Modello murino di ischemia-riperfusione intestinale Injury

Riepilogo

Qui si descrive la procedura dettagliata di intestinale ischemia-riperfusione nei topi che causa ferite riproducibili senza la mortalità per favorire la standardizzazione di questa tecnica in tutto il campo. Questo modello di intestinale danno da ischemia-riperfusione può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di lesioni e di rigenerazione.

Abstract

ischemia intestinale è una condizione pericolosa per la vita associata con una vasta gamma di condizioni cliniche, tra cui l'aterosclerosi, trombosi, ipotensione, enterocolite necrotizzante, il trapianto di intestino, traumi e l'infiammazione cronica. Intestinal ischemia-riperfusione (IR) infortunio è una conseguenza di ischemia mesenterica acuta, causata dal flusso sanguigno insufficiente attraverso i vasi mesenterici, causando danni intestinali. Riperfusione dopo ischemia può esacerbare ulteriori danni dell'intestino. I meccanismi di danno IR sono complessi e poco conosciuta. Pertanto, modelli sperimentali piccoli animali sono fondamentali per comprendere la fisiopatologia di lesioni IR e lo sviluppo di nuove terapie.

Qui si descrive un modello murino di danno IR intestinale acuta che fornisce lesioni riproducibili del piccolo intestino, senza mortalità. Ciò si ottiene ischemia inducendo nella regione dell'ileo distale temporalmente occludinag i rami collaterali periferici e terminali dell'arteria mesenterica superiore per 60 minuti utilizzando clip microvascolari. Riperfusione per 1 ora, o 2 ore dopo i risultati di lesioni a danno riproducibile dell'intestino esaminato da analisi istologica. La corretta posizione delle clip microvascolari è fondamentale per la procedura. Pertanto, il video clip fornisce una dettagliata descrizione visiva step-by-step di questa tecnica. Questo modello di lesione intestinale IR può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di lesioni e di rigenerazione.

Introduzione

L'intestino è molto sensibile alla interruzione del flusso di sangue che provoca ischemia e epiteliale danni. Riperfusione dopo ischemia fornisce ri-ossigenazione dei tessuti, e può promuovere ulteriormente la patologia. Pertanto, intestinale danno da ischemia e riperfusione è associata ad una vasta gamma di patologie, tra cui enterocolite necrotizzante, il rigetto nel trapianto di intestino tenue, complicanze della chirurgia addominale aneurisma aortico, bypass cardiopolmonare, e infiammatoria cronica dell'intestino ^1,2. Lesioni intestinali IR, ischemia mesenterica particolarmente acuta, è una condizione di pericolo di vita con conseguente morbilità e mortalità ^3.

Anche se poco conosciuta, intestinale ischemia-riperfusione (IR) danno è pensato per essere associate a cambiamenti nella flora intestinale, nonché la produzione di specie reattive dell'ossigeno e citochine infiammatorie e chemochine ^1,4-6. Questo porta alla attivazione sia inNate e meccanismi immunitari adattivi che promuovono l'infiammazione dei tessuti e lesioni ^1,7,8.

I modelli animali sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi di danno IR, in quanto consentono un facile guadagno-e la perdita-di-funzione di esperimenti genetici. Diversi modelli animali di IR sono state sviluppate che includono occlusione vascolare completo, a basso flusso ischemia, e segmentato occlusione vascolare (riassunto in una recente revisione globale ^9). Ischemia intestinale causata da occlusione vascolare completa di mesenterica superiore (SMA) è un modello semplice e comunemente usato di IR in grandi animali e roditori ^9-11. Tuttavia, diverse aree del intestino hanno diversa suscettibilità al danno. Inoltre, la vasta gamma di anestetici, analgesici, tecniche di occlusione, così come incoerenza nella durata del danno ischemico e risultato del recupero in gradi variabili di danno confondendo la nostra comprensione della biologia di IR attraverso Studie multiplas. La tabella 1 mostra queste incongruenze negli studi IR murini. Il più grande svantaggio di utilizzare i tempi d'ischemia più brevi (30-45 minuti) si rivolge la finestra di recupero su cui possono essere osservate differenze discernibili tra casi e controlli. lieve lesione all'epitelio può essere risolto un'ora dopo riperfusione, quindi specializzata metriche patologiche possono essere necessari per trovare le differenze di restituzione epiteliale. Al contrario, danni eccessivi, come visto da 100 min di lesione ischemica può comportare la denudement completa dell'epitelio, qualora la restituzione non è più possibile, aumentare il tasso di mortalità, e tempo di recupero. Pertanto, qui si descrive la procedura dettagliata di IR intestinale nei topi che causa ferite riproducibili senza la mortalità per favorire la standardizzazione di questa tecnica in tutto il nostro campo. Questo modello di lesione intestinale IR può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di lesioni e di rigenerazione.

Protocollo

Gli studi sugli animali sono stati eseguiti in accordo con l'Istituto Nazionale di Salute e linee guida sono state approvate dalla cura degli animali Istituzionale e utilizzare Comitato dell'Istituto Trudeau. 8-12 settimane di età topi C57BL / 6 sono stati utilizzati per lo studio.

1. Preparazione per la chirurgia

1. Preparare e sterilizzare gli strumenti chirurgici.
2. Preparare il sistema di anestesia isoflurano-based con cono, e pad riscaldata. Assicurarsi pad riscaldata non è surriscaldato (<39 ° C).
3. Assicurarsi che il isoflurano evacuazione dei gas filtro viene posizionato correttamente a garantire le luci di scarico sul fondo del contenitore non sono bloccati o occlusa in alcun modo. Pesare gas scavenging bomboletta prima procedura e il peso documento sul contenitore. Eliminare il contenitore quando il peso contenitore supera i 50 g di peso accumulato (~ 12 ore).

2. Anestesia

1. Anestetizzare mouse con 3% isoflurano in una camera di induzione (1 L / minO _2).
   1. Valutare profondità dell'anestesia da una incapacità di rimanere in posizione verticale, perdita di movimento intenzionale volontaria, la perdita del riflesso corneale, rilassamento muscolare, e la perdita di risposta alla stimolazione reflex (punta o la coda pizzico con pressione costante).
   2. Valutare la frequenza respiratoria e il modello osservando parete toracica e addominale movimenti. In anestesia ottimale, la frequenza respiratoria dovrebbe essere ~ 55-65 respiri al minuto.
   3. Rimuovere mouse dalla camera di induzione e radere rapidamente l'area addome del mouse.
2. Per prevenire l'essiccamento della cornea, posizionare blanda pomata oftalmica negli occhi.
3. Posizionare il mouse sul tappetino riscaldato e collegarlo tramite cono di sistema di anestesia. Assicurarsi membrana cono lattice naso si inserisce saldamente sopra la testa del mouse e non vi è alcuna perdita di isoflurano.
4. Ridurre tasso isoflurano al 1,5%, e iniettare buprenorfina (0,1 mg / kg) e ketamina (10 mg / kg) per via sottocutanea per impedire avvolgimento del dolore in cascata.
5. pulire °e pelle della zona operazione con un tampone di cotone sterile imbevuto di soluzione chirurgica Betadine seguita da etanolo al 70%.

3. Chirurgia

1. Fare un cm laparotomia linea mediana 3-5 con le forbici di funzionamento. zona di operazione di copertura con tampone non aderente sterili inumidito con soluzione fisiologica. Isolare cieco e ileo ed esporre l'arteria mesenterica superiore utilizzando tamponi di cotone inumidito con soluzione salina.
2. Per facilitare l'applicazione di clip, fare piccole incisioni nel mesentere circostante l'arteria mesenterica superiore con iris belle scissors.To fare questo, alzare delicatamente l'intestino con una pinza medicazione e tagliare mesentery su entrambi i lati dell'arteria mesenterica superiore alla posizione clip desiderata (Figura 1A). Quindi, aggiungere alcune gocce di soluzione salina sterile per l'area di posizione della clip desiderata prima di applicare clip.
   Nota: per eseguire l'intervento chirurgico farsa, seguire la procedura chirurgica fino al punto 3.2. Non applicare clip. Invece, mantenere il tessuto umido con aggiunta s caldoaline come descritto nel 3,6 per 1 ora. In seguito, passare al punto 4.1,
3. Occlude i primi rami ordine dell'arteria mesenterica superiore con clip microvascolari (70 g forza) utilizzando una clip applicatore per creare una regione 5-7 cm dell'ileo ischemico adiacente cieco (Figura 1B). Anche se la posizione dei vasi è conservatore, ci potrebbero essere lievi differenze tra i topi (vedere esempi nella Figura 1). Pertanto, 2 o 3 clip sono solitamente richiesti (vedi la posizione dei clip su figura 1A, D, E, frecce nere).
   Nota: utilizzare clip del vaso di alta qualità. clip ad alta pressione può danneggiare i vasi e prevenire la rigenerazione mentre clip a bassa pressione (<30 g) non possono bloccare completamente il flusso di sangue.
4. Bloccare il flusso di sangue attraverso l'intestino collaterale utilizzando due clip microvascolari tutti navi (40 g forza), demarking regione dell'intestino ischemico (Figura 1). L'occlusione dei vasi collaterali è necessario perevitare afflusso di sangue dai vasi sanguigni adiacenti (vedi la posizione dei clip su figura 1A, D, E, frecce verdi).
5. Opzionale: Aggiungere la soluzione di eparina (6 USP unità / ml), per prevenire la coagulazione del sangue. Gocciolata aggiungere 0,5 ml di soluzione di eparina per l'intestino isolato.
6. Wet pad non aderente salviettine delicate sterili con soluzione salina pre-riscaldato a 37 ° C e si applicano a zona chirurgica. Assicurarsi che salviettine rimane umido durante l'intera procedura.
7. Mantenere ischemia per 60 min usando 1-1,5% anestesia isoflurano in tutto. Se la procedura ischemia è eseguita correttamente, la regione ischemica cambia in vino rosso in colore in circa 30 min. Si noti che i vasi sanguigni distali alla posizione della clip sono ingrandite durante l'ischemia (figura 1, pannelli di destra) che indica l'occlusione di successo.
8. Seguire da vicino il mouse durante la fase di ischemia. Continuare ad applicare soluzione salina per il pad non aderente che copre il sito chirurgico.
9. marchioi bordi della zona ischemica pipettando 20 ml di Gill`s 3 ematossilina sul tessuto per agevolare la raccolta del tessuto ischemico e tessuto sano adiacente dal medesimo mouse per il confronto (Figura 1E, pannello di destra).

4. Fase riperfusione

1. Alla fine della ischemia aggiungere qualche goccia di soluzione salina sull'area fermaglio e rimuovere delicatamente clip microvascolari con clip applicatore. Poi, spingere delicatamente l'intestino torna alla cavità addominale con punte di cotone inumidito saline. Rimuovere pad non aderente e chiudere la parete addominale e la pelle con 9 mm in acciaio inox clip ferita. Se riperfusione viene eseguita più di 3 ore, utilizzare una sutura Vicryl assorbibile per chiudere la parete addominale prima di applicare clip ferita sulla pelle.
2. Mantenere topi in una gabbia pulita riscaldata per tempo desiderato (30 min, 60 min, 120 min, o 180 min) per la fase di riperfusione.
3. Controllare gli animali, almeno ogni 30 min per assicurare la stabilità.

5. Necroscopia e raccolta dell'intestino tenue

1. Euthanize topi da CO ₂ overdose seguita da dislocazione cervicale al momento desiderato seguendo riperfusione.
2. Aprire cavità addominale e raccogliere il tessuto intestinale ischemico per ulteriori analisi. Harvest sano tessuto normale adiacente al tessuto danneggiato come controllo interno per tenere conto di qualsiasi reazione sistemica di un infortunio.
   Nota: Questo controllo è più appropriato rispetto alla farsa topi di controllo operato perché i topi sham operato non subiscono una reazione sistemica al danno IR-indotta.
3. Lavare contenuto intestinale con 30 ml siringa con l'ago collegato sonda gastrica riempito di soluzione salina e poi tagliare l'intestino in senso longitudinale. Se è richiesto un campione di intestino per l'analisi di espressione genica, tagliare un frammento di 1,5 millimetri longitudinalmente, e utilizzare il pezzo rimanente per l'analisi istologica.
4. Per l'analisi istologica, preparare un rotolo svizzero con un paio di pinze a rotolare la intestine.
5. Per mantenere la forma arrotolata, posizionare i pezzi di intestino tra imbottiture biopsia in cassette di tessuto (Figura 2). Mettere le cassette in 10% formalina tamponata.
6. Fix tessuto in formalina per almeno 24 ore. Sostituire formalina con il 70% di etanolo per altre 24 ore. Conservare tessuto in 70% di etanolo indefinitamente a temperatura ambiente.
7. Incorporare in paraffina, taglio 5 sezioni micron e macchia con ematossilina ed eosina utilizzando un protocollo standard (Figura 3).

6. punteggio

1. Punteggio ottenuto il murino danno da ischemia-riperfusione come riassunto nella tabella 2. Scegliere un metodo di punteggio appropriato.
2. Opzionale: Dividere il campo visivo in quattro sezioni poiché la gravità del danno varia in tutta la sezione.
3. Calcolare la media di ogni sezione da punteggi ottenuti alla cieca.
4. Confrontare il grado del tessuto danneggiato tra casi e di controllo nonché di the indenne tessuto utilizzando un test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di confronto multiplo di un Dunn.

Risultati

Abbiamo ottimizzato il protocollo sperimentale di chirurgia IR avere riproducibile lesioni IR indotta dell'ileo nei topi. I risultati rappresentativi sono dimostrati in questa sezione.

La Figura 1 mostra alcuni esempi di posizione clip microvascolari per indurre ischemia dell'ileo. frecce nere indicano la posizione dei principali clip occlusione primi rami ordine di mesenterica superiore. Le frecce ver...

Discussione

Lo sviluppo di modelli murini di intestinale lesioni IR hanno notevolmente migliorato la comprensione dei meccanismi di danno tissutale e aiutato nello sviluppo di potenziali strategie terapeutiche per ridurre al minimo i danni ai tessuti ^7,9,11,34. I passaggi critici di questo protocollo sono il corretto posizionamento delle clip microvascolari, corretta tempistica della valutazione ischemia e propria istologica di lesioni IR.

La durata di ischemia è fondamentale per la successi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heated Pad	Sunbeam	E12107-819	Alternative: Braintree Scientific heated pad
Table top research anesthesia Machine	Vasco	UCAP 0001-0000171	Alternative: Parkland Scientific, V3000PS
Nose Cone	Parkland Scientific	ARES500
Scavenger canister and replacement cartridge	Parkland Scientific	80000, 80120
Induction Chamber	Surgivet	V711802
Isoflurane	Piramal Healthcare	NDC 66794-013-10	Controlled substance, contact IACUC
Animal clipper	Oster	Oster Golden A5 078005-050-003
Ophthalmic ointment	Webster	8804604
Buprenorphine	McKesson	562766	Controlled substance,contact IACUC
Ketaset (Ketamine HCl)	Pfizer	NADA 45-290	Controlled substance, contact IACUC
Cotton tips	Puritan medical products	806-WC	Autoclave before use
Betadine	Purdue Products	67618-150-17	10% Povidone-Iodine
Sterile saline solution	Aspen	46066-807-60	Adjust to room temperature before use
IR rodent thermometer	BIOSEB	BIO-IRB153
Micro vascular clips, 70 g	Roboz Surgical	RS5424, RS5435	Alternative: WPI 14121, for SMA occlusion
Micro vascular clips, 40 g	Roboz Surgical	RS6472	Alternative:WPI 14120, for collateral vessels occlusion
Clip applying forceps	World Precision Instruments	14189	Alternative: Roboz #RS-5410 or  #RS-5440
Gill's 3 hematoxylin	Thermo Scientific	14-390-17
Surgical staples, Reflex 9 mm	Cell Point Scientific	201-1000
Autoclip applier	Beckton Dickinson	427630
Byopsy foam pad	Simport	M476-1
Tissue cassette	Fisher Healthcare	15182701A	Histosette II combination lid and base
10% buffered formalin	Fisher Scientific	245-684
Surgical iris scissors	World Precision Instruments	501263-G SC	Alternative: Roboz RS6816
Operating scissors	World Precision Instruments	501219-G	Alternative: Roboz RS6814
Dressing forceps	Roboz Surgical	RS-5228, RS-8122	Alternative: World Precision Instruments 1519-G
Heparin, endotoxin free, 300 USP units/vial, 50 mg	Sigma	2106
Reflex wound clip removing forceps	Roboz Surgical	RS-9263	Alternative: World Precision Instruments: 500347
Mice C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	Stock No 0664
Telfa non-adherent dressings, 3 x 4, sterile	Coviden	1050
Fisherbrand transfer pipets	Fischer Scientific	13-711-5AM	Use pipets to dropwise add saline