포유 동물 세포에서 초기 DNA에 바인딩 단백질의 시험 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여

요약

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

초록

히스톤 데 아세틸 라제 1 및 2 (HDAC1,2)는 DNA 복제의 사이트 지역화. 이전 연구에서, 선택적 억제제 및 유전자 녹다운 시스템을 이용하여, 우리는 복제 포크 진행 및 포유 동물 세포의 초기 염색질 HDAC1,2 유지에 대한 새로운 기능을 보였다. 또한, 우리는 슬롯 오 점 브로 모 옥시 우리 딘 (BrdU의) 표지 된 DNA의 염색질 면역 침전 (칩)을 결합과 서양의 정량적 초기 DNA와 관련된 단백질 또는 히스톤 변형을 측정하는 분석 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용했다.

적극적으로 분열하는 세포는 HDAC1,2 선택적 억제제로 치료 또는 HDAC1과 Hdac2에 대한 siRNA를 형질 도입 한 후 새로 합성 된 DNA는 티미 딘 아날로그 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)으로 표시 하였다되었다. 유의 한 세포주기 정지 또는 세포 자멸사가 없을 때의 BrdU 라벨링 인해 HDAC1,2 기능 상실 시점에서 이루어졌다. 다음 LBrdU의 히스톤 아세틸 마크, 크로 마틴 면역 (칩) 또는 염색질 인부와 세포의 abeling 특정 항체로 하였다. BrdU의 표지 된 DNA 입력 및 면역 침전 (또는 ChIPed) DNA는 슬롯 블랏 기술을 이용하여 막에 발견하고 UV를 이용하여 고정화시켰다. 각각의 슬롯에있는 초기 DNA의 양을 정량적으로는 항 BrdU의 항체로 웨스턴 분석을 사용하여 평가 하였다. 새로 합성 된 DNA 관련 히스톤의 아세틸 마크 및 염색질 인부의 레벨에 HDAC1,2 기능의 손실 효과는 대조 시료에 처리 된 시료로부터 얻어진 BrdU의 칩 신호를 정규화하여 측정 하였다.

서문

결함 DNA 수리 및 / 또는 DNA 복제는 세포 사멸을 유발할 수 게놈 불안정성의 주요 원인이다. 단일 수리되지 않은 이중 가닥 나누기 세포 사멸 원인 ^1에 충분하다. 염색질 조직은 일시적으로 모두 복제시 변경 및 ^2,3를 복구하고, 이러한 프로세스 무결성 게놈에 위협을 초래할 것 중에 후생 유전 학적 정보를 유지하기 위해 실패한다. HDAC3 또는 HDAC1,2 기능의 손실 유전자 독성 스트레스 (DNA 손상) 및 세포 사멸 ^4-9로 이어지는 S 상 진행, DNA 복제 및 수리를 방해한다. 따라서, 암 세포에서 복제, 보수 및 염색질을 방해 차례로 성장을 중지하고 급속 성장하는 암세포에서 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 DNA 손상을 유발하도록 선택 HDAC 억제제를 사용하는 실제적인 전략이다.

DNA 복제 동안 염색질 빠르게 분해 한 다음 DNA 복제 다음 조립. 새로 SYnthesized 히스톤 H4는 염색질에 K5와 K12 잔류 물 (H4K5K12ac) 및 다음 증착에서 아세틸, 그들은 빠르게 히스톤 아세틸 라제 (HDACs) ^{10, 11에} 의해 탈 아세틸된다. 히스톤 탈 아세틸 화하여 초기 염색질의 무결성을 유지하기 위해 세포의 실패는 결과적으로 DNA 손상 및 세포 사망을 초래할 수 포크 붕괴로 이어질 수 있습니다. 우리는 최근, HDAC1,2의 선택적 억제가 증가 히스톤 아세틸 화 (H4K5ac, H4K12ac 및 H4K16ac) 감소 된 복제 포크의 진행과 관련이 초기 염색질에 SMARCA5 염색질 인부 활성을 억제하는 것으로 나타났다 포크 붕괴를 증가 및 복제 스트레스에 의한 DNA 손상 ^(6)을 증가 . 그러므로, HDAC 억제제 치료 빠르게 이러한 세포주기로서, 암세포에서 매우 빠르게 DNA 손상 및 사망을 유발과 S 상을 통해 여러 번 통과하는 초기 염색질 구조를 변경할 수있다. 그것은 HDACs는 히스톤 아세틸 화 단백질 BINDI을 조절하는 기능을하는 방법을 이해하는 것이 중요하다NG는 포유 동물 세포에서 DNA 복제를 유지한다.

정량적으로 히스톤 아세틸 화와 DNA 복제시 초기 DNA와 관련된 SMARCA5 염색질 인부의 양을 측정하기 위해, 우리는 수정 된 칩 분석이 BrdU의 칩 슬롯 지방 기술이라고 고안했다. 슬롯을 이용하여 막에 원하는 단백질 또는 히스톤 변형 염색질 면역 침전 (칩) 다음, 초기 DNA의 양의 BrdU 표지 된 칩 DNA의 웨스턴 분석을 이용하여 검출 할 수있다 칩 샘플 (티미 딘 유사체의 BrdU를 사용하여 표지)를 전송 오 장치. 이 기술을 사용하여, 우리는 H4K16ac (염색질 포장에 관련된 표시) 및 ISWI의 가족 SMARCA5 (염색질의 SWI / SNF 관련 매트릭스 관련 굴지 의존 레귤레이터) 염색질 인부가 S 상 세포에서 초기 DNA와 연관되어 있음을 보여 주었다 ^6. 우리는 또한 초기 H4K16ac 표시가 DNA 복제 ^6시 HDAC1,2에 의해 탈 아세틸 것으로 나타났습니다. H4K16ac의 억제ISWI의 가족 SMARCA5 ^(12)의 크로 마틴 인부 활동. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여, 우리는 DNA 복제시 염색질 리모델링을 조절하는 HDAC1,2의 기능을 연결할 수 있습니다. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 - 서쪽 오점 기술은 정량적으로 초기 DNA에 결합되어 단백질 또는 번역 후 변형의 연결 및 분리 역학을 측정 할 수있는 강력한 방법입니다.

프로토콜

BrdU의 레이블 다음 1. 염색질 면역 (칩)

1. DMSO 또는 HDAC1,2 선택적 억제제 중 하나의 존재 하에서 배양 NIH3T3 세포는 이전에 기술 된 바와 같이 ^6.
2. DMSO 또는 HDAC1,2 선택적 억제제로 치료에 따라, 멸균 조직 문화 후드에있는 세포에 BrdU의를 추가합니다. 멸균 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 60 분 동안 브로 모데 옥시 우리 딘의 20 μm의 최종 농도 (BrdU의) 10 ml의 NIH3T3 미디어에 도금 2 × 10 ⁶ NIH3T3 세포를 품어.
3. 1 %의 최종 농도로 배양 배지에 직접 포름 알데히드를 첨가하여 DNA에 가교 결합은 세포 내 단백질. 진탕 기에서 10 분간 실온에서 포름 알데히드와 2 × ¹⁰⁶ NIH3T3 세포를 배양한다.
4. 125 mM의 최종 농도로, 글리신의 첨가에 의해 가교 급랭. 쉐이커에 5 분 동안 실온에서 품어.
5. 용지를 제거하고 15 ml의 원심 분리기 튜브에 PBS에 세포를 수집합니다. 스핀 CEL4 ℃에서 5 분 동안 956 XG에 LS. 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세포 펠렛을 씻으십시오. 튜브에서 PBS를 제거합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 PBS (뜨는)없이 가교 세포 펠렛을 저장합니다.
6. 500 μL의 FA140 버퍼를 첨가하여 가교 결합 된 세포 펠렛으로부터 분해물을 제조 (50 HEPES KOH mM의 pH가 7.5의 NaCl 140 mM의, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100, 0.1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트) 프로테아제 억제제 칵테일로 보충.
7. 샘플 35 %의 전력에서와 15 초 펄스로 5 회에 0.9 초, 0.1 초 Off 설정을 초음파 처리하여 염색질 전단. 샘플의 가열을 방지하기 위해 초음파의 매 라운드 후 얼음에 튜브를 유지합니다.
   1. 다른 sonicators 사이에 달라집니다 전단 효율성 DNA 젤에 전단을 확인합니다. 초음파를 확인하려면, 0.16 M의 농도로 염화나트륨을 첨가하여 가교 역 및 단계 1.17.1를 수행합니다. - 1.22. 실행 전단인지 확인하는 1.5 % 아가 로즈 겔상에서 DNA를 10 ㎕의 용출500 BP의 평균 강도 BP 300-700 사이.
8. 4 ° C에서 17,949 XG에 10 분 동안 초음파, 원심 분리기 샘플에 따라 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
   1. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질의 추정을 수행. 제어 및 실험 샘플 칩 해물의 동일한 양을 사용합니다. 일반적으로, 칩 반응 당 총 해물의 1 밀리그램을 사용합니다.
9. 프로테아제 저해제 칵테일을 포함 FA140 버퍼를 사용하여 단백질 A 아가 로스의 50 % 슬러리를 제조. 프로테아제 억제제 칵테일의 1/10 볼륨을 추가합니다. 총 샘플들의 수에 기초하여 필요한 비드의 체적을 계산한다.
   1. FA140 버퍼 씻을 단백질 - 아가로 오스 비즈 두 번 저장 버퍼를 제거하고 50 %의 슬러리를 만들기 위해 구슬로 FA140 버퍼에 동일한 볼륨을 추가 할 수 있습니다.
   2. 비 특이 비드에 결합 된 단백질을 제거 단백질 - 아가 및 50 %의 슬러리를 50 μL를 추가하려면30 분 동안 로티 세리 혼합기에서 일정한 엔드 오버 엔드로 회전을 4 ° C에서 샘플들을 cubate.
10. 분 동안 4 ° C에서 956 XG에서 샘플을 스핀. 상층 액을 수집하고 8 μL H4K16ac 항체 또는 상층 액을 1 ㎎ / ㎖ SMARCA5 항체의 5 μL (5 μg의)를 추가하여 면역을 수행합니다. 불고기 믹서에 일정 엔드 오버 엔드 회전 4 ° CO / N에 품어.
11. '입력'컨트롤에 대한 추출물의 1 / 10을 저장하고 옆으로 -20 ° C에서 설정합니다. 입력은 IP 샘플과 함께 가교 역방향 할 필요가있다.
12. 음성 대조군 면역 샘플로 토끼의 IgG의 동일한 양 (1 ㎎ / ㎖의 5 μL)를 사용합니다.
13. 다음날, 추출물 50 % 단백질 - 아가 로스 슬러리의 50 μL를 추가 한 4 회전 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
14. 4 ℃에서 2 분 동안 956 XG에서 원심 분리하여 아가 로스 비드 펠렛, 조심스럽게 상층 액과 워싱턴을 제거순차적으로 다음 버퍼로 구슬을 쉬. 버퍼 준비에서 바로 사용하기 전에 프로테아제 억제제를 추가합니다.
    1. 낮은 소금 면역 복합체 세척 버퍼로 세척 (FA140, pH가 7.5 HEPES KOH의 50 mm의 최종 농도의 NaCl 140 밀리미터, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의)에 대한 엔드 오버 엔드 회전 4 ℃에서 5 분.
    2. 높은 소금 면역 복합체 세척 버퍼로 세척 (FA500, pH가 7.5 HEPES KOH의 50 mm의 최종 농도의 NaCl 500 밀리미터, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의)에 대한 엔드 오버 엔드 회전 4 ℃에서 5 분.
    3. LiCl을 면역 복합체 세척 버퍼 엔드 오버 엔드 회전 4 ° C에서 5 분 (트리스 (CL)의 pH 8.0, LiCl이 250 밀리미터, 0.5 % NP40 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의 10 mm의 최종 농도)로 세척.
15. 전술 한 바와 같이 세척을 따르면, 200 ㎕의 용출 용액 incubat (1 % SDS, 100 mM의 중탄산 나트륨을 최종 농도)을 추가RT에서 엔드 오버 엔드 회전에 실온에서 15 분 동안 전자.
16. 실온에서 956 XG에서 샘플을 스핀과 새로운 1.5 ML 튜브에 용출액을 전송합니다. 추가 200 μL 용출 용액과 단계를 반복 1.15.
17. 용출액을 400 μL, 0.16 M의 염화나트륨 농도를 넣고 잘 섞는다.
    1. 또한, 별도로 설정 입력 된 10 μL (단계 1.11)에 400 μL의 용출 용액을 추가 할뿐만 아니라 가교 입력 샘플들을 역의 0.16 M 농도의 NaCl을 추가한다. 5 시간 동안 65 ° C의 수조에서 배양함으로써 샘플을 가교 역방향.
18. 역 가교 용출액에 100 %의 EtOH 1 ML을 추가합니다. 잘 믹스 2 -80 ° C에서 부화 - 3 시간 또는 -20 ° CO / N에서. 15 분 동안 17,949 XG에서 샘플을 스핀과 에탄올을 버린다.
19. 펠렛을 씻어 800 μL 70 % 에탄올을 추가합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 17,949 XG에 스핀과 에탄올을 버린다. 잔여 에탄올을 제거하기 위해 간단히 스핀. 1, 37 ° C에서 샘플을 공기 - 건조0 분 잔류 에탄올을 제거합니다.
20. 90 μL RNA 분해 효소의 DNA와 DNase를 무료로 물을 용해 및 0.2 ㎎ / ㎖ 최종 농도 2 μL 10 ㎎ / ㎖의 RNase를 추가합니다. 30 분 동안 물을 욕조에 37 ° C에서 품어.
21. 10 ㎕의 10 배 테 K 버퍼 (100 mM 트리스 - CL 산도 8.0, 50 mM의 EDTA의 pH 8.0, 5 % SDS)를 추가합니다. 잘 혼합하고 1 시간 동안 42 ℃에서 1 μL 테 K. 품어을 추가합니다.
22. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 PCR 정제 키트를 사용하여 입력 칩 DNA를 정제하여, 50 μL의 물을 용출 DNA. 더 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 DNA.

2. 슬롯 칩 DNA의 얼룩 분석

1. 280 nm의 분광 광도계를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 단계 1.22에 기재된 바와 같이 50 μL의 물에 용출 입력 DNA 칩의 수율을 측정한다.
2. 검출의 선형 범위 내에있는 입력의 동일한 볼륨 (50 μL) 또는 면역 DNA를 가져 가라.
   1. 예를 들어, 입력DNA의 수율은 1.5 NG / μL가, 다음 (총 DNA 겨 45) 30 μl를 타고 물 50 μL에 볼륨을 만들 수 있습니다. 인자 칩, 2.1 단계에서 전체 50 μL의 용출액을 2.3 단계로 진행합니다.
3. 0.4 N NaOH를 짧게 소용돌이 10 초 동안 956 XG에 대한 원심의 2.5 볼륨을 추가하여 50 μL 입력 또는 면역 DNA를 변성하고, 실온에서 30 분 동안 품어.
4. 10 초 동안 956 XG 1 M 트리스 - 염산 175 μL, 산도 6.8, 소용돌이, 원심 분리기를 추가하여 변성 된 DNA를 중화하고 얼음에 샘플을 배치합니다.
5. 후술하는 바와 같이 슬롯 블롯 분석을 위해 입력 용액을 희석하고 면역 DNA를 준비한다.
   1. 단계 2.3에 따라 - 350 μL의 총 샘플 볼륨을 얻기 위해 2.4 (즉, 50 μL 입력 / 칩 DNA, 125 μL를 0.4 N NaOH를 175 ㎕의 1 M 트리스 - 염산, pH를 6.8).
      참고 : 인스턴스가 위에서 언급 한 내용은, 입력 DNA의 45 NG가 0.129 NG / μL 끝나게됩니다.
   2. 입력 DNA를 들어, 세 개의 튜브에 라벨을S 100, 50, 25, 100 μL, 50 μL 및 변성 및 중화 DNA 샘플의 25 μl를 추가로. 뉴 클레아없는 물 100 μL에 최종 볼륨을 확인합니다. 칩 DNA, 라벨 200, 100, 50, 200 μl를 추가로 세 개의 튜브, 100 μL 및 변성 및 중화 DNA 샘플의 50 μL. 뉴 클레아 무료 물 200 μL에 최종 볼륨을 확인합니다.
6. 슬롯 얼룩 장치의 크기로 막 잘라. 전에 20 배 SSC의 막과 블로 팅 서류를 사전 적시고 DNA를 추가하기 전에. 제조 업체의 프로토콜에 따라 슬롯 얼룩 장치로 조립.
7. 해당 슬롯에 단계 2.5.2에서 피펫의 DNA. 제타 프로브 막 상에 DNA를 당겨 천천히 진공을 적용합니다. 모든 샘플이 장치를 통과 한 후 진공을 중지합니다.
   1. 장치를 분해하고 즉시 UV 가교제를 사용하여 막 위에 DNA를 고정시킨다. 자외선 가교제의 DNA의 측면을 가지고 노소를 사용가교제에 설정 tocrosslink. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오.
8. 웨스턴 블 롯팅을 수행하여 슬롯 블롯에 BrdU의 검출.
   1. PBS에서 무 지방 분유 5 % 막에 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 1 시간 동안 실온에서 0.1 % 트윈 20 (PBST)을 포함하는 막과 차단.
   2. 기본 방지 BrdU의 항체 (1 : 500 희석) 추가 PBST 1 % 무 지방 건조 우유에 희석 및 통에 실온에서 3 시간 동안 차 항체와 얼룩을 품어. 일차 항체 배양 후에 PBST로 3 회 씻어 막.
   3. 얼룩에 HRP - 복합 항 - 마우스 이차 항체를 추가 (1 : 5,000 희석) 1 시간 동안 실온에서 품어. 이차 항체 배양 후 PBST로 3 회 막 씻으십시오.
      참고 : 완전히 일차 및 이차 항체 배양 중에 막 다루 항체의 충분한 양을 사용합니다.
9. ECL 믹스를 준비하고 오 교류에 추가제조업체의 프로토콜에 cording. 실온에서 5 분간 ECL 믹스와 멤브레인을 품어.
   1. , X 선 카세트 막 배치 X 선 필름에 노출시켜 막 제조자의 프로토콜을 이용하여 블롯을 개발한다.
   2. 제조사의 프로토콜에 따른 화상 J 소프트웨어를 이용하여 블롯을 스캔 한 후 입력 및 ChIPed의 DNA에 대해 얻어진 신호를 정량화. 정량 측정의 정확도를 보장하기 위하여 검출의 선형 범위 내에있는 신호를 사용한다.

결과

HDAC1,2 선택적 억제제의 특이성을 결정하기 위해, Hdac1,2 ^{FL / FL} 및 Hdac3 ^{FL / FL} 섬유 육종 세포를 사용 하였다. 아데노 바이러스 함유 Cre 호텔 재조합 효소 (AD-Cre 호텔)이 세포에서 Hdac1,2과 Hdac3을 삭제하는 데 사용되었다. Hdac1,2 ^{FL / 플로리다의} 다음 광고-Cre 호텔 감염 세포 H4K5ac에서 강력한 증가가 관찰...

토론

이 논문에 기술 된 프로토콜은 새로 복제 또는 초기 DNA에 단백질 또는 번역 후 변형 된 형태의 존재를 입증하는 상대적으로 빠른 방법입니다. 또한,이 기술은 초기의 단백질 또는 DNA와의 수정 된 형태의 어소시에이션 해리 동력학을 측정하는 하나를 허용한다. 이 기술은 우아한 iPOND 기술 ^(13)에 상보 적이다. iPOND 기술에서, 새로 합성 된 DNA는 에틸 옥시 우리 딘 (EDU)으로 표시됩니다. 비오틴...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators