Purificazione del compartimento di membrana per la degradazione del reticolo endoplasmatico-collegata di antigeni esogeni in Cross-presentazione

Riepilogo

Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione dei compartimenti cellulari dove antigeni esogeni vengono elaborati dal reticolo endoplasmatico-collegata di degradazione in cross-presentazione.

Abstract

Le cellule dendritiche (DCs) sono altamente capace di elaborare e presentare antigeni esogeni interiorizzati su classe di istocompatibilità (MHC) sono molecole conosciuto anche come cross-presentazione (CP). CP svolge un ruolo importante non solo nella stimolazione dell'ingenuo CD8⁺ T cellule e memoria CD8⁺ T cellule per infettive e immunità del tumore ma anche nell'inattivazione di self-acting le cellule T naive di anergia delle cellule T o l'eliminazione delle cellule T. Sebbene il meccanismo molecolare critico del CP rimane essere delucidato, raccogliendo la prova indica che antigeni esogeni vengono elaborati tramite associati al reticolo endoplasmatico degradazione (ERAD) dopo l'esportazione da Tronchetti endocitosi scomparti. Fino a poco tempo, caratterizzazioni di questi comparti endocitosi sono stati limitati perché non c'erano specifici marcatori molecolari diversi da antigeni esogeni. Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione di questi comparti endocitosi. Utilizzando questo microsoma purificato, abbiamo ricostituito il ERAD-come trasporto, ubiquitinazione e l'elaborazione del antigene esogeno in vitro, suggerendo che il sistema ubiquitina-proteasoma elaborato l'antigene esogeno dopo l'esportazione da questo compartimento cellulare. Questo protocollo possa essere applicato ad altri tipi di cella per chiarire il meccanismo molecolare di CP.

Introduzione

Il MHC sono molecole sono espresse sulla superficie di tutte le cellule nucleate, con brevi peptidi antigenici derivati da antigeni endogeni, che vengono elaborati dal sistema ubiquitina-proteasoma nel cytosol¹. Dopo l'elaborazione, peptidi antigenici sono trasportati nel lume del reticolo endoplasmatico (ER) del trasportatore di peptidi TAP. Nel lume dell'ER, una serie di specifiche chaperoni assistere il caricamento del peptide e il corretto ripiegamento del MHC I complessi. Questa serie di molecole è chiamato il complesso peptide-caricamento (PLC), che indica che l'ER è un vano centrale per peptide caricamento su MHC I². Dopo peptide di caricamento, il MHC sono molecole vengono trasportati alla superficie delle cellule e svolgono un ruolo chiave nel sistema immunitario adattativo come auto-marcatori e consente il CD8⁺ linfociti T citotossici (CTL) per rilevare le cellule tumorali o agenti infettivi di antigenica peptidi da proteine non-sé³.

In cellule (APC) presentanti l'antigene, peptidi antigenici da antigeni esogeni sono anche presentata al MHC I^4,5,6,7,8 tramite CP, che è trasportato principalmente fuori da DCs^9,10,11. CP è essenziale sia per l'attivazione di ingenuo CD8⁺ T cellule e memoria CD8⁺ T cells in anti-infettivi e anti-tumorali CTLs^12,13e nel mantenimento della tolleranza immunitaria inattivando di self-acting cellule T naive^14,15. Il CP svolge molti ruoli importanti nel sistema immunitario adattativo, tuttavia i meccanismi molecolari della CP devono ancora essere descritti dettagliatamente. Gli studi precedenti di CP ha rivelato che antigeni esogeni sono stati localizzati in ER e l'endosoma e sono stati elaborati dal ERAD, suggerendo che antigeni esogeni sono trasportati dall'endosoma al pronto soccorso per ERAD-come elaborazione e peptide caricamento¹⁶ . Tuttavia, raccogliendo la prova indica che il caricamento del peptide di CP è effettuato non in ER, ma piuttosto in compartimenti endocitosi non classici, che hanno anche caratteristiche distintive del ER (Figura 1)^{17,18 ,19,20,21}. Per evitare la degradazione dei precursori del peptide antigenico dall'alta attività di aminopeptidasi²² nel citosol, elaborazione e caricamento in CP peptide si verifica nella zona prossimale di questi comparti endocitosi non classici (Figura 1). Anche se le caratterizzazioni di questi comparti endocitosi sono controverse, non ci sono nessun esistenti specifiche molecole diverse da antigeni esogeni in questo comparto.

ERAD è una via cellulare, che in particolare rimuove le proteine misfolded dall'ER. Nella via ERAD, proteine misfolded vengono retrogradely trasportate attraverso la membrana ER al citoplasma ed elaborate dal sistema ubiquitina-proteasoma^23,24,25. Quando le molecole di grandi dimensioni, quali le proteine, vengono trasportate attraverso il doppio strato lipidico, queste molecole passano attraverso un apparato molecolare chiamato complesso in un Traslocone, come il complesso di Sec61 e Derlin complesso l'ER²⁶, e il complesso Tom e Tim il i mitocondri²⁷. Quando esogenicamente aggiunto gli antigeni vengono trasportati attraverso la membrana dell'ER, essi devono penetrare bilayer del lipido in complesso con translocons, come il complesso di Sec61. Il metodo qui descritto purificato la vescicola mirata utilizzando queste molecole di membrana-penetrante come marcatori per i compartimenti endocitosi.

Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di purificazione di vescicola utilizzando il DC-come cella linea DC2.4²⁸ e biotinilati ovoalbumina (bOVA) come un antigene esogeno. I compartimenti endocitosi sono stati purificati da streptavidina (SA)-biglie magnetiche utilizzando il bOVA membrana-penetrante come un creatore. In questo microsoma purificato, alcuni esogenicamente aggiunto bOVA era ancora conservata nelle frazioni della membrana ma sono stato trasportato all'esterno del microsoma e poi ubiquitinate e trattato in vitro²⁹. Questo microsoma purificata contenuta non solo proteine endocitiche vano, ma anche proteine ER-residente per ERAD e il peptide caricamento complesso; suggerendo che il compartimento cellulare è il vano endocitico prospettico per CP²⁹. Questo protocollo non è dipenda dal tipo di antigeni esogeni e vale anche per altri sottoinsiemi di DC e altri tipi di cellule, quali i macrofagi, linfociti B e cellule endoteliali, per chiarire il meccanismo molecolare preciso di DCs per CP abile.

Protocollo

1. crescere cellule e aggiunta di antigeni esogeni

1. preparare bOVA utilizzando un contrassegno di biotina-della proteina kit seguendo il produttore ' protocollo s.
   Nota: Normalmente, bOVA contiene biotina di 2 M per 1 M OVA mediamente.
2. DC2.4 crescere le cellule in RPMI-1640 completate con 2 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 100 U/mL penicillina-streptomicina, 55 mM 2-mercaptoetanolo, 10 mM HEPES (pH 7.5) e 10% siero fetale del vitello (d'ora in avanti RPMI) a 37 ° C in 5 % CO ₂ in un incubatore (d'ora in avanti senza menzione, le cellule vengono incubate a questa condizione). È anche possibile utilizzare DMEM completati con 10% siero fetale di vitello, 3,7 g/L NaHCO ₃ (d'ora in avanti DMEM) al posto di RPMI.
3. Un giorno prima di purificazione, dividere le celle in RPMI a 1 x 10 ⁵ cellule/mL in una piastra di coltura del tessuto. Evitare di mantenere le cellule in uno stato confluente. DC2.4 cellule possono altamente incorporare antigeni esogeni fino a uno stato semi-confluente, ma perdono rapidamente la capacità dopo aver raggiunto uno stato di sovra-confluenti.
4. Prima the DC2.4 cellule sono semi-confluenti, aggiungere 250 µ g/mL di bOVA per 1 x 10 ⁶ cellule/mL e incubare per 2-4 h.
   Nota: Durante gli esperimenti a valle, tutti i buffer e i reagenti sono conservati a 4 ° C se non diversamente indicato.

2. Preparazione dei microsomi

1. raccolto le cellule DC2.4 di pipettaggio delicato dalla piastra di tessuto in una nuova provetta conica 50 mL.
2. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min, 4 ° C e sfilare con cautela il mezzo con bOVA aspirazione.
3. Lavare le cellule DC2.4 due volte con 40 mL di tampone PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH ₂ PO ₄) mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min, 4 ° C e scartare il supernatante ogni volta dall'aspirazione.
4. Risospendere il pellet in passaggio 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 di volume di terreno di coltura) del mezzo di omogeneizzazione (0,25 M saccarosio, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore di proteasi e trasferimento del sedimento DC2.4 di celle in un ghiacciata lisata omogeneizzatore.
5. Frantumare le cellule DC2.4 sedimento delicatamente da 10-20 colpi con l'omogeneizzatore lisata ghiacciata.
   Nota: Durante la fase di rottura, l'omogeneizzatore lisata è raffreddato su Ice.
6. Trasferire la sospensione cellulare-interrotto ad un nuovo tubo conico da 15 mL.
7. Aggiungere 8-9 mL di terreno di omogeneizzazione a totale di 10 mL e centrifugare la provetta conica per 10 min a 2.000 x g e 4 ° C.
8. Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica 15 mL per rimuovere cellule ininterrotte e nuclei e centrifugare la provetta conica ancora per 10 min a 2.000 x g e 4 ° C.
9. Trasferire il surnatante in un nuovo ultracentrifugazione provetta e centrifugare per 45 min a 100.000 x g e 4 ° C.
10. Aspirare il supernatante e risospendere il sedimento con attenzione in 1-2 mL di terreno di omogeneizzazione con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore di proteasi pipettando la soluzione su e giù più volte per rendere una frazione del microsoma per esperimenti a valle.
11. Trasferire la frazione del microsoma in una provetta da 5 mL fondo tondo nuovo.
    Nota: Dopo questo passaggio, è possibile arricchire i microsomi oggettive di centrifugazione in gradiente di densità iodixanol secondo il produttore ' protocollo s, rimuovere aspecifici microsomi. Le frazioni di picco per antigeni esogeni sono raccolti e poi sottoposto al passaggio successivo di purificazione (passaggio 3).

3. Purificazione dei microsomi con bOVA ERAD che subiscono

1. volume aggiuntivo 1/100 di fresco SA-magnetico perline alla frazione del microsoma di passo 2.11 nei 5 mL fondo tubo tondo.
   Nota: Prima di questo passaggio, è possibile pre-cancellare la frazione del microsoma di controllo magnetico perline per ridurre contaminazioni dei microsomi aspecifici.
2. Delicatamente mescolare bene e ruotare il tubo del fondo tondo lentamente per 30 min a 4 ° C.
3. Aggiungere 2-3 mL di terreno di omogeneizzazione a 4 mL totale nella provetta fondo tondo e miscelare bene.
4. Mettete il tubo fondo tondo su un supporto magnetico e incubare per 10 min a 4 ° C. Poiché le perline associate alle vescicole sono attratti dal magnete, microsfere marrone si accumulano gradualmente alla parete del tubo più vicina al magnete.
5. Con il tubo attentamente restanti nello stand magnetico, scartare i surnatanti di aspirazione per rimuovere le vescicole non associate.
6. Lavare i branelli magnetici vincolati alle vescicole due volte con 5 mL di medium di omogeneizzazione magnetico riposare per 10 min a 4 ° C e scartare il surnatante ogni volta accuratamente aspirando.
   Nota: Senza il supporto magnetico, purificazione tramite le centrifugazioni a 2.000 x g per 10 min, 4 ° C è disponibile anche.
7. Risospendere i branelli magnetici associati alle vescicole attentamente nel medium di omogeneizzazione 100 µ l pipettando la soluzione su e giù più volte.
8. Trasferire le vescicole sedimento in una microprovetta nuova come il microsoma purificato per esperimenti a valle.
   Nota: In genere, 50 µ l del microsoma frazione contenente 5-20 µ g proteine da 1 x 10 ⁷ cellule può essere isolato.

4. Analisi dei microsomi del purificato

perle

1. risospendere il magnetico associati alle vescicole da passo 3.8 da 100-200 µ l di tampone TNE (pH a 20 mM Tris-HCl 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore della proteasi invece il mezzo di omogeneizzazione.
2. Trasferire il lisato dal punto 4.1 una nuova microprovetta 1,5 mL.
3. Determinare la concentrazione di proteina di fase 4.2 utilizzando un kit di test BCA per il produttore ' protocollo s.
   Nota: In genere, 5-10 µ l lisato dalla fase 4.2 è sufficiente per determinare la concentrazione nella proteina.
4. Trasferire il lisato dalla fase 4.2 (2 µ g di proteina per la macchiatura d'argento e 10 µ g di proteina per macchiarsi occidentale) in nuove microprovette.
5. Mettere le microprovette su un blocco di calore alle proteine 95 ° C e far bollire in 1x tampone di gel-caricamento SDS (100 mM Tris-HCl a pH 6.8, bromofenolo 200 mM dithiothreitol, 4% SDS, 0,2%, 20% glicerolo) per 5 min.
6. Centrifugare le microprovette per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. raccogliere i surnatanti in nuove microprovette per rimuovere le frazioni insolubili.
7. Analizzare le proteine risolte nel passaggio 4.6 (2 µ g) di SD-pagina standard.
8. Visualizzare le bande proteiche dall'argento che macchia usando la macchiatura d'argento kit in seguito il produttore ' protocollo s.
9. Analizzare le proteine risolte nel passaggio 4.6 (10 µ g) di SD-pagina standard e il Western blotting. Utilizzare il reagente (SA-HRP) per il produttore ' s protocollo e visualizzare da fluorography.

5. In Vitro Ricostituzione di ERAD ubiquitinazione di bOVA usando purificato microsomi

1. trasferimento purificato microsomi (5-10 µ g di proteine) dal passaggio 3.8 con un 50% del volume del reticulocyte lysato (RL), 1 x tampone di reazione (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl ₂) e 12:02 ubiquitina etichetta a bandiera in una nuova microprovetta. Il volume finale di questo esperimento è 20-40 µ l.
2. Incubare la provetta per 2 ore a 37 ° C.
   Nota: Se la quantità di bOVA ubiquitinata nel passaggio 5.12 è troppo piccola per rilevare mediante Western blotting, aggiungere 10 µM di MG132 o 2 µM di lactacistina per inibire l'elaborazione di bOVA l'ubiquitinate da proteosomi.
3. Fermare la reazione inserendo nella microprovetta su ghiaccio.
4. Risolvere i microsomi aggiungendo 500 µ l di tampone TNE con volume di 1/1.000 di cocktail di inibitore di proteasi.
5. Centrifugare la provetta per 10 min a 21,500 x g e a 4 ° C. raccogliere i surnatanti in una nuova microprovetta per rimuovere le frazioni insolubili, che contengono ubiquitinate bOVA in DC2.4 prima del dosaggio di ubiquitinazione in vitro.
6. Trasferire il surnatante ad una nuova microprovetta e aggiungere volume 1/100 di nuove perline SA-magnetico (solitamente 5 µ l per 500 µ l di surnatanti).
7. Delicatamente mescolare bene e ruotarlo nella microprovetta lentamente per 30 min a 4 ° C.
8. Centrifugare la provetta per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. scartare il surnatante dall'aspirazione a recuperare la bOVA e bOVA ubiquitinate associato con i branelli magnetici SA.
9. Lavare due volte i branelli magnetici SA raccolti con 1 mL di tampone TNE mediante centrifugazione per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. scartare il supernatante ogni volta dall'aspirazione.
10. Bollire i branelli magnetici SA in 1x tampone per 5 min a 95 ° C su un calore-blocco per risolvere le proteine purificate mediante i branelli magnetici SA di caricamento del gel di SDS.
11. Centrifugare la provetta per 10 min a 21.500 x g e 4 ° C. raccogliere i surnatanti in una nuova microprovetta per rimuovere le frazioni insolubili.
12. Analizzare i branelli magnetici SA vincolati alle proteine standard SD-PAGE e Western blotting. L'uso di anticorpi (Anti-Flag, anti-multi-Ub e anti-mouse IgG-HRP) e il reagente (SA-HRP) è per il produttore ' protocollo s e visualizzate da fluorography.

Risultati

Per delucidare il meccanismo molecolare di CP, è necessario identificare i compartimenti cellulari, dove antigeni esogeni subiscono ERAD-come trasporto e la lavorazione. Mentre le osservazioni da microscopia di immunofluorescenza o da microscopia elettronica identificato il compartimento cellulare dove antigeni esogeni accumulato^16,17,18,19

Discussione

Negli studi precedenti di CP, gli antigeni esogeni incorporati accumulato nell'area riservata del tardo endosoma o ER da microscopia immunofluorescente^16,30,31,32. Si stima che ERAD-come trasporto e la lavorazione di antigeni esogeni sono effettuate in queste aree specialistiche dell'ER o endosoma tardivo, come il compartimento cellulare è stato identificato da saccarosio o centrifugazione su ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Equitech bio	SFB30
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penisicillin-Sreptomycin	gibco by life technologies	15140-122
DMEM	gibco by life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotin-protein labelling kit	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce homogenizer	IUCHI	131703
protease inhibitor cocktails	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-magnetic beads	New England Biolabs	201270
control magnetic beads	Chemagen	M-PVA012
magnetic stand	BD Biosciences	552311
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225
silver staining kits	Cosmo bio	423413
Reticulocyte Lysate	Promega	1730714
Flag-tagged ubiquitin	SIGMA	U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse)	Antibody Shop	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse)	MBL	D058−3
anti-Flag (mouse)	SIGMA	F3165
trypsin	SIGMA	85450C