Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un protocollo per l'imaging in vivo della retina di topo con tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione spettrale dominio (SD-OCT). Si concentra sulle cellule retiniche del ganglio (RGC) nella regione peripapillare, con diverse analisi e quantificazione approcci descritti.

Abstract

Cambiamenti strutturali nella retina sono manifestazioni comuni di malattie oftalmiche. Tomografia a coerenza ottica (OCT) consente la loro identificazione in vivo— rapidamente, in modo ripetitivo e ad alta risoluzione. Questo protocollo descrive la formazione immagine OCT nella retina di topo come un potente strumento per studiare i neuropathies ottici (OPN). Il sistema OCT è un'alternativa non invasivi, basati su interferometria a comuni post-mortem analisi istologica. Esso fornisce una valutazione rapida e accurata di spessore retinico, consentendo la possibilità di tenere traccia delle modifiche, come assottigliamento retinico o ispessimento. Vi presentiamo il processo di imaging e l'analisi con l'esempio della riga del mouse^delTTAG Opa1. Sono proposti tre tipi di scansioni, con due metodi di quantificazione: pinze standard e fatti in casa. Quest'ultima è la migliore per uso sulla retina peripapillary durante le scansioni radiali; essere più precisi, è preferibile per l'analisi di strutture più sottili. Tutti gli approcci descritti qui sono progettati per le cellule retiniche del ganglio (RGC) ma sono facilmente adattabili ad altre popolazioni cellulari. In conclusione, l'OCT è efficiente in phenotyping modello del mouse e ha il potenziale per essere utilizzato per la valutazione affidabile degli interventi terapeutici.

Introduzione

L'OCT è uno strumento diagnostico che facilita l'esame delle strutture retiniche¹, tra cui la testa del nervo ottico (ONH). Nel corso degli anni è diventato un indicatore affidabile della progressione di malattia in esseri umani^2,3, così come in roditori^4,5. Utilizza interferometria per creare immagini a sezione trasversale degli strati retinici ad una risoluzione assiale di 2 µm. Lo strato più interno è il livello fibre nervose retiniche (RNFL), contenente assoni RGC, cui fa seguito lo strato di cellule del ganglio (GCL), contenenti principalmente RGC corpi. Successiva è lo strato plessiforme interno (IPL), dove si incontrano gli assoni delle cellule bipolari, orizzontali ed amacrine dendriti RGC. Questi, insieme alle cellule orizzontali, formano lo strato nucleare interno (INL) e loro sporgenze connettersi con gli assoni dei fotorecettori nello strato plexiform esterno (OPL). Questo è seguito dallo strato nucleare esterno (ONL), con i corpi delle cellule del fotoricettore ed è separato dallo strato dei fotorecettori di membrana limitante esterna (OLM), chiamata anche il segmento segmento interno/esterno (IS / OS) strato. Infine, gli ultimi strati osservabili nella retina di topo sono l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e della coroide (C). Il RNFL da solo normalmente è troppo sottile per essere misurati nei topi; così, analizzando il RNFL/GCL è invece preferibile^4,5. Un'altra possibilità è lo strato complesso di GC, che contiene la seconda oltre l'IPL, rendendo più spessa e quindi ancora più facile per misurare il ott scansioni⁴. Di conseguenza, OCT può fornire informazioni sullo stato patologico della retina, come in OPNs.

In alternativa, lo spessore della retina di topo spesso viene analizzato con l'istologia post-mortem . Tuttavia, questa tecnica volti limitazioni relative alla raccolta di tessuto, fissazione, taglio, colorazione, montaggio, ecc quindi, alcuni difetti, quali i cambiamenti di spessore sottile, non possono essere rilevato. Infine, perché il mouse stesso non può essere testato alle diverse volte punti, il numero di animali per studiare notevolmente aumenta, a differenza per ottobre. Tutto sommato, la non invasività, ad alta risoluzione, con possibilità di ripetizione, monitoraggio in tempo in tempo e la facilità di utilizzo della tecnologia OCT rendono il metodo di scelta negli studi di malattia retinica.

Modelli murini vengono utilizzati per identificare i difetti del gene e per delucidare i meccanismi molecolari alla base di retinopatie⁶. OPN è una forma di retinopatia con notevoli danni al nervo ottico (ON), che si compone di circa 1,2 milioni gli assoni RGC. OPN può essere focalizzata su ON o può essere secondaria ad altre patologie, congeniti o non⁷, che conduce a perdita del campo visivo e più tardi, cecità. Tratti caratteristici di OPN sono RGC la perdita e il danno, che può essere osservata in OCT umano come RNFL e GCL assottigliamento^2,3. Nel frattempo, la patofisiologia di OPN è ancora poco conosciuta, e quindi la necessità di testare le retine del mouse rimane.

Questo manoscritto descrive l'imaging e la quantificazione di spessore di strato retinico, utilizzando l'esempio di Opa1^delTTAG mouse linea^8,9, un modello di atrofia ottica dominante (DOA)¹⁰. Per valutare la patofisiologia RGC, scansioni radiali, rettangolare e anulare sono stati quantificati. Questo è stato fatto con pinze originali fornite dal software OCT o con una macro fatti in casa, sviluppato per un programma di elaborazione di immagini open source. Le pinze di serie sono difficili da manipolare e spesso più spessa di RNFL/GCL, mentre le pinze fatte in casa sono facili da usare, riproducibili e più precisa. La macro esegue una misurazione per un livello rilevato automaticamente, in 5 punti e in posizioni fisse, su entrambi i lati di ONH nella regione peripapillare. L'obiettivo del protocollo presentato è di descrivere acquisizione scansione OCT per specificare il posizionamento della retina, con un focus su RGCs.

Protocollo

il protocollo sperimentale è stato approvato dall'Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Francia), è coerente con le direttive europee e l'istruzione di ARVO è conforme per l'uso di animali nella ricerca oftalmica. È stato effettuato nell'ambito dell'accordo del Languedoc Roussillon Comity etico nella sperimentazione animale (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. installazione dell'apparecchiatura e la preparazione pre-formazione immagine

Nota: qui, l'OCT è stata eseguita su retine del mouse utilizzando il sistema di imaging oftalmica dominio spettrale (SD) ( Figura 1A). L'apparato di SD-OCT è costituito da una base e un animale Monte imaging (AIM) con una fase di allineamento del roditore (RAS) ( Figura 1B). La base include il computer, il motore di OCT, la sonda di SD-OCT e la lente specifica del mouse. La sonda è montata l'obiettivo, che comprende il Z-traduttore. La RAS è utilizzato per mouse posizionamento grazie al tavolo con il X - e Y-traduttore, la cassetta può essere ruotata e ruotata e la barra di morso rimovibile con la band di naso. Il software fornito dal produttore consente l'acquisizione e l'analisi dei file di personalizzazione, anche se quest'ultimo può essere fatto anche con un programma di elaborazione di immagini open source.

1. Saldamente posizionate la sonda nello scopo.
2. Collegare l'obiettivo specifico del mouse alla sonda.
3. Regolare le impostazioni del braccio di riferimento per l'obiettivo specifico (qui, potenza a 086 e posizione al 964).
4. Assicurandosi che la specifica del mouse lente sono sufficientemente distante dalla cassetta, collegare la barra di morso con il nastro a naso sulla cassetta.
   Nota: La distanza tra la lente e la cassetta può essere regolata con la vite di Z-traduttore, situata nella parte posteriore l'obiettivo. La capezzina è un elastico disponibile in commercio, e la sua tensione deve essere regolata in base alle dimensioni del mouse.
5. Accendere l'alimentatore (angolo inferiore destro del carrello) e quindi il computer.
6. Per lanciare il programma di imaging, fare doppio clic sul collegamento appropriato sullo schermo.
   Nota: Questo dipende dal tipo di lente; qui, Mouse Retina.
7. Creare un nuovo studio clinico e aggiungere i protocolli desiderati. In caso contrario, utilizzare l'esistente studio clinico e/o protocolli.
   1. Aggiungere un nuovo studio scegliendo la " Studio NameŔ " IDŔ " trattamento braccio specifiche " (qui, " Uncategorized "); e predefiniti " scansione protocolli ", se esistono.
8. Scegli un " esaminatore " alla " studio clinico " sezione.
   Nota: per un nuovo " esaminatore ", vai a " Setup esaminatori & medici " per definire it.
9. Aggiungi un nuovo paziente nel paziente/esame sezione cliccando su Aggiungi paziente; entrando il " ID ", " nome ", " cognome ", " sesso ", e " data di nascita " (facoltativo).
   Nota: Eseguire questa operazione solo prima di testare ogni mouse, se più conveniente. Assicurarsi che l'ID è non più di 10 caratteri. Per il mouse, l'errore di rifrazione per entrambi gli occhi è 0 e la lunghezza assiale è 23.0.
10. Fare clic su " aggiungere esame " e selezionare il " protocollo " aggiungendo " Preset scansioni " dall'elenco, a partire con l'occhio che si misurerà in primo luogo (qui, l'occhio di destra), o personalizzando le scansioni.
11. Per personalizzare una scansione, utilizzare una scansione esistente come un modello e modificarlo oppure crearla da zero attraverso il " aggiungere la scansione personalizzata " opzione. Dopo aver aggiunto tutte le scansioni all'elenco, definire un nuovo protocollo utilizzando il " invio " nuovo protocollo nome " opzione (OS: oculus sinister, sinistro occhio; OD: oculus dexter, giusto contorno occhi).
    Nota: Qui, il protocollo coinvolge tre scansioni: (i) una scansione radiale, con un diametro di 1,4 mm, offset orizzontale e verticale 0 mm, 1.000 righe di A-scansioni/B-scan, 100 B-scansioni/volume, 1 telaio/B-scan, 80 linee di inattivi A-scansioni/B-scan e 1 volume; (ii) una scansione rettangolare, con una lunghezza di 1,4 mm e larghezza, angolo 0°, 0-mm offset orizzontale e verticale, 1.000 righe di A-scansioni/B-scan, 100 B-Scan, 1 telaio/B-scan, 80 linee di inattivi A-scansioni/B-scan e 1 volume; e (iii) un anulare scansione, con un diametro di massimo minimo e 0,6 mm 0,4 mm, 0-mm offset orizzontale e verticale, 1.000 righe di A-scansioni/B-scan, 3 B-scansioni/volume, 48 fotogrammi/B-scan, 80 linee di inattivi A-scansioni/B-scan e 1 volume.

2. Preparazione del mouse

1. immobilizzazione e dilatazione degli occhi
   1. almeno 15 minuti prima dell'acquisizione dei dati, instillare gocce di occhio di fenilefrina 10% negli occhi del mouse, rimuovere l'eccesso e instillare gocce per gli occhi tropicamide 0,5%.
      Nota: La prima dilatazione può essere fatto in una sola volta per tutti i topi che saranno testati nella sessione. Assicurarsi che i liquidi siano a temperatura ambiente.
   2. Subito dopo l'induzione anestesia generale (punto 2.2), amministrare 0,4% oxybuprocaine collirio di cloridrato, mantenendoli in luogo per 3 s per anestetizzare e immobilizzare gli occhi. In seguito, pulire le gocce e ripetere l'instillazione di tropicamide fenilefrina e 0,5% di 10% per accertare che gli occhi sono ben dilatati.
      Nota: Assicurarsi che i liquidi siano a temperatura ambiente e che il mouse non inghiottire il oxybuprocaine.
2. Anestesia generale
   1. preparare una soluzione di anestetica di ketamina (20 mg/mL) e xilazina (1,17 mg/mL) in soluzione salina. Conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
   2. Circa 5 min prima del test, intraperitonealmente iniettare 5-10 µ l di soluzione anestetica per 1 g di massa del corpo, a seconda dell'età e la dimensione del mouse.
      Nota: Giovani e/o sottili topi necessità meno anestetico, prendere meno tempo per anestetizzare, ma anche risvegliare più velocemente. Qui, 8 µ l/g (160 mg/kg di ketamina, 9,33 mg/kg di xilazina).
   3. Facoltativamente, lubrificare gli occhi con il collirio viscoso o un gel oftalmico per evitare secchezza cornea.

3. Posizionamento del mouse

1. lubrificare gli occhi con viscoso a base di glicol occhio scende a fornire idratazione corneale.
   Nota: Se gli occhi sembrano asciutti durante l'esame, ri-applicare il collirio.
2. Avvolgere il mouse in un foglio di garza chirurgica per tenerlo caldo.
3. Usando uno stoppino di spugna o di cotone, applicare un sottile strato di un gel oftalmico con 0,3% ipromellosa su ogni occhio, per ridurre al minimo la rifrazione della luce, evitare opacità e sicuro idratazione corneale. Mentre così facendo, spostare le ciglia e baffi da parte.
4. Posizionare il mouse nella cassetta, con la testa in avanti dritto e puntamento.
5. Delicatamente aprire il morsetto di barra di morso e posizionare la barra in bocca; utilizzare la banda di naso per fissare la posizione.
   Nota: Assicurarsi che la barra di morso è al centro della cassetta.
6. Posto un cotone rotolare sotto la destra (sinistra), se l'occhio destro (sinistro) è in fase di test.
7. , Mantenendo la punta che mira a clip sulla lente specifica del mouse, portarlo verso l'occhio ruotando in senso antiorario la vite di Z-traduttore.
8. Di rotanti ed oscillanti la cassetta e ruotando la barra di morso e le viti X-translator, pre-impostare la posizione del mouse; l'obiettivo è di avere il look di occhio destro direttamente nell'obiettivo e quindi di allineare gli assi ottici degli occhi e la lente.
   Nota: Se il mouse è troppo alta o troppo bassa, la vite di Y-traduttore dovrebbe essere utilizzata in primo luogo.
9. Scegliere la prima scansione nella " esame ", fare clic su " iniziare puntando " e apportare le modifiche ulteriormente manuale per imaging retinico.
   1. Con la vite di Z-traduttore, spostare la retina verticalmente sul pannello di sinistra ( Figura 2, l'allineamento orizzontale B-scan) e orizzontalmente sulla rPannello di volo ( Figura 2, l'allineamento verticale B-scan).
   2. Ruotare la cassetta per portare il ONH al centro del pannello di destro spostando il ONH su o giù. Utilizzare la vite a morso per raddrizzare la retina sul pannello di destra. Girevole la cassetta per posizionare il ONH al centro del pannello sinistro.
   3. Utilizzare la vite di X-traduttore a livello della retina sul pannello di sinistra. Tenendo a mente la funzione principale di ogni modulatore, regolare ulteriormente la posizione della retina per centralizzare il ONH.
      Nota: Utilizzare la vite di Y-traduttore per spostare il ONH su e giù sul pannello di destra, se necessario. La posizione può essere raffinata in qualsiasi momento tra le scansioni.

4. SD-OCT Imaging del ONH e della Retina

1. una volta che il contenuto con le regolazioni, fare clic su " istantanea di avviare " per iniziare la scansione di SD-OCT.
   1. Se un imaging 3D non è necessario, deselezionare l'opzione OCU.
2. Salvare la scansione e la relazione.
3. Procedi con le scansioni prossime.
4. Per realizzare l'immagine il secondo occhio, dopo la lente di retrazione, girare la cassetta conseguenza e ripetere passaggi 3.6-4.3.

5. Completamento di acquisizione

1. quando l'acquisizione è completa, rimuovere il mouse dal cassetto, applicare gel oftalmico con ipromellosa 0,3% per ciascun occhio e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a wake up.
2. Dopo l'ultima acquisizione, chiudere il software e spegnere il computer e la macchina di OCT (pulsante di alimentazione di alimentazione).
3. Pulire la cassetta con un disinfettante.

6. Analisi

1. per la misura di spessore di strato retinico, utilizzare il software di segmentazione automatizzata fornito dal produttore.
   1. Fare clic sul " paziente ", scegliere il desiderato " esame " da allora elenco e fare clic sul " Review esame " opzione.
   2. Caricare i dati desiderati OCT sul software OCT facendo clic destro sull'icona della cartella nella scansione desiderata.
   3. Destra cliccare su B-scan; configurare le pinze consentendo fino a 10 misura pinze; e inserire i loro nomi, angoli e colori.
   4. Scegliendo la pinza desiderata facendo un clic destro sull'esplorazione di B; posto di conseguenza sulla retina per misura.
      Nota: Per le scansioni centrate sul ONH, impostare 5 pinze su ogni lato di essa, equidistanti tra loro. Per l'analisi di peripapillary, assicurarsi che la pinza non sia troppo lontano dall'ONH. Per la scansione radiale, analizzare 10 immagini a scansione che sono stati scelti dal software OCT. I numeri possono essere trovati nella " report " cartella.
   5. Salvare i risultati per l'analisi in un programma di software di foglio di calcolo facendo clic destro su B-scan e facendo clic " salvare risultati ".
      Nota: I risultati si trovano nella stessa cartella come la scansione dati.
2. In alternativa, utilizzare la macro di pinza fatti in casa, " MRI Retina strumento ", sviluppato per un programma di elaborazione di immagini open source (Vedi la tabella materiali).
   1. Assicurarsi che il " MRI Retina strumento " e il " strumento di sezione poligono modificare " macro sono attive. Caricare l'immagine. Clicca sul pulsante per avviare la misurazione m.
      Nota: La macro crea automaticamente uno 0.2 mm lunga Cassetta su entrambi i lati del ONH di misura. Ogni cassetta contiene 5 punti di misurazione di tale funzione come pinze. Loro posizione laterale è immutabile ed è personalizzato per la peripapilla nelle scansioni radiali. La posizione orizzontale delle cassette è predefinita per misurare lo spessore RNFL/GCL, ma è facilmente modificabile per misurare il livello complesso GC invece. Se la qualità di scansione è scarsa, la posizione orizzontale deve essere adeguato o l'immagine deve essere esclusa dall'analisi.
   2. Per la regolazione orizzontale, fare clic sul pulsante e. Nella nuova apertura " ROI Manager " finestra, scegliere la prima cassetta.
   3. Clicca sul poligono blu pulsante e regolare la posizione della cassetta prima cliccando sui bordi del livello misurato nella foto.
   4. Ripetere per la seconda cassetta di prima scelta nel " Manager di ROI " finestra e facendo clic sull'immagine appropriata. Fare clic sul pulsante r per misurare di nuovo. Visualizzare i risultati nella " misure " finestra.
      Nota: I risultati possono essere copiati a un programma di software di foglio di calcolo in qualsiasi momento. Essi contengono i seguenti valori per il cassetto destro (r), cassetto sinistro (l) e totale: Intden - densità integrata all'interno della cassetta; : Superficie della misurazione, in mm ²; Len: lunghezza della pinza entro la cassetta, in mm; Significa: dire intensità del segnale all'interno della cassetta; e Std: errore standard della media intensità del segnale.
   5. Procedere con la prossima immagine.
   6. Ulteriormente analizzare i dati in un programma di software di foglio di calcolo.
      Nota: Per trovare lo spessore medio dello strato, prendere la Len di dieci valori.

Risultati

La tecnologia SD-OCT consente immaginando retinica, analisi di spessore che sono paragonabile alla istologia, ma sono più veloce e più dettagliata (Figura 3). Come presentato con wildtype topi C57Bl/6, anche se la qualità di un'acquisizione di SD-OCT (Figura 3A, destra) non è così buona come quella di un'immagine di una sezione trasversale della retina (Figura 3A, sinistra), Visualizza più stra...

Discussione

Il sistema di OCT, un non-invasiva in vivo imaging metodo, fornisce scansioni simil-cross-sezione della retina ad alta risoluzione. Così, il suo principale vantaggio è il suo potenziale per un'analisi dettagliata, con la meravigliosa opportunità di recepire i protocolli ordinariamente applicati agli esseri umani di modelli murini.

Nell'esempio di Opa1^delTTAG topi mutanti, SD-OCT risultati hanno mostrato un aumento di spessore di strato complesso RNFL e GC, che h...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3"x3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant