Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

Résumé

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Résumé

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

Introduction

Transduction-transplantation est une méthode utile pour modéliser les hémopathies malignes chez les souris. Cette technique a été particulièrement précieux pour l' étude des tumeurs malignes myéloïdes remontant à la première démonstration que l' expression ectopique de BCR-ABL1 pourrait fidèlement récapituler la leucémie myéloïde chronique chez les souris ^1. Cette technique a ensuite facilité l'étude approfondie de JAK2 ^V617F et MPL ^{W515K / L} muté syndrome myéloprolifératif (MPN).

NPP sont un groupe de tumeurs malignes caractérisées par une surproduction de cellules myéloïdes matures et une fibrose de la moelle osseuse. Ces maladies proviennent généralement de l'expansion clonale d'une cellule souche hématopoïétique qui a acquis une mutation somatique soit dans Jak2, MPL ou CALR. Transduction-transplantation JAK2 ^V617F et MPL ^{W515K / L} modèles présentent les caractéristiques cliniques de la maladie de Vaquez et myélofibrose ^{2-5 <}/ Sup>. Récemment, un modèle de souris de la calréticuline mutée MPN a été généré par la méthode de transduction transplantation ^6. Ces souris développent une maladie thrombocytémie comme essentielle à l'augmentation des plaquettes, l'augmentation du nombre de mégacaryocytes et la fibrose de la moelle osseuse. Ensemble, ces modèles ont non seulement donné l'occasion de mieux comprendre la pathogenèse moléculaire de MPN, mais aussi la capacité à développer et à étudier la thérapeutique dans un cadre pré-clinique.

Ce manuscrit fournit une description détaillée de la méthodologie transduction-transplantation avec un accent sur la mutation CALRdel52. Cette technique implique la transplantation de cellules de moelle osseuse transduites par un retrovirus exprimant le mutant de construction dans des souris receveuses syngéniques irradiés.

Protocole

Cette étude a été approuvée et réalisée conformément aux recommandations formulées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de Californie, Irvine. Toutes les procédures ont été réalisées sous anesthésie à l'isoflurane et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.

1. Production de retrovirus écotropique

1. Préparer des plasmides de haute qualité avec une concentration d'au moins 1 pg / pl en utilisant soit un kit maxi-prep commerciale ou la purification de chlorure de césium.
   NOTE: notamment un vecteur MSCV squelette codant pour le gène d'intérêt (dans ce cas CALR ^7,8) et marqueur de choix (GFP, Neo, etc.) ainsi qu'un emballage plasmide écotrope, codant gag-pol-env (appelé ici en tant que plasmide).
2. Décongeler et divertissez cellules 293T faible passage dans DMEM additionné de 10% de FBS et L-glutamine avec de la pénicilline / streptomycine (D10). Plate 5 x 10 ⁶ cellules dans une boîte de culture traitée de tissu 10 cm dans un humidifiéla culture tissulaire incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
3. Développer des cellules 293T en culture. Le jour avant la transfection, laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS et aspirer le surnageant dans un ballon à vide.
4. À trypsiniser cellules, ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% et on incube la vaisselle dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée pendant 2 à 3 min à 37 ° C et 5% de CO _2.
5. Pour arrêter trypsinisation, ajouter 3 ml D10 à plat et les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Faire tourner les cellules à 400 xg pendant 10 min.
6. Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et resuspendre le culot de cellules dans 2 ml de D10.
7. Compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre.
8. Seed 2 x 10 ⁶ cellules par boîte en trois 10 cm de culture tissulaire traités plats par virus générés.
   REMARQUE: Pour des résultats optimaux, ne permettent pas aux cellules de dépasser 30 - 50% de confluence au moment de la transfection ou un rendement de virus pauvre peut être obtenu.
9. Immédiatement avant la transfection,médias aspirés dans une fiole à vide et remplacer par 5 ml de D10 frais.
10. Pour tous les 10 cm boîte de Pétri à transfecter préparer un tube de 1,5 ml stérile individuel.
11. Pipette 760 ul de milieu de sérum réduit dans chaque tube à centrifuger, puis ajouter soigneusement 40 ul de réactif de transfection directement dans les médias. Incuber les tubes dans la hotte de culture de tissu à la température ambiante pendant 5 min.
12. Ajouter 30 pg de MSCV vecteur avec le gène d'intérêt (15 ug si on utilise un vecteur vide), ainsi que 5 ug de plasmide dans chaque tube respectif et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber à la température ambiante sous la hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes supplémentaires.
    NOTE: Les petits vecteurs ont tendance à avoir des rendements viraux plus élevés.
13. Ajouter délicatement le volume total de chaque réaction (environ 800 pi) goutte à goutte dans sa 10 cm boîte de Pétri respective et inclinez légèrement le plat d'un côté à l'autre pour mélanger. cellules Retour à la cu tissulaire humidifiéincubateur lture.
14. Après 8 heures, ou une nuit d'incubation dans une culture tissulaire incubateur, les médias aspirés dans une fiole à vide et doucement remplacer par 10 ml de D10 frais.
15. A 48 heures post-transfection recueillir surnageant dans une seringue de 35 ml et filtrer à travers une membrane de 0,45 um pour éliminer les débris cellulaires.
16. EN OPTION: Placer 10 ml D10 frais de retour sur les cellules 293T et virus supplémentaire peut être récolté à 72 heures après la transfection.
17. Jeter les cellules 293T dans les déchets biohazard quand aucun virus supplémentaire est recueilli.
18. aliquote surnageant viral dans des volumes à usage unique (par exemple 1 ml pour le titre viral ou 6,5 ml pour une infection BM). virus Flash gel avec de l'azote liquide et le virus de la conserver à -80 ° C.
    REMARQUE: Éviter les cycles répétés de gel / dégel , car ils réduisent grandement le titre viral.

2. Déterminer Titer Relative Viral par cytométrie de flux

1. Décongeler les cellules 3T3 et maintenir en D10. La culture des cellules dans 10 cmculture tissulaire traitée plat dans un incubateur humidifié de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Effectuer le titre viral en triple exemplaire. Pour préparer des cellules, laver les cellules en ajoutant 1 ml de PBS et aspirer le surnageant dans un ballon à vide.
3. À trypsiniser cellules, ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% et on incube la vaisselle dans un incubateur humidifié de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO _2.
4. Pour arrêter trypsinisation, ajouter 3 ml D10 à plat et les cellules de transfert à un tube conique de 15 ml. Faire tourner les cellules à 400 xg pendant 10 min.
5. Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et resuspendre le culot de cellules dans 2 ml de D10.
6. Compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre.
7. Semence des cellules 3T3 à une densité de 1 x 10 ⁵ cellules dans les quinze boîtes de culture de tissus traités par 60 mm et incuber pendant une nuit.
8. Faire 1: 3, 1:10, 1:30 et 1: 100 dilutions de surnageant viral décongelé en utilisant D10 dans un total de 1 ml. Inclure aussi un contrôle sans virus.
9. aspirer media de cellules 3T3 dans un flacon à vide et la remplacer par 4 ml de D10.
10. Superposer les cellules 3T3 avec les dilutions du surnageant viral et ajoute du polybrène à une concentration finale de 8 ug / ml dans chaque boîte. Incuber pendant 48 heures dans la culture tissulaire incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
11. Déterminer par rapport titre viral par cytométrie de flux:
    1. Pour laver les cellules, aspirer les médias dans un flacon à vide et ajouter 5 ml de PBS.
    2. Aspirer le PBS dans un flacon à vide. Ajouter 1 ml de 0,05% de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2 - 5 min pour détacher les cellules du plat.
    3. Ajouter 3 ml D10 et la pipette de haut en bas pour détacher toutes les cellules restantes de la plaque. Transférer les cellules dans un tube FACS et centrifuger à 400 g pendant 10 min.
    4. Décanter le surnageant et laver les cellules avec 3 ml de PBS. Centrifugeuse à 400 g pendant 10 min et le surnageant de décantation. Remettre en suspension dans 200 ul de PBS.
    5. Cellules Exécuter sur un cytomètre de flux ^9. Collecter entre 20.000 - 30.000 événements dans til vit la porte de la cellule (déterminée par FSC vs SSC) et calculer le pourcentage de la GFP ⁺ et GFP ^- cellules.
       NOTE: Le titre viral est considéré comme acceptable lorsque la dilution 1:30 du rendement surnageant viral au moins 50% GFP ⁺ 3T3 cellules. Si cette dilution des résultats dans moins de 50% des cellules GFP ⁺ , puis les résultats de transduction suboptimales peuvent être obtenus. Le calcul pour déterminer le titre viral a été adapté de Limon et al. Blood (1997) ^9.
    6. Pour déterminer par rapport titre du virus, utilisez l'équation: titre viral = particules formant des unités (PFU) / ml = [(Nombre de cellules 3T3 × Fréquence de cellules GFP ⁺⁾ / volume de surnageant (ml)] x facteur de dilution.

3. transduction donateurs cellules de moelle osseuse

1. Pour préparer souris donneuses pour la moelle osseuse (BM) récolte, premier anesthésier souris par vaporiseur isoflurane avec un taux de 5% supplémentaire combiné de débitoxygène à 1 L / min. Pincez pied pour évaluer la réactivité.
   NOTE: Les souris donneuses (moins de 8 semaines) devraient être préparés 5 jours avant la récolte de la moelle osseuse (8 jours avant la transplantation). Un souris donateurs fourniront suffisamment de cellules pour au moins 2 destinataires.
2. Injecter 150 mg / kg de 5-fluorouracile (5-FU) par injection rétro-orbital dans des souris anesthésiées au moyen d'un 27 G x ½ "aiguille.
   PRUDENCE! 5-FU, un agent chimiothérapeutique anti-cancéreux. Toujours manipuler 5-FU dans une hotte chimique certifié ou une enceinte de biosécurité canalisé. Consulter avec le comité de sécurité en laboratoire et des animaux de l'institution pour déterminer l'étiquetage approprié des souris traitées avec le 5-FU.
   1. Placez la souris anesthésiée sur le côté et retenir en utilisant à la fois le pouce et l'index de telle sorte que l'œil dépasse légèrement de la tête.
   2. En commençant par la partie latérale de l'aiguille du canthus interne et avec le biseau vers le haut, insérer l'aiguille à un 45° angle dans le sens médial et arrêter lorsque l'aiguille est à mi-chemin inséré. Injecter lentement les cellules et enlever retirer délicatement l'aiguille.
      NOTE: Si cette technique est effectuée correctement, l'œil doit se rétracter légèrement et aucune résistance doit être ressentie lors de l' insertion de l' aiguille.
   3. Examiner la souris pour tout signe de blessure, tels que le gonflement ou de saignements.
3. Récolte de moelle osseuse de 5 jours après le traitement 5-FU (3 jours avant la transplantation).
   1. Anesthetize souris par vaporisateur isoflurane avec un débit de 5% d'oxygène supplémentaire combiné à 1 L / min. Pincez pied pour évaluer la réactivité.
   2. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale. Stériliser souris par pulvérisation généreusement avec 70% EtOH jusqu'à ce que la fourrure est mouillé.
   3. Utilisation de disséquer des ciseaux, faire une incision dans la peau et disséquer le fascia loin des muscles de la jambe. Ensuite, disséquer la jambe loin de la souris en coupant le fémur à la hanche et le tibia à la cheville.
   4. plierla jambe en forme de «L» et séparer chaque os jambe en coupant à l'articulation du genou avec des ciseaux de dissection.
   5. Pour retirer le cartilage aux extrémités distales de chaque os de la jambe, utiliser les ciseaux de dissection pour gratter délicatement le muscle vers une extrémité de l'os de la jambe jusqu'à ce que le cartilage est désengagé.
   6. En utilisant une seringue avec une aiguille 27 G x ½ pouces, rincer chaque os jambe avec du PBS additionné de 2% de FBS sur une membrane en nylon de 100 uM dans un tube conique de 50 ml. os Flush jusqu'à l'os devient blanc pour maximiser le nombre de cellules récoltées.
   7. Utiliser le piston d'une seringue pour écraser les cellules à travers la membrane en nylon dans le tube conique de 50 ml pour obtenir une suspension cellulaire unique. Répétez avec l'autre jambe de la souris.
4. Centrifuger les cellules à 4 ° C pendant 10 min à 400 xg et jeter le surnageant. Remettre en suspension dans 5 ml BM chlorure d'ammonium potassium (ACK) du tampon pour lyser les globules rouges. Incuber les cellules sur de la glace pendant 10 minutes.
5. Remplir le tube avec du PBS pour arrêter la lyse cellulaire. Centricellules Fuge à 4 ° C pendant 10 min à 400 xg et jeter le surnageant. Répétez l'étape de lyse si le culot BM a la couleur rouge.
6. Remettre en suspension dans 5 ml de PBS et compter les cellules par exclusion du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre.
7. Resuspendre les cellules à 2 x 10 ⁶ cellules par m avec un cocktail de pré-Stim 2x contenant du DMEM supplémenté avec 20% de FBS, L-glutamine, de la pénicilline / streptomycine, l' IL-3 (14 ng / ml), l' IL-6 (24 ng / ml) et du SCF (112 ng / ml). Plate 2 ml par puits en plaques à 6 puits.
8. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO _2.
9. Ajouter 2 ml de surnageant viral dans chaque puits contenant des cellules BM et ajouter polybrène (8 ug / ml). plaques de Spin à 30 ° C pendant 90 min à 1500 xg retournent ensuite la plaque au tissu incubateur de culture durant la nuit.
10. Pipette suspension cellulaire dans des tubes coniques et centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 400 g, ne jetez pas la plaque. Resuspendre les cellules dans 2 ml cocktail frais pré-stim 2x par puits et retourner dans les puits d'origine.
11. Effectuer une 2 ^ème spinoculation en répétant les étapes 3,7-3,9.

4. Les cellules Transplant des donateurs sur les souris receveuses

1. Préparer des souris receveuses syngéniques pour la transplantation avec une dose létale totale irradiation corporelle <24 heures avant l'injection de cellules BM.
   NOTE: l' irradiation de la dose létale pour les souris BALB / c est typiquement 800-900 cGy et 1000-1200 cGy pour C57B / 6 ^10. La dose est généralement divisée en deux sessions d'irradiation espacées d'au moins 3-4 heures d'intervalle.
2. Suite de l'étape 3.11, les cellules du donneur de récolte transduction des plaques 6 puits par pipetage surnageant dans des tubes coniques. Laver chaque puits avec 1 ml de PBS pour recueillir les cellules résiduelles et l'ajouter à 50 ml tubes coniques.
3. Ajouter 0,5 ml de trypsine à 0,05% dans les puits et incuber à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 5 min.
4. Ajouter 1 ml D10 aux puits et détacher les cellules restantes par pipetage doux. Ajouter les cellules au tube respectifs à l'étape 4.2 et le culot par centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 400 x g.
5. Laver les cellules avec du PBS et on centrifuge à 4 ° C pendant 10 min à 400 x g. Resuspendre dans 5 ml de PBS et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre par exclusion au bleu trypan.
   NOTE: Si le vecteur a une balise GFP puis quantifier le pourcentage de cellules GFP-positives avec un cytomètre de flux.
6. Remettre en suspension à 5 x 10 ⁵ - 2 x 10 ⁶ cellules de 50 à 100 ul de PBS pour l' injection à des souris.
7. Injecter cellules par injection rétro-orbital dans des souris anesthésiés en utilisant un 27 G x ½ "aiguille stérile.
   NOTE: D' autres techniques d'injection comprennent la queue veine, splénique ou fémorale.
   1. Anesthetize souris à l'aide d'isoflurane et pincer le pied pour évaluer la réactivité.
   2. Placez la souris sur le côté et retenir en utilisant à la fois le pouce et l'index de telle sorte que l'œil dépasse légèrement de la tête.
   3. Avec le biseau vers le haut, insérez le nEedle latéral au canthus interne à un angle de 45 °.
      NOTE: Si cette technique est effectuée correctement, l'œil doit se rétracter légèrement et aucune résistance doit être ressentie lors de l' insertion de l' aiguille.
   4. Examiner la souris pour tout signe de blessure, tels que le gonflement ou de saignements.
      REMARQUE: les souris de transplantation suivants ont des numérations globulaires faibles pour un certain nombre de semaines et sont donc sensibles à l' infection. Prophylaxie avec des antibiotiques ou l'utilisation de l'eau acidifiée peut être utilisé.
8. Un mois après la transplantation, mesurer la GFP% dans le sang périphérique comme un indicateur de cellules donneuses greffées par cytométrie de flux.
   NOTE: GFP seule ne peut pas déterminer le succès de la greffe des cellules. La transduction virale peut avoir encore échoué greffe peut avoir eu lieu. Dans ce cas, pas de cellules GFP ⁺ seraient détectés, mais la prise de greffe des cellules transplantées était réussie.
   1. Prendre 10 pl de sang périphérique by perforer la veine saphène de la jambe avec une 21 G x 1 ½ "la seringue et l'ajouter à 100 mM d'EDTA dans du PBS pour empêcher la coagulation.
   2. Ajouter 1 ml ACK au sang et lyse sur la glace pendant 10 min. cellules à pellets par centrifugation à 400 g pendant 10 min.
   3. Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et ajouter 1 ml de PBS additionné de 2% de FBS pour arrêter la lyse. cellules à pellets par centrifugation à 400 g pendant 10 min.
   4. Aspirer le surnageant dans un flacon à vide et remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS additionné de 2% de FBS.
   5. Exécutez des échantillons sur un cytomètre de flux et de recueillir 300.000 événements au sein de la grille de cellules vivantes (déterminé par FSC vs SSC) et calculer le pourcentage de la GFP ⁺ et GFP ^- cellules ^9.
9. De plus à 1 mois après la transplantation, effectuer la numération globulaire complète (CBC) à l' aide d' un analyseur d' hématologie vétérinaire automatisé ¹⁸ pour surveiller la progression de la maladie.
   NOTE: Continuer à surveiller la maladie en%GFP dans le sang périphérique et CBC mensuel.
10. Pour mettre fin à l'expérience, anesthésier la souris en utilisant l'isoflurane et pincée pied pour évaluer la réactivité. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale et la récolte de la rate et de la moelle osseuse pour l'histopathologie.
    NOTE: La durée de l'expérience est subjective et la date de résiliation doit être évaluée en fonction du phénotype de la maladie attendue.

Résultats

La technique de transduction transplantation se traduit par la reconstitution hématopoïétique des souris receveuses avec des cellules exprimant le gène d'intérêt. La figure 1 montre une vue d' ensemble du modèle de souris transduction transplantation de calréticuline muté NPP. En bref, un retrovirus exprimant CALRwt ou CALRdel52 est utilisé pour infecter des cellules BM à partir d'un donneur de souris C57B / 6. Les cellules transduites sont transpl...

Discussion

Ce protocole fournit une description détaillée de la façon d'effectuer des greffes de moelle osseuse chez des souris de récapituler une maladie thrombocytémie comme essentielle à la progression de la myélofibrose avec mutation CALRdel52 comme le conducteur de la maladie. transplanter avec succès des cellules exprimant les résultats CALRdel52 une augmentation des plaquettes, l'expansion des mégacaryocytes et la fibrose de la moelle osseuse. Comme greffe de moelle osseuse est un processus en plusieurs é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T cells	ATCC	CRL-11268
3T3 cells	ATCC	CRL-1658
PLASMIDS
EcoPak, also known as pCL-Eco	Addgene	12371	Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
CONSUMABLES
27G x 1/2" needles	BD	305620
Fetal bovine serum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	Can be homemade
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10cm dishes	Fisher	172931
15 ml conical tubes	Fisher	12565268
60mm dishes	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100um cell strainers	Fisher	22363549
50 ml conical tubes	Fisher	12565270
6-well plate	Fisher	130184
FACS tubes	Fisher	14-959-5
0.45um syringe filters	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK buffer	Lonza	10-548E	Can be homemade
Recombinant murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant murine SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
EQUIPMENT
BD Accuri C6
X-ray irradiator