通过计算机辅助-设计（CAD）中进行，然后输送到数控铣床。
2. 准备PDMS弹性体。 PDMS是一种有机聚合物。它是由两个元件，固化剂和聚合物。通过1:10的体积比混合使用它们，一个部分固化剂，9份聚合物。把两种组分在培养皿，摇并插入真空室中的混合物10分钟，以消除气泡。 3克PDMS是足够的一个制约因素。
3. 构建PDMS约束。将PDMS材料进入成型机，并把它放入烤箱30分钟，在120℃。将PDMS约束具有理想缸筒用的22.0和3.0毫米，分别外部和内部的直径和650微米的高度的形状。
4. 电镀的前一天，夫妇由镊子的装置在立体显微镜下对掩模的微电极阵列（MEAs）中的有效区域和消毒的PDMS掩模在烘箱中在120℃。
5. 消毒玻璃微珠（40±2微米的标称直径; 42.3±1.1微米的认证平均直径）在70％乙醇处理2小时在锥形瓶中并旋转EVERY 30分钟，揭露所有的微珠。
6. 除去从管形瓶中的乙醇溶液和冲洗微珠两次用无菌水。
7. 调节所述MEA面积由PDMS掩模在0.05微克/毫升分隔（直径等于3.0毫米），24微升聚-D-赖氨酸层粘连蛋白和混合溶液的中心部分。
8. 外套与粘附蛋白，层粘连蛋白和聚-D-赖氨酸的微珠在0.05微克/毫升和离开他们过夜，在培养箱中在37℃，以获得稳定和持久的神经元网络。
9. 既从MEA的玻璃表面，并从该玻璃微珠除去粘附因子。抽吸用移液器涂布溶液的约95％，应用的无菌水的小体积 - 24μl-在MEA的表面。抽吸再次超过95％的水，让层流罩1小时下在MEA干镀细胞之前。
   注意:在微珠的情况下，而不是，吸出涂层溶液并进行第一次洗涤用无菌水，而第二个与基础培养基和其补充如B27，以调节所述的玻璃表面，其中神经元将被电镀。不要让微珠干。其保留在悬浮液中的小瓶内培养基中。
10. 分发，通过吸管-200μl-，处理微珠的悬浮液（32000）的方式到多孔板与膜插入（孔径0.4微米），他们将自组装形成均匀的一层。
11. 填充膜的每个孔与0.5培养基中，并把它放在孵化器（T = ^37.0℃，CO ₂ = 5％），直到神经元是准备镀（3.2）。

2.解剖胚胎和组织的解离

1. 房子成年雌性大鼠（200-250克）中的正则明暗时间表的恒定温度（22±1℃）和相对湿度（50％）（光7 AM-7 PM）中的动物设施。确保食物和水都是免费的。
2. 后用3％异氟醚18天发展（E18）麻醉怀孕的雌性大鼠。然后，通过颈椎脱位牺牲动物。
3. 从每个大鼠胚胎中取出海马并将其放置在冰冷的汉克的无^钙 ，镁平衡盐溶液^2+。在第18天发育海马和皮层组织的非常柔软，不需要被切成小块。进一步的细节可以发现^18,19。
4. 离解在含有DNA酶的0.05％为18-20分钟胰蛋白酶/汉克溶液0.125％的组织，在37℃。
5. 除去用巴氏吸管将上清液溶液并用5分钟加入培养基，用10％胎牛血清（FBS）停止酶消化。
6. 用FBS除去介质并用与它的补充，1％L-谷氨酰胺，庆大霉素10μg/ ml的培养基洗一次。用巴斯德点子除去再次介质ETTE并再次用生长培养基少量（500微升）与它的补充，1％L-谷氨酰胺，庆大霉素10μg/ ml的填充它。
7. 具有窄巴斯德吸管机械解离组织粒料直到细胞的乳状悬浮液是显而易见的。它没有必要离心细胞悬浮液。
8. 稀释小体积的细胞悬浮液与生长培养基，得到2.0 ml的终体积。计数与血球室所得到的细胞浓度。为了得到600-700个细胞/微升的期望的细胞浓度为5:稀释该浓度为1。

3.细胞电镀

1. 板的细胞以约2000个/ mm ^2的密度到MEA的有源区域，由PDMS约束定义来创建2D神经网络。
   注意:各海马包含约5×10 ^5个细胞中，（1×10 ^6，用于单个胚胎）。解剖6胚胎获得的6×10的总量^6细胞在2ml，和3000个细胞/微升的估计浓度。为了获得所需的细胞浓度和板大约600-700个细胞/微升5:稀释该浓度为1。如果在MEA面积由PDMS约束分隔为约7.065毫米^2，并铺板细胞总数600个细胞/微升×24微升= 14400细胞，2038个/ mm ²的最终密度。
2. 放置在MEA器件与湿润_的 CO 2气氛（5％）培养箱，在37℃。
3. 分发160微升的悬浮液用600-700个细胞/微升（约100,000个细胞）的细胞浓度到微珠单层放置在多孔板内的表面，以完成三维培养的结构的初步步骤。把多孔板在培养箱加湿_的 CO 2气氛（5％），在37℃。

4. 3D神经元网络建设

1. 6-8小时的电镀后，从多孔板非常仔细转移悬浮液（微珠与神经元的）分隔由PDMS约束通过使用移液管为约30-40微升的体积设置的区域内。每次传输后，等待半分钟左右，以使微球自组装的六边形结构紧凑。
2. 一旦所有的层被沉积并自发地聚集，填充用一大滴的约300微升培养基由PDMS约束限定的区域的顶部。
3. 把耦合到MEA的3D结构中的保育箱（T = ^37.0℃，CO _{2 =} 5％）48小时加入生长培养基培养物的最终体积（约1毫升）与它的补充之前。
   注意:考虑的珠子上的多孔板与膜插入件（30,000）和珠上的单一层上的MEA装置（6000）的数量的总数。将所得的三维结构是由5层英里的crobeads和细胞。考虑到所述三维神经网络不完美几何，所得到的三维结构可以由5-8层。
4. 在天铺板后，小心地添加培养基（约900微升）在MEA环内的最终体积。保持在湿润_的 CO 2气氛（5％）的3D培养，在37℃下进行4-5周。更换每周一次培养基的一半。

5.共聚焦显微镜采集

1. 固定的生物样品，以在支架的显微镜阶段。设置激光（氩，496-555纳米），扫描速度（400赫兹），在此获得PMT的图像，所述增益和偏移（-0.3％）为每个图像捕获正确的带宽发射滤波器，并为了以避免饱和，并提高信​​噪比。结果部分报告用于获取图4的图像值。
2. 对于此次收购的 Z -stack序列，冷杉圣选择，顶部和样品的底层的z位置的值，然后选择步长，使采集。

结果

在此实验过程中，相应的作用是通过定义机械支架的三维神经网络的生长微珠起到图1A和B显示了微珠（排列的40±2微米的标称直径;认证平均直径42.3±1.1微米），在平面中。这种结构的特点是，微珠自发自组装限定紧凑六角形形状（图1B 和C）。如此生成的支架保证了持续增长的表面突起和胞体的代谢交换足够大的空隙空间。这种微珠的尺寸被证明是一个合理的...

讨论

在这项工作中，一个新的实验体外平台由三维设计的耦合到多边环境为网络电已提交的神经元培养物。使用微珠为支架，以允许沿 z轴的神经炎生长已针对与平面MEA被集成。以这种方式，所得到的微系统导致有效和可靠的体外三维模型来研究所述紧急电动力学^16。

MEA记录的建立

MEA设备包括一个文化室的底物嵌入式微电极能够?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5mg/liter
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1gr Glass Part.Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L