In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l'AC-6 Alimentatore Sistema

Riepilogo

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Abstract

Cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono di tipo potente che interferone (IFN-I) che producono cellule che si attivano in risposta a infezioni o durante le risposte infiammatorie. Purtroppo, studio della funzione pDC è ostacolato dalla loro bassa frequenza in organi linfoidi, e metodi esistenti per la generazione vitro DC prevalentemente favoriscono la produzione di CDC sopra pDC. Qui vi presentiamo un approccio unico per generare efficientemente pDCs da progenitori linfoidi comuni (CLPS) in vitro. In particolare, il protocollo ha descritto i dettagli come purificare CLPS dal midollo osseo e generano pDCs da coculturing con AC-6 cellule di alimentazione gamma-irradiati in presenza di Flt3 ligando. Una caratteristica unica di questo sistema di coltura è che i CLPS migrano sotto le celle AC-6 e diventano cellule territoriali che formano acciottolate, un passaggio fondamentale per l'espansione pDCs. DC morfologicamente distinte, vale a dire PDC e CDC, sono stati generati dopo circa due settimane con una composizione di 70-90% pDCs in condizioni ottimali. Tipicamente, il numero di pDC generati da questo metodo è circa 100 volte del numero di CLPS seminati. Pertanto, questo è un nuovo sistema con cui generare robusto il gran numero di pDC necessarie per agevolare ulteriori studi sviluppo e la funzione di queste cellule.

Introduzione

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene professionale che svolgono un ruolo importante nel controllo risposte immunitarie ^1. Mentre DC sono eterogenei, possono essere classificati in due popolazioni, DC convenzionale (CDC) e cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) ^2,3. Oltre agli organi linfoidi, CDC e pDCs si trovano anche in tessuti tra cui polmone, intestino, pelle e ^2. La morfologia di CDC e pDCs differenzia, con CDC espositrici proiezioni dendriti-simili e la forma di pDCs essere più plasma alveolare. Inoltre, il marcatore DC comune topo, CD11c, è più altamente espresso su CDCS che su pDC. Inoltre, CDC può essere ulteriormente suddivisa in CD11b ⁺ CD24 ^- CDC e CD11b ^- CD24 ⁺ CDC, entrambi i quali esprimono alti livelli di MHC di classe II e molecole costimolatorie di fare pDCs ^2. PDC mature, d'altra parte, hanno mostrato di esprimere selettivamente Siglec-H e BST2 ^4. Functionally, CDC sono antigene migliori presentano cellule rispetto sono pDCs; tuttavia, pDCs in grado di produrre una grande quantità di interferone di tipo I dopo l'infezione da virus o la stimolazione infiammatoria ^5.

Entrambi i CDC e pDCs sono di breve durata, e di conseguenza, devono essere costantemente rifornite da progenitori all'interno del midollo osseo ^(BM) 6,7. Trasferimento adottivo di progenitori comuni mieloidi (CMP) e progenitori linfoidi comuni (CLPS) in topi irradiati letalmente dimostra che i CDC e pDCs possono essere generati da entrambe le linee ^8-10. Tuttavia, vi è un sottoinsieme di pDC che esprimono RAG1 / 2 e possiedono segmenti DJ riarrangiati al locus IgH ^11,12. Queste cellule condividono anche analogie molecolari con linfociti B, tra cui l'espressione del marcatore B220, recettori dell'acido nucleico-sensing (TLR7 / TLR9), e fattori di trascrizione (SPIB e BCL11A) ^13, dispone di tutto che si ritiene essere le firme del lignaggio linfoide. Pertanto, CLPs possono essere buone scelte per la generazione in vitro di pDCs causa di lignaggio somiglianza.

Mentre la frequenza sia CDC e pDC negli esseri umani e nei topi è molto basso ^6, DC, particolarmente CDC, può essere generato in vitro da BM o progenitori in presenza di citochine quali GM-CSF o ^11,14 Flt3 ligand (FL ) utilizzando sistemi privi di alimentazione ^11,15,16. Purtroppo, però, non è possibile produrre un gran numero di pDC in vitro su FL ^11,15,16. In precedenza abbiamo dimostrato che pDCs possono essere efficacemente generati in vitro da CLPS utilizzando il sistema ¹⁷ AC-6 alimentatore. Il vantaggio di usare la linea cellulare stromale AC-6 nel sistema di coltura è che fornisce il contatto cellula-cellula e la secrezione di citochine che supportano la generazione di un gran numero di pDC da CLPS. Anche se la produzione con questo sistema è molto robusto, attento replica delle procedure descritte di seguito i è necessariol fine di garantire la generazione efficiente di pDCs.

Protocollo

C57BL / 6 topi wild-type sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Tutti i topi sono stati allevati e tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici. Protocolli e le procedure di utilizzo degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale della National Taiwan University College of Medicine (Permesso Numero: 20.120.075). Inoltre, i ricercatori fatto ogni sforzo per ridurre il potenziale di dolore, la sofferenza, l'angoscia negli animali durante l'esecuzione di esperimenti. Tutte le procedure descritte sono state effettuate a temperatura ambiente con i guanti.

1. Preparazione di 6-AC cellule feeder

Nota: L'AC-6.21 (AC-6 in breve) linea di cellule stromali ¹⁸ (fornito da I. Weissman, della Stanford University) deve essere mantenuta in RPMI integrato con siero fetale bovino inattivato al calore del 15% (FBS). Per servire come cellule di alimentazione, AC-6 celle sono γ-irradiati con 3000 rad (30Gy) un giorno prima della co-coltura per evitare la loro proliferazione. Nota thAC-6 celle tendono a perdere la loro capacità differenziazione sostenere se lasciato sovraffollate durante la manutenzione, o se il loro numero passaggio è superiore a 20.

1. Lavare AC-6 celle una volta con 1 ml di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e rimuovere DPBS per aspirazione. Trattare AC-6 cellule con 0,8 ml di soluzione di tripsina (0,05% tripsina e EDTA 0,5 mM in DPBS) per 3-5 minuti ^a 37 ° C, 5% CO ₂ e quindi arrestare la reazione diluendo con 10 volumi di mezzo di coltura a fare sospensione singola cellula.
2. Seme AC-6 celle a 5.9x10 ⁴ cellule / pozzetto in piastre da 12 pozzetti e incubare ^a 37 ° C, 5% di CO _{2 O} / N.
   Nota: La densità di AC-6 celle è molto importante in quanto una densità inferiore favorirà generazione CDC. Semina ad una densità di 5.9x10 ⁴ cellule / pozzetto permetteranno AC-6 per raggiungere confluenza entro il giorno successivo, che è ottimale per la derivazione di pDCs da CLPS.
3. Irradiare AC-6 celle a 3000 rad (30 Gy) con γ-irradiatore.
   Nota: La dose utilizzata per irradiare AC-6 è ottimizzato per evitare che le cellule proliferazione e tuttavia mantenerli vitali sufficientemente lungo da assicurare le citochine e contatto cellula-cellula necessari per la differenziazione delle DC da CLPS.
4. Aspirare media e sostituirlo con 1 ml RPMI completo (RPMI con 10% di calore inattivato FBS, 50 mg / ml di gentamicina e 50 micron β-mercaptoetanolo).

2. Isolare BM cellule da topi

1. Sacrifica topi di CO ₂ asfissia e dislocazione cervicale. Posizionare i topi su un vassoio dissezione e sterilizzare con il 70% di etanolo. Fare un'incisione a metà addome e rimuovere la pelle dalla parte distale del mouse compresa la pelle che copre le estremità inferiori.
2. Sezionare topi in una cappa semi-sterile. Per rilasciare il femore e tibia, femore agganciare sopra e tibie sotto del ginocchio. Staccare i muscoli dalle ossa con le forbici e posto le ossa in una capsula di Petri 6 centimetri contenente 5 ml RPMI completare.
3. Spostarsi in una cappa di coltura sterile. Riempire una siringa da 3 ml collegata ad un ago 27G con RPMI completo. Tagliare entrambe le estremità delle ossa con le forbici, e inserire l'ago 27G per irrigare il midollo dalle ossa iniettando delicatamente RPMI completo una volta da ogni estremità.
4. Preparare una singola sospensione cellulare delicatamente pipettando le cellule su e giù per 3-5 volte in piatto cultura con la siringa senza ago.
5. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg e decantare il surnatante.
6. Lisare globuli rossi con 1 ml di tampone di ACK (150 mm NH _{4 Cl,} 10 KHCO _mm 3, 0,1 mM EDTA) incubazione per 1 min e fermare la reazione diluendo con 10 volumi di RPMI completo. Consentono alle cellule riposare per 5 min per pellet giù grumi di cellule morte e detriti di tessuto per gravità.
   Nota: non stare in piedi più di 5 min come questo si tradurrà in una perdita di cellule a causa della sedimentazione di cellule vitali.
7. Lentamente decantare il surnatante cellulare contenente un nuovo tubo lasciando detritidietro nel tubo originale.
8. Centrifugare per 5 minuti a 500 xg per far sedimentare le cellule, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
9. Risospendere le cellule totali BM (tipicamente 4-6 x 10 ⁷ cellule BM sono ottenuti da un topo) in 100 microlitri tampone FACS (PBS 1x + 2% FBS + 1 mM EDTA).

3. FACS Analisi e ordinamento di CLPS

1. Aggiungi anti-CD16 / 32 (ibridoma supernant clone 2.4G2, 50 ml / reazione o 1-2 mg / reazione) in cellule in tampone FACS (passo 2.9) per 1-2 minuti, al fine di bloccare i recettori Fc.
   Nota: Anti-CD16 / 32 è anche chiamato blocco Fc, che si aggiunge a prevenire legame non specifico degli anticorpi di cellule esprimenti recettori Fc, tra cui i granulociti, monociti e linfociti B.
2. Contemporaneamente colorare le cellule con i seguenti anticorpi fluorescenti colorante marcati (per 4x10 ⁷ cellule) per 15 min in ghiaccio, evitando luce ambientale. Anticorpi: marcatori lignaggio PE-coniugati (0,2 mcg ciascuna) tra cui anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), e anti-MHC-II (NIMR-4), 0.2 mg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 mg anti-Sca-1-FITC (D7), 0.4 mg anti-M-CSFR-APC (AFS98), e 0,2 mg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
3. Lavare le cellule con 3 ml di tampone FACS, e centrifugare per 5 min a 500 x g.
4. Risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS e celle filtranti attraverso un colino cella di 40 micron.
5. Lavare il tubo con un 100 microlitri di buffer FACS aggiuntivo per recuperare tutte le cellule residue e filtrare in un FACS sterile ordinamento tubo con la stessa colino cella.
6. Eseguire immediatamente citometria a flusso dopo la colorazione utilizzando filtri e tensioni appropriati per il rilevamento del segnale. Utilizzare 488 nm laser per rilevare gli anticorpi FITC, PerCP-Cy5.5-etichettati, 561 nm laser per rilevare il PE e PE-anticorpi Cy7-labelded e 633 nm laser per rilevare l'anticorpo marcato APC.
7. Classificare CLPS secondo i seguenti marcatori lin ^- c-kit ^int Sca-1 ^int M-CSFR ^- IL-7Rα ⁺ (come macchiato al punto 3.2) utilizzando un cell sorter. Raccogliere le cellule ordinati in una provetta da 15 ml contenente 8 ml di RPMI completo come un cuscino.
8. Registrare il numero assoluto di cellule ordinati come mostrato dalla cell sorter alla fine della corsa. Tipicamente, 5x10 ⁴ CLPS possono essere ottenuti dal BM di un topo.

4. coculture CLPS e AC-6

1. Centrifugare le cellule ordinati dal punto 3.7 per 10 minuti a 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con abbastanza completo RPMI per ottenere una densità cellulare intorno 5x10 ⁴ cellule / ml. Seed 500 cellule / pozzetto in 12-pozzetti contenenti cellule di alimentazione previste al punto 1.4.
2. Aggiungere 100 ng / ml FL ¹⁹ (hu-Flt3L-Ig generato internamente utilizzando un sistema di espressione fornita da M. Manz, University Hospital Zurigo, Svizzera) e incubare ^a 37 ° C, 5% CO _{2 con} controllo visivo periodico di sviluppo DC al microscopio.
   Nota: disponibile in commercio FL umana ricombinante o il mouse FL può essere utilizzato come un sostituto per hu-Flt3L-Ig per sostenere lo sviluppo continua.
3. Raccogliere le cellule nel supernatante a giorno 12 e lavare i pozzetti una volta con 0,5 ml di terreno RPMI completare combinando sovranatanti risultanti. Aggiungere 0,5 ml di mezzo fresco e rottami le cellule aderenti con un raschietto cellulare.
4. Combinare il mezzo cellulare contenente da entrambe le parti e centrifugare per 5 min a 500 x g.
5. Surnatante e risospendere le cellule decantare in 50 microlitri di buffer FACS. Aggiungere 50 microlitri anti-CD16 / 32 ibridomi surnatante e incubare per 1-2 minuti per bloccare i recettori Fc.
6. Enumerare e macchia tutte le celle con i seguenti anticorpi (0,05 mcg ciascuna) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE.
7. Lavare e centrifugare le cellule come descrivered al punto 3.3.
8. Risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer FACS, cancello CD11c ⁺ e analizzare per CDC (CD11c ⁺ CD11b ⁺ B220 ^-) e pDCs (CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ^{+) 17.}

Risultati

Un totale di ⁷ 4-6x10 cellule BM sono in genere isolate da femori e tibie di un 6-8 sett-vecchio, wild-type C57BL / 6 del mouse. Per risolvere CLPS, cellule totali BM sono colorate con anticorpi coniugati PE contro marcatori lignaggio (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, e MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-Cecoslovacchia-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizzati e ordinati con un cell sorter. La strategia di ordinamento per CLP è mostrato in Figu...

Discussione

Qui si descrive un sistema in vitro in coltura per la robusta generazione di DC, e pDCs in particolare, da un piccolo numero di CLPS. L'unicità di questo sistema di coltura è dovuto all'uso di AC-6 cellule, una linea cellulare stromale, come alimentatori. Questo approccio ha dimostrato di fornire non solo le citochine, come IL-7, SCF, M-CSF e FL ^20, ma anche il contatto cellula-cellula ²¹ necessario per sostenere lo sviluppo DC. AC-6 cellule sono state usate in precedenza per fac...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5	Biolegend	108408	linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136	Biolegend	108708	linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70	Biolegend	101208	linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3	Biolegend	115508	linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2	Biolegend	103208	linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2	Biolegend	100308	linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7	Biolegend	100707	linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4	Biolegend	107608	linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119	Biolegend	116208	linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51	eBioscience	12-0900-83	linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98	Biolegend	135510	FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8	Biolegend	105824	FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7	Biolegend	108106	FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34	Biolegend	135014	FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418	Biolegend	117328	FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70	Biolegend	101206	FACS
FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
FACS sorting tube	BD Biosciences	352054
FlowJo	FlowJo LLC		Flow analysis sofrware