마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

요약

여기에서는 개선 된 염색 품질함으로써 자동 취득하고 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어를 사용 ImageJ에 섬유 집단의 정량화를 허용 빠른 근섬유 분석을위한 프로토콜을 제시한다.

초록

근육 섬유 인구의 정량화 질환, 외상 및 골격 근육의 구성에 다양한 영향의 효과에 대한 깊은 통찰력을 제공합니다. 다양한 시간이 많이 걸리는 방법은 전통적으로 연구의 많은 분야에서 섬유 인구를 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 최근에 하나의 섹션에서 여러 섬유 종류를 식별하기 위해 빠른 대안을 제공 마이 오신 중쇄 단백질 발현에 따라 면역 조직 화학적 방법을 개발했다. 여기, 우리는 전체 크로스 섹션과 ImageJ에와 섬유 인구의 자동 정량을 자동으로 얻을 수 있도록 개선 염색 품질에 대한 신속하고 안정적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시한다. 이를 위해, 임베디드 골격 근육 세포 핵 염색을위한 이차 형광 항체 및 DAPI와 미오신 중쇄 항체를 사용하여 염색 단면으로 절단된다. 전체 단면은 고해상도의 복합체를 획득하기 위하여 슬라이드 스캐너를 사용하여 자동으로 스캔전체 표본의 사진. 섬유 인구 분석은 이후 ImageJ에 대한 자동화 된 매크로를 사용, 느린 중간 빠른 섬유를 정량화하기 위해 수행된다. 우리는 이전에이 방법은 ± 4 % 정도에 안정적으로 섬유 인구를 식별 할 수있는 것으로 나타났습니다. 또한,이 방법은 사용자 간 변동과 크게 오픈 소스 ImageJ에 플랫폼을 사용하여 분석 당 시간을 감소시킨다.

서문

골격근 조성물은 노화 ^{1, 2,} 운동 ^{3, 4, 5, 6, 7,} 또는 질병 ^{8, 9, 10} 또는 ¹¹ 같은 외상 병태 생리적 과정 과정에서 큰 변화를 겪는다. 따라서, 이러한 프로세스의 구조적 효과에 대한 연구 집중의 여러 분야는 기능 변화를 이해합니다. 근육의 기능을 결정하는 핵심 요소 중 하나는 근섬유의 조성물이다. 근섬유 다른 마이 오신 중쇄 (MHC) 단백질을 ^{발현시켜, 13,} 중간 느린 또는 빠른 섬유 ^{(7), (12)로} 구분 ^{> 14, 15, 16, 17.} 생리 학적, 근육은 몸에 그 기능에 따라 다른 근육 섬유의 조성이있다. 근섬유 입력을 사용하여, 섬유 ^{집단은 17} 생리 학적 또는 병태 생리 학적 과정 ⁷ 적응력을 식별하기 위해 정량화 될 수있다. 역사적으로, 시간이 많이 소요되는 다수의 방법은 근육 섬유 유형을 구별하기 위해 적용되어왔다. 이를 위해, 근육 섬유는 다양한 pH 값 또는 근육 효소 활성에 미오신의 ATPase의 반응성에 의해 어느 분류 하였다. 다른 섬유의 특성은 하나의 섹션에서 평가 될 수없는 것처럼, 여러 단면이 모든 근육 섬유를 확인하고 정량화 ^{14, 16, 17} 수동 ^{있도록해야했습니다,}= "외부 참조"> ^{18, 19, 20, 21, 22.} 대조적으로, 최근 간행물 빠르게 한 단면에서 여러 종류의 섬유를 염색 미오신 중쇄 단백질에 대한 면역 조직 화학 (IHC)를 사용 하였다. 이 절차의 장점을 바탕으로, 지금은 근육 섬유 인구 분석 ^{19, 23, 24의} 황금 표준으로 간주됩니다. 개선 IHC 염색 프로토콜을 사용하여, 우리는 전체 근육의 단면 이후 자동 근육 섬유 정량의 완전 자동 인수는 오픈 소스 플랫폼 ImageJ에를 사용 가능한 것으로 보여 최근 수 있었다. 수동 정량에 비해, 우리의 방법은 4 % ~ ± 정확하면서 슬라이드 당 필요한 시간 (수동의 약 10 %를 분석)의 상당한 감소를 제공하는 ²⁵ 까지.

이 방법의 전반적인 목표는 오픈 소스 플랫폼을 사용하여 전체 쥐의 근육에서 자동 근육 섬유 정량에 신속하고 신뢰할 수있는, 사용자가 독립적 인 가이드를 설명하는 것입니다. 또한, 우리는 쥐 또는 인간의 근육과 같은 다른 시편의 사용을 허용 할 가능성이 수정 사항을 설명합니다.

프로토콜

FELASA ^(26)에 의해 권장하는 동물 과목을 포함한 모든 절차는 실험 동물 관리의 원칙을 준수하여 실시 하였다. 승인 비엔나의 의과 대학과 연구 및 과학에 대한 오스트리아 정부의 제도적 검토위원회에 의해 연구 이전에 얻은 (BMWF는 : BMWF - 66.009 / 0222-WF / II / 3B / : Bundesministerium은 Wissenschaft 놀이 Forschung, 참조 번호 FUER 2014).

1. 근육 수확

참고 : 멩 등의 알 의해 이전 간행물. ^{도 27에} 자세히 근육 시료의 정확한 동결 설명 가능하다.

1. 즉시 동물의 안락사 후 전체 단면을 확보하기 위해 전체 근육 또는 충분한 조직을 얻습니다.
   1. 마취 또는 안락사 쥐에서 전체 근육을 제거합니다. 모든 결합 조직과 집게와 가위로 근육을 둘러싸고있는 힘줄을 제거합니다. A에 대한nesthesia 또는 안락사는 FELASA ^(28)의 국제 지침을 따르십시오.
2. 교정 정밀 저울을 사용하여 근육의 무게를. 이 빠른 단계는 특히 중재 절차 후 근육 샘플 간의 비교 분석을 할 수 있습니다.
3. 모든면에 약 1mm의 안전 마진 근육의 크기에 따라,의 OCT 화합물로 완전히 충전 된 용기에 넣고 근육 (예를 들어, 알루미늄 박으로 이루어지는).
4. 약 2 분에 동결 액체 질소를 이용하여 이소 펜탄을 미리 냉각. 이소 펜탄은 용기의 하단에 백색 결정을 보여주기 시작해야합니다.
   참고 :이 단계는 근육의 정확한 구조를 유지에 필수적인하여 올바른 염색을 허용하고 섬유 ^(27)를 분석합니다.
5. 스토어 샘플은 -80 ° C에서 최소 24 시간 동안 OCT에서 보존. 샘플은, 그러나, corre 경우, 몇 달 또는 몇 년 -80 ° C에 저장 될 수있다 ctly 냉각.
6. cryotome를 사용하여 -20 ℃에서 근육의 중앙부에서 10 개 μm의 횡단면을 잘라. 을 10㎛ 절단 가능한 것은 아닌 경우, 20 ㎛의 최대까지, 2㎛의 단계 두께를 증가시킨다. 충분히 예리한 절삭 날이 단계는 필수적이다.
7. 단면에 슬라이드를 근사에 의해 접착제 슬라이드에 섹션을 적용합니다. 크로스 섹션은 자동 접착 슬라이드에 충실 할 것이다. 하룻밤 염색하기 전에 -20 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.

2. 염색

참고 : 마이 오신 중쇄 단백질에 대한 항체의 많은 수를 사용할 수 있습니다; 그러나, 높은 품질의 항체는 자동 수집 및 분석을 위해 필수적이다. 항체 희석을 참고로, 표 1 참조. 스프레드 시트 파일이 올바른 희석을 계산하고 필요한 솔루션 수량의 수를 확인하려면, 참조1 파일 source.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental.

1. 해동 염색 과정 전에 10 분 동안 냉동 된 근육 부분을 공기 건조.
2. 워시 인산염 완충 식염수 (PBS) + 0.05 % 트리톤 X 10 분 후, 5 분 동안 조심스럽게 슬라이드. 트리톤은 크게 염색 품질을 향상시키기 위해 표시되었습니다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
3. 2 분 구간 공기 건조하자 (항체의 필요한 양을 최소화하기 위해), 15 분 동안 추가 건조를 허용 소수성 펜을 사용하여 각 슬라이드의 개별 단면 개요.
4. PBS + 모든 슬라이드 차단 0.05 % 트리톤 X (PBST)을 실온에서 1 시간 동안 10 %의 염소 혈청을 함유.
5. PBS + 0.05 % 트리톤 X (PBST)을 함유하는 10 %의 염소 혈청 칵테일 모든 일차 항체 (표 1) 희석. 신청하기 전에 충분히 섞는다. 트리톤 X는 전체 단면의 동일한 염색을 위해 필수적이다. 계산하다단면 당 일차 항체 칵테일의 30 μL.
6. 단계 2.7-2.13를 들어 광으로부터 충분한 보호를 보장합니다. 흐리게 실내 조명 커버와 염색 트레이 적절한 보호를 제공한다. 또, 염색시에 습윤 환경을 제공하고, 건조를 방지하기 위해 하단에서 유체에 의한 염색 트레이를 채운다.
7. 실온에서 습기 염색 트레이에서 1 시간 동안 슬라이드에 차 항체 (표 1) 칵테일을 적용한다.
8. 5 분 동안 새로운 PBST로 다음 10 분 동안 PBS + 0.05 % 트리톤 X와 슬라이드를 씻어.
9. PBS + 0.05 % 트리톤 X (PBST) + 10 % 염소 혈청의 칵테일 이차 항체를 희석. 단면 당 일차 항체 칵테일 중 30 μL를 계산한다.
10. 1 시간 동안 슬라이드에 차 항체 칵테일을 적용합니다.
11. PBS로 씻어 슬라이드 + 0.05 % 트리톤 X 및 10 분 동안 추가 5 분 동안 새로운 PBST로 (PBST).
12. DAPI 핵 염색 키트 (바람직하게 읽기에 사용 솔루션) FO 적용R 15 분 또는 세포 핵을 얼룩 제조업체의 지침에 따라.
13. 워시 간단히 PBS + 0.05 %와 슬라이드 트리톤 X 1 분 (PBST). 그 후, 슬라이드를 자연 건조 간단하게 할 수 있습니다.
14. 형광등 설치 매체와 커버 슬립을 적용합니다. 4 ℃에서 보관 빛으로부터 보호하고 24-48 시간 내에 최적의 촬상을 수행한다.

3. 현미경

1. 로드 슬라이드 스캐너에 슬라이드. 슬라이드 (12)의 최대 슬라이드 스캐너에 따라 가능하다.
2. 새 프로젝트를 시작하십시오. 미리보기를 들어, DAPI 채널과 2.5 배 렌즈를 설정합니다. 자세한 분석을 위해 DAPI, GFP, FITC와 Cy5의 채널 및 20X 대물 렌즈를 사용한다. 자동 초점은 DAPI 채널에서 프로젝트를 통해 획득된다.
3. DAPI의 파란, FITC : 녹색, 텍사스 레드 : 빨강, Cy5의 : 노란색 각 채널에 대해 다음 색상을 사용합니다.
4. DAPI 채널을 사용하여 각 슬라이드의 미리보기를 만듭니다. 이를 위해 첫 번째 시료에 수동 초점을 적용하고 미리보기를 통해 사용분석 결과 모든 시료의 미리보기 이미지를 수집합니다.
5. 자세한 획득 과정에 포함되어야한다 각 단면을 설명합니다. 관심의 전체 영역의 캡션을 보장하기 위해, 시편의 가장자리에 설명 그릴하지 마십시오.
6. 각 채널에 대한 노출 시간을 설정합니다. 대부분의 경우, 서로 다른 채널의 노광 파라미터를 모든 단면에 대해 동일하다.
7. 자동 이미지 수집을 실행합니다. 초기 자동화 과정에서 잘못된 인수를 방지하기 위해, 뷰의 첫 번째 필드에 대한 올바른 인수를 확인합니다.
8. 필요한 경우, 데스크톱 소프트웨어 미러링을 사용하여 원격 제어를 설정합니다. 이것은 어떤 네트워크 또는 인터넷 연결을 통해 다른 컴퓨터로 슬라이드 스캐너의 컴퓨터 화면을 미러링하여 영상 획득 과정의 원격 모니터링을 허용한다. 변경이 사용 된 슬라이드에 대한 물리적 설정 이루어지지 할 수 있지만, 이미지 수집 소프트웨어의 가상 환경은 모니터링 할 수 있습니다 이미지의 정확한 초점이나 노출 시간. 또한, 완료 예상 시간을 정기적으로 확인할 수 있습니다.
9. 화상 획득의 종료 후, 섬유 구조, 개개의 섬유 및 섬유 다양한 유형 구별하는 경우 수동으로 제어하여 모든 이미지의 정확한 자동 초점 제어한다.
10. 다시 취득 잘못보기 또는 관심의 전체 영역의 단일 필드에 대한 이미지 영역을 집중했다. 단일 영역의 재 획득을 위해, 전체 프로젝트 전반에 걸쳐 영역이나 이미지를 표시 및 수동 초점 영역을 재 취득. 대부분의 경우, 다른 초점 수준의 추가 이미지 세부는 잘못 초점을 맞춘 이미지로 연결
11. 최종 분석에 포함되어야 할 때마다 단면의 경우, JPEG 파일로 개별적으로 (DAPI 제외한) 각 채널을 내보내. 이름을 지정하고 텍사스 레드, FITC와 Cy5에라는 이름의 폴더에 노출 된 채널에 따라 파일을 정렬 할 수 있습니다.

4. 자동 섬유 분석

십t "> 참고 : 매크로는 다음 웹 페이지에서 얻을 수 있습니다 : https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

1. 미리 분석 전에 종래의 화상 편집 소프트웨어를 사용하여 염색하고 섬유와 배경 간의 충분한 대조 확인 각 이미지. 필요한 경우, 밝기 및 콘트라스트 조정 명령을 사용하여, 그 차이를 증가 대비 및 밝기를 조정한다.
2. 열기 ImageJ에 또는 피지. 명령을 사용하여 매크로를 열고 "- 매크로 - 플러그인. 편집" 이 매크로 소스 코드를 보여줍니다 및 매개 변수의 빠른 적응을 할 수 있습니다. 필요한 경우, 매크로의 소스 코드에서 각 채널에 대한 폴더 디렉토리를 변경합니다.
   참고 : 근육 섬유 분석에 대한 값은 쥐 팔뚝과 lumbrical 근육, 다른 종 또는 다른 값을 요구할 수있다 근육을 기반으로합니다.
3. 매크로를 시작합니다 "실행"명령을 사용하십시오. 폴더의 모든 이미지는 이제 매크로에로드하고 연속적인 순서로 정량화된다. 결과는 우입니다새 창에서 WN. 이 단계는 데이터가 분석되는 양에 따라 몇 시간이 초까지 걸릴 수있다.
4. 스프레드 시트 파일로 결과 창을 내 보냅니다. (느리게) 긍정적으로 계산 Cy5에 대한 (중간) FITC와 텍사스 레드 (빠른) 섬유를 값을 확인하고 전체 섬유 번호 요약.

결과

전체 쥐의 근육 단면은 MHC I, IIA 및 IIB 근육 섬유를 식별하기 위해 면역 조직 화학 염색을 사용하여 빠른 속도로 염색 하였다. 형광 현미경 슬라이드 스캐너를 사용하여, 전체 단면이 자동 자동 근섬유 취득 하였다은 ImageJ에로 분석한다. 절차의 개념은 근육 섬유의 정량화를위한 ​​간단하고 신뢰성 및 시간 효율적인 워크 플로우를 제공하는 기반으로합니다.

토론

여기, 우리가 공부하고 자동으로 시간을 효율적으로 면역 조직 화학 염색을 통해 쥐의 단면의 근육 섬유의 인구를 정량화하기 위해 광범위하게 접근 방법을 보여줍니다. 재현성을 위해, 우리는 단계의 설명과 본 연구에서 설명되지 않은 다른 종의 응용 프로그램에 대한 잠재적 인 수정하여 자세한 단계를 제시한다. 또한, 우리는 최적의 기능과 한계에 대한 절차의 장점, 전제 조건에 대해 설?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
O.C.T compound	Tissue-Tek, Sakura, Netherlands		For embedding of muscle tissue
Isopentane			for adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slides	Thermo Scientific, Germany	1014356190	adhesive slides
phosphate buffered saline
Triton X-100	Thermo Scientific, Germany	85112	Detergent Soluation
Goat serum	Thermo Scientific, Germany	50197Z	Goat Serum
DAKO Fluorescent Mounting Medium	Dako Denmark	S3023
Dako pen	Dako Denmark	S200230-2
TissueFAXSi plus	TissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)		Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b	Thermo Scientific, Germany	A-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1)	Thermo Scientific, Germany	A-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain)	Thermo Scientific, Germany	A-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent	Thermo Scientific, Germany	R37606