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요약

합성, 특성, 및 성인 zebrafish 조직학 분석 및 탐지 하는 Alzheimer의 질병 모델을 설정 하에 아 밀 로이드 독성을 생성 하기 위한 단위체 아 밀 로이드-β42 펩 티 드의 사출이이 프로토콜에 설명 합니다. 집계입니다.

초록

Alzheimer의 질병 (광고) 이며 독성 아 밀 로이드-β42의 어떤 축적에 펩 티 드 (Aβ42) 시 냅 스 변성, 염증, 신경 죽음에 이르게 하는 신경 퇴행 성 질병을 쇠 약하게 적자를 학습. 인간 신경 줄기/뿌리 세포 (NSPCs)와 감소 된 성체의 장애인된 증식 능력 때문에 광고의 경우 손실된 신경을 재생성 수 없습니다. 따라서, 효율적인 재생 치료 또한 확산을 강화 한다 neurogenic 용량의 NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) 재생 유기 체, 그리고 우리는 설계할 수 있는 기본적인 분자 프로그램을 배울 수 있는 광고를 태 클에 치료 접근입니다. 이러한 이유로, zebrafish에 광고와 같은 모델의 생성이 필요 했다. 우리의 방법론을 사용 하 여, 성인 zebrafish 뇌 조직 관통 기능 Aβ42 펩 티 드의 합성 파생 상품을 소개 하 고 질병 병 리 및 재생 응답 분석 수 있습니다 우리. 기존의 방법 또는 동물 모델에 장점은 그 zebrafish 수 우리를 가르쳐 어떻게 척추 뇌 수 자연스럽 게 재생성, 따라서 생 NSPCs를 대상으로 하 여 더 나은 인간의 신경 퇴행 성 질환을 치료 하는 데 도움이. 따라서, 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델의 신경 과학 및 임상 의학 분야에서 연구를 위한 새로운도 열 수 있습니다. 또한,이 방법의 간단한 실행 비용 효과적이 고 효율적인 실험 평가 대 한 수 있습니다. 이 원고는 합성 zebrafish 두뇌에 Aβ42 펩 티 드의 주입을 설명합니다.

서문

광고 뉴런의 손실에 의해 특징 만성 진보적인 질병 이며 대뇌 피 질1,2,3,,45synapses. 광고의 고전 neuropathological 특징 녹말 체 펩 티 드의 증 착 이며 형성 된 neurofibrillary tangles (NFTs)6. 치 패, 녹말 체 패로 알려진 뇌 실질5β 주름을 잡은 구조를 형성 하는 아 밀 로이드 β (Aβ) 펩 티 드 구성 됩니다. 광고 환자에서 Aβ42의 축적 질병의 진행에는 초기 하 고 중요 한 역할을 하고있다. 광고의 시 냅 스 기능 장애, 장애인된 소성 및 신경 손실7,8,,910이벤트를 트리거합니다.

Teleost zebrafish의 두뇌의 줄기 세포가 소성11,12,13,,1415, 의 규칙을 공부 하는 우수한 모델 역할 16,,1718,,1920 및 광고21,22,23 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 다양 한 질병 ,24. 사용할 수 있는 실험 방법을19,20,25,26,,2728,29, 의 광대 한 배열을 때문 30 , 31이 학문은 유익 하 고 실현. Zebrafish는 CNS13,15,32,33,,3435,36,37, 보충 수 있습니다. 38, 일부 신경 손실19,39,40,41,,4243, 후에 활성화 하는 분자 프로그램을 사용 하 여 44. 따라서, zebrafish neurodegenerative 질병 모델 수립 척 추가 있는 두뇌에서 재생 능력 및 줄기 세포 생물학에 관한 주소 소설 질문을 도울 수 있다.

최근에, 우리는 합성 Aβ42 펩 티 드 (표 1)39를 주입 하 여 성인 zebrafish 뇌에 아 밀 로이드 독성 모델 개발. 이 주입 발생 neurodegeneration 고기 (예를 들어, 세포 죽음, microglial 활성화, 시 냅 스 변성 및 메모리 적자), 인간의 두뇌 병 리를 연상 시키는 그 zebrafish 도출을 위해 사용할 수 있습니다 나타내는 zebrafish 뇌에서 neurodegeneration, 펩 티 드 immunohistochemical stainings, 및 CNS 수 성인 zebrafish에 중생의 분자 메커니즘으로 검출 될 수 있다 Aβ4239식별. 이 프로토콜에서 사용 하는 cerebroventricular 주입 (CVMI) 방법27,39,,4546 제 브라 두뇌에 합성 녹말 체 펩 티 드의 주입 시연 모방 녹말 체 증 착 (그림 1). CVMI 주입 β 장 구조에 따라 집계 하 고 독성을 발휘 펩 티 드를 제공의 새로운 방법을 제공 합니다. 펩 티 드 전체 rostro 꼬리 축45를 따라 심 실 지역 대상으로 뇌에 걸쳐 균등 하 게 배포 됩니다. 또한이 메서드는 녹말 체 포함에 따라 성인 zebrafish 두뇌에 있는 NSPCs의 형태학 및 분자 응답을 분석 하기 위한 수 있습니다. 이러한 연구 결과 제공할 것입니다 우리에 게 통찰력 포유류에서 성공적인 뇌 수리에 대 한. 광고 같은 증상이 보충 손실 된 신경 세포의 기능 회복을 유도 후 성공적인 재생 응답의 필요한 분자 메커니즘을 이해 하 우리의 메서드를 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 EU 지침에 의해 제안 된 표준 절차 (2010/63) 및 생물학 및 의학 (EuFishBioMed)에서 칼 스루 Insitute의 기술 (KIT)에서 물고기 모델에 대 한 유럽 사회. 여기 후 설명 하는 모든 메서드 (Landesdirektion 드레스덴; 문서 번호 TVV-52/2015) 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.

1. Aβ42 펩 티 드의 준비

  1. 종합 펩 티 드 (표 1 참조) 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-와 표준 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 화학을 사용 하 여 tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) 자동화 된 단단한 단계 펩 티 드 합성기 52에 결합 시 약으로. 합성의 규모는 100 µmol.
  2. 단단한 단계 (0.2 m m o l/g의 용량 로드)로 자동된 펩타이드 합성기 Fmoc 보호 수 지의 500 mg와 로드. 녹은 Fmoc 보호 아미노산 농도 0.5 M에 로드에 필요한 볼륨 및 각 합성기에 대 한 계산으로.
    참고: 계산 수 지 47 각 빌딩 블록의 5 배 초과로 두 번 각 보호 Fmoc 아미노산의 결합 수 있도록 만들어집니다.
  3. 는 Dimethlyformamide (DMF)에 펩 티 드 합성에 필요한 시 약 분해. 예를 들어 비 반작용 하는 아미노 그룹 모자는 활성 제, HBTU, 0.48 M, 45 %v / v N-Methylmorpholine (NMM) (베이스), 그리고 5 %v / v 아세트산 무수 물 (상한 혼합물)의 농도에 준비.
  4. Trifluoroacetic 산 (TFA)의 구성 된 갓된 분열 혼합물에 교 반기를 사용 하 여 고체 지원 지속적으로 혼합 하 여 수 지에서 모든 펩 티 드를 쪼개 다: Triisopropylsilane(TIS): 물: 90 (v/v)에 Dithiothreitol (DTT): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2.5 (m/v), 4 헤 사용 10 mL 100 µmol의 합성 규모.
  5. 100 mL 차가운 diethyl 에테르를 분열 혼합물을 추가 하 여 쪼개진된 제품 침전. 0.45 μ m의 기 공 크기와 소계 (PTFE) 필터와 20 mL 차가운 diethyl 에테르와 세척을 포함 하 여과 장치를 통과.
  6. 필터 종이에서 필터링 된 펩 티 드를 수집 하 고 디졸브 100mg 5 mL에 침전 된 펩타이드의 이온을 제거 된 증류수: 1: 1에서 이기.
  7. 구슬 크기 10 µ m의 다공성 폴리스 티 렌 divinylbenzene 열을 갖춘 반 대리점 HPLC에 역 상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 Purify.
    1. 전 열이 열 하 고 열 난방 장치를 사용 하 여 50 ° C에서 유지 합니다. 5%에서 100% 용 매 B 4 mL/분에서 25 분 이상으로 그라디언트를 적용 하 여 자동된 분수 수집기를 사용 하 여 모든 주요 분수 수집
      참고: 용 매 A는 0.1 %TFA 물과 용 매 B에는 0.1 %TFA 이기 52.
    2. 220에서 크로마 모니터링, 적절 한 봉우리를 수집 및 LC-씨를 사용 하 여 분석
  8. 확인 분석 역에 의해 순도 단계 초고 압력 액체 크로마토그래피 (UPLC)에서 220 nm UV 검출기 분석 C18 열 (구슬 크기 1.7 µ m)를 통해 샘플을 전달 하는 동안 모니터링 하 여. 질량 분석에 의해 펩 티 드 제품을 확인.
    참고: 있는 UPLC 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)와 협력 하 여 사중 극 자 검출기를 결합 이다.
  9. 무성 한 분말 0.052 mbar의 진공을 적용 하 여 둥근 바닥 플라스 크에 원하는 펩 티 드의 정확한 분수를 lyophilize. -80 ° C에서-78 ° C. 점에서 무기한 유지 냉동 장치에 진공 펌프를 커플.
  10. 이기의 혼합물에 1 mM의 재고 솔루션을 준비 하는 동결 건조 된 펩 티 드를 사용 하 여: DMF: 분석 학년 물 1:1: 1은 실험에 대 한. 이 솔루션으로는 펩 티 드가이 솔루션에서 집계 하지 않는 6 개월 이상 저장 될 수 있다.

2. 사출 혼합물의 준비

  1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나 2 HPO 4, 2mm KH 2 포 4, pH 7.4) 동결 건조 된 펩 티 드를 diluting에 대 한 준비.
  2. 는 PBS에서 20 µ M의 최종 농도에 펩 티 드를 분해. 이 솔루션 신선한 준비. 잘 혼합 하 고 주사까지 얼음에 저장 합니다. 솔루션에서 집계를 방지 하기 위해 30 분을 초과 하지 마십시오.

3. 마 취

  1. 준비 마 취약, 0.1% 에틸-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB)는 순환에서 일반 물고기 물에서의 재고 솔루션 시스템. 0.0025% (v/v)의 최종 농도에 anaesthetization 솔루션 준비.
  2. 시스템 물 5 l 운송 컨테이너에 그들의 탱크에서 물고기의 원하는 번호를 제거.
  3. 절반 채우기 플라스틱 페 트리 접시 (90mm) 40 mL 마 취약. 이 접시를 사용 하 여 주사.
  4. Opercular 운동 정지 했습니다 때까지 마 취약에 물고기를 품 어.

4. Cerebroventricular Microinjection

  1. 사출 기구 준비
    1. 준비 유리 주입 모세 혈관 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음 매개 변수: 난방 사이클, 537, 당기 주기, 250, 속도, 1.5 s; 시간, 80 양
    2. 25 psi 압력 소스에 압력 설정을.
    3. 다음에 microinjector 매개 변수를 설정: 보류 20 psi 압력, 압력 추출 10 psi; 기간 값 2.5 제어 값 100 양
    4. 주입 솔루션 유리 모 세관을 로드합니다. Microinjection 홀더에 유리 모 세관을 삽입 합니다. 45 ° 분사 각도 조정.
      참고: 참조 27 , 46에 설명 된 대로 찾을 수 있습니다 더 자세한 프로토콜.
  2. Anaesthetization 솔루션 (3.3 단계)로 가득한 장소 새로운 배양 접시에 생선.
  3. 집게와 주입에 대 한 동양 물고기 잡고.
  4. 생성 사용 하 여 30 G 바늘의 팁 두개골에 광섬유 tectum에 두 개의 측면 판 만나는 슬릿. 뇌 조직에는 팁을 삽입 하지 마십시오,이 출혈과 손상을 일으킬 것입니다. 27 , , 45 46 대 한 자세한 내용은 참조 하는 참조 하십시오.
  5. 슬릿 유리 모 세관 삽입.
    1. 바늘의 팁만을 사용 하 고 두개골을 통해 1 m m 이상 침투 하지 않습니다. 물고기를 잡고 유지 하 고 유리 절 개 사이트를 통해 모 세관의 끝을 삽입.
    2. 동양 유리 쪽으로 45 ° 각도로 telencephalon 모 세관의 끝. 솔루션의 1 µ L을 주입. 액체 주입 직후 분 광.

5. 복구

  1. 물고기 다시 복구 될 때까지 전송 컨테이너 장소. 최적의 수 질을 보장 하기 위해 정기적으로 순환 물고기 물에 컨테이너를 연결.
    참고: 복구를 일반적으로 1 분 소요 됩니다. 오래 걸리면, 물고기는 마 취약에서 (이 실험에 의해 최적화가 필요한) 짧은 시간에 대 한 보관 해야 합니다.

6. 조직 준비 및 단면화

  1. 물고기를 희생 하기 전에 원하는 기간에 대 한 대기.
    참고:이 실험 질문에 따라 달라 집니다. 아 밀 로이드 증 착 주입 후 1 일 일찍 볼 수 있습니다.
  2. 윤리 규정에 따라 적절 한 방법을 사용 하 여 물고기를 희생 (예, 0.1 M MESAB 물고기 치료).
  3. 지적된 forcep 등 쪽 측에 사용 하 여 광섬유 tectum 위에 두개골을 자르면 고 메스를 사용 하 여 가슴 지 느 러 미 바로 뒤에 머리 부.
  4. 수정 2 %paraformaldehyde (PFA)를 사용 하 여 머리 하룻밤 플라스틱 튜브에 인당 PFA의 4 ° C. 사용 3 mL에 나사 뚜껑.
    주의: PFA를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용.
  5. Cryoprotection, decalcification, 0.1 m M에서 세 번 머리를 세척에 대 한 인산 염 버퍼 (pH 7.4), 20% sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) 솔루션으로 그들을 전송 그리고 4에서 밤새 품 어 ° c.
    6. 수 지, 단면으로 조직을 포함
  6. 드라이 아이스 (블록을 고정 하려면 약 3-5 분)에 플라스틱 조직학 금형에 7.5 %gelatin/20% 자당 솔루션에 머리 고정. -80 ° C에서 샘플을 저장 하거나 (cryosectioning) 다음 단계로 진행.
  7. 12 µ m 두께 cryosections 설명된 28 , 42는 cryostat를 사용 하 여에 머리를 섹션. 유리 슬라이드에 직접 cryosections를 전송 및 장기 사용-20 ° C에서 저장.

7. Immunohistochemical 얼룩 및 현미경

참고: 습도 챔버에 모든 인큐베이션 단계를 수행 하십시오. 그리고, 모든 세척 단계 10 분.

  1. 건조 실 온에서 30 분 동안 섹션. 녹고, 후 PBS에 두 번, 한 번 PBSTx에 섹션을 세척 (0.03 %PBS-x-100).
  2. 품에서 4 ° C 하룻밤. 주 항 (안티-Aβ42 항 체; PBSTx에서 1: 500 희석)와 함께 다음 날, 세척 한 번 PBS에 PBSTx에 두 번.
  3. DAPI 함께 보조 항 (형광 결합 감지, 1: 500 희석)와 섹션을 품 어 (1 μ g/mL) 실 온에서 2 h에 대 한 PBSTx에.
  4. PBSTx에 세 번 세척입니다. 최종 세척 후 coverslip 100 μ 70% 글리세롤을 사용 하 여 슬라이드 마운트.
  5. 취득 형광 이미지 confocal 현미경을 사용 하 여 (예를 들어와 20 X PL APO 없음 0.7 목표 488 여기 범위와 표준 녹색 필터; 그림 2) 39.

결과

HPLC는 합성된 펩 티 드를 정화 하는 데 사용 되었다 그리고 질량 분석 순화 된 아 밀 로이드 β 펩 티 드를 특성화 하는 데 사용 되었습니다. HPLC 열 Aβ 펩 티 드의 분리를 개선 하는 50 ° C에가 열 되었다 그리고 모든 분수 수집 했다. 올바르게 합성된 펩 티 드를 식별 하기 위해 모든 분수에 대 한 질량 분광학 분석 수행 되었다. UPLC 크로마 화합물의 순도 보여준다. UPLC (즉

토론

녹말 체 펩 티 드 순서 변화 또는 다양 한 태그를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 스크램블된 녹말 체 펩 티 드 생성 될 수 있습니다, 그리고는 펩 티 드 펩 티 드 끝의 N-말단에 형광 태그와 함께 표시 하거나 캐리어 펩 티 드39태그 수 있습니다. 마찬가지로,이 프로토콜에 캐리어 펩타이드는 세포 관통 펩 티 드 TR 전송 화물 깊은 그 효과 때문에 뇌 조직39<...

공개

저자 공개할 게 없다

감사의 말

이 작품은 DZNE와 헬름홀츠 협회 (VH-NG-1021), CRTD에 의해 지원 되었다 TU 드레스덴 (FZ-111, 043_261518), 그리고 DFG (KI1524/6) (C.K.); 그리고에 의해 Leibniz 협회 (보고-2011-IPF-2) BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). 우리는 또한 감사 하 Ulrike 호프만 펩 티 드 종합을 위한 Nandini Asokan, Prayag Murawala, 그리고 엘리 다나카 절차를 촬영 하는 동안 도움 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Fmoc-protected amino acidsIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1030Activator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)RL-1180Racemization supressor
N,N-DiisopropylethylamineIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-003Base
DimethylformamideIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)SOL-004Solvent
N-MethylmorpholineThermo Fisher (Kandel) GmbH, GermanyA12158Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)157260 ALDRICHActivator
PiperidineMERCK KGaA (Darmstadt, Germany)822299Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)106050Solvent
Formic acid (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)100264Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)808260Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)233781 ALDRICHClevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LSolvent
Acetonitrile (for HPLC)VWR International Ltd, England83639.320Solvent
DiethyletherVWR International Ltd, England23811.326Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd, England0281-25GClevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resinRapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)S30023Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filtersIntavis AG (Cologne, Germany)34.274Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filterSartorius Stedtim (Aubagne, France)11806-50-NFilteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filterCarl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Pre-filteration for HPLC
Peptide SynthesizerIntavis, Cologne, GermanyResPep SLAutomated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, USAWaters 2998, Waters e2695Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Germany00G-4328-N0Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filterEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USALCPAK0001Water purification system
Filtration UnitSartorius Stedtim (Aubagne, France)16307Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAM09UPA 664MAnalytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, USA186002350Analytical C18 column
ACQUITY TQ DetectorWaters, Milford Massachusetts, USAQBB908Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany16706, 101542Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate readerBeckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)Sigma-AldrichA5040
Petri dishesSarstedt821.472
Phosphate-buffered salineLife Technologies, GIBCO10010-056
NeedleBecton-Dickinson305178
Dissecting microscopeOlympus, Leica, ZeissVaries with the manufacturer
Dumont TweezersWorld Precision Instruments501985
Gillies Dissecting ForcepsWorld Precision Instruments501265
Glass injection capillariesWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Pneumatic PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light GuideParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950

참고문헌

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