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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

Abstract

Analisi multiplex della proteina ha mostrato sensibilità diagnostica superiore e precisione rispetto alle singole proteine. Microarrays dell'anticorpo consentono migliaia di test immunodiagnostici di micro-scala eseguite contemporaneamente su un singolo chip. Formato di dosaggio sandwich migliora la specificità dell'analisi rilevando ogni destinazione con due anticorpi, ma soffre di reattività crociata fra i reagenti, limitando così la loro capacità di multiplexing. Microarray di colocalizzazione dell'anticorpo (ACM) è stato sviluppato per la rilevazione di proteine "multiplex" cross-reactivity-gratis, ma richiede un costoso spotter in loco per la produzione di microarray durante le analisi. In questo lavoro, dimostriamo una tecnologia di chip di snap che trasferisce il reagente da microarray a DNA-microarray di schiocco semplicemente due chip insieme, che così nessun spotter è necessaria durante l'incubazione del campione e la successiva applicazione degli anticorpi di rilevamento (danti) su deposito di diapositive pre-macchiati, dissociando la preparazione del vetrino dall'esecuzione di test. Entrambi i metodi di trasferimento di singole e doppie sono presentati per ottenere l'allineamento tra i due microarray e la fabbricazione di diapositiva per entrambi i metodi sono descritti. I risultati indicano che < 40 μm allineamento è stato realizzato con doppio trasferimento, raggiungendo una densità di matrice di 625 punti/cm2. Un immunoassay 50-plexed è stato condotto per dimostrare l'utilizzabilità del chip lo snap in analisi multiplex della proteina. Limiti di rilevazione delle 35 proteine sono nella gamma di pg/mL.

Introduzione

Un pannello di biomarcatori che comprende proteine multiple può fornire maggiore sensibilità e specificità rispetto al singolo biomarcatore nella diagnosi di malattie complesse come cancri1,2. L'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) è stata la tecnologia di gold standard utilizzata nei laboratori clinici, raggiungimento di un limite di rilevazione a basso pg/mL nel plasma, ma limiti a una sola destinazione per dosaggio3,4,5. Microarrays dell'anticorpo sono stati sviluppati per accogliere migliaia di saggi miniaturizzati condotto in parallelo su un microscopio singola diapositiva6,7,8. Tuttavia, la capacità di multiplexing di questo metodo è limitata dalla reattività crociata reagente-driven, derivanti dall'applicazione di una miscela di dAbs, e diventa più problematico con un numero crescente di target9,10 , 11. Pla et al. hanno dichiarato che la vulnerabilità risultante di un'analisi multiplex panino bilance come 4N(N-1) dove N è il numero dei bersagli12.

Per attenuare la reattività crociata in microarrays dell'anticorpo, anticorpo colocalizzazione microarray (ACM) è stato sviluppato nel nostro laboratorio per sandwich multiplex assay12. Gli anticorpi di cattura (cabine) sono macchiati su un substrato con uno spotter di microarray. Dopo blocchi campioni vengono applicati sulla superficie, e quindi i singoli tocchi sono macchiati sulle stesse macchie con il complesso antigene-cabina. Tutti gli scenari di reattività crociata tra antigeni e anticorpi possono essere mitigati con ACM e limiti di rilevazione a pg/mL sono stati raggiunti. Tuttavia, il protocollo del test richiede preparazione e spotting i danti durante gli esperimenti usando un microarray in loco spotter con alta precisione per scopo di allineamento, che è costoso e richiede tempo, limitare l'ampia applicazione di questa tecnologia in altri laboratori. Un palmare ACM, denominato snap chip è stato sviluppato per cross-reactivity-gratis e privo di spotter multiplex panino immunoassays13,14,15. i taxi e i tocchi sono pre-macchiati su una diapositiva di dosaggio e un trasferimento rispettivamente nel formato microarray e memorizzati. Durante il dosaggio, le diapositive vengono recuperate e un microarray di tocchi sono trasferite collettivamente il vetrino di saggio semplicemente schioccando i due chip insieme. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento affidabile reagente. Diapositive di nitrocellulosa rivestita con una capacità di legame dell'anticorpo relativamente grandi sono stati usati come gli scivoli di dosaggio per assorbire le goccioline di liquide e facilitando così il trasferimento di reagente, tuttavia, le diapositive sono più costose di microarray e diapositive di vetro regolare scanner compatibile con diapositive non trasparenti sono necessari per l'acquisizione del segnale.

In questo lavoro, dimostriamo il protocollo di esecuzione di un immunodosaggio a sandwich multiplex con un chip di snap. Un apparato di romanzo snap è stato sviluppato per il trasferimento di reagente più conveniente e affidabile da microarray a DNA-microarray. Cosa importante, qui abbiamo stabilito il metodo di trasferimento di reagente su vetrini regolari con il chip di snap. 1024 punti correttamente trasferiti e allineati su una lastra di vetro, espandendo significativamente l'uso di questa tecnologia nella maggior parte dei laboratori.

Protocollo

1. fabbricazione e deposito di scatto chip

  1. metodo di trasferimento singolo ( Figura 1a)
    1. Spot cabina soluzioni contenenti 400 µ g/mL anticorpi e glicerolo 20% in tampone fosfato salino (PBS) su una nitrocellulosa (o un bicchiere funzionalizzato) diapositiva di dosaggio con un getto di inchiostro microarray spotter 13 a un'umidità relativa del 60% (1.2 nL per ogni spot) con spaziatura di centro--centro 800 µm. Accertarsi che il vetrino sia fissato sul ponte spotter secondo un angolo (qui, nell'angolo inferiore sinistro è stato utilizzato).
    2. Incubare il vetrino di saggio macchiato a temperatura ambiente per 1 h con un'umidità relativa del 60%.
    3. Morsetto una guarnizione di modulo diapositiva a 16 scomparti sul vetrino di saggio di dividerlo in 16 pozzetti. Sciacquare il vetrino tre volte con l'aggiunta di 80 µ l di PBS contenente 0.1% Tween-20 (PBST) in ogni bene e agitazione a 450 giri/min con un agitatore, 5 min ogni volta.
    4. Aggiungere 80 µ l di bloccare soluzioni per ogni bene e agitare per 1 h a 450 giri/min.
    5. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino di saggio con un flusso di azoto.
    6. Fissare un trasferimento sul ponte spotter e spingere nell'angolo inferiore sinistro della diapositiva contro angolo inferiore sinistro del ponte spotter. A getto d'inchiostro spot matrice di segni di allineamento (una soluzione di microsfere di polistirolo) con lo stesso layout che per i taxi.
    7. Asciugare i segni di allineamento. Capovolgere la diapositiva di trasferimento e rimetterlo sul ponte spotter, fissaggio contro l'angolo inferiore sinistro.
    8. Preparare il dAb spotting soluzioni contenenti 20 µ g/mL anticorpi, 20% glicerolo e BSA 1%.
    9. Utilizzando lo spotter ' s fotocamera, prendere una foto di un marchio di allineamento. Implementare questa immagine nel programma spotting come un fiducial e ottenere il sistema di riconoscimento di immagine del cercatore a getto d'inchiostro per identificare il marchio di sinistro più in alto. Usare la sua coordinata come il primo spot della matrice dAb. Spot 8 nL per goccia con una spaziatura da centro a centro di 800 µm.
  2. Metodo di trasferimento doppia ( Figura 1b)
    1. disporre un vetrino di trasferimento 1 sul ponte spotter inkjet contro l'angolo inferiore sinistro. Individuare soluzioni di cabine contenenti 400 µ g/mL anticorpi, glicerolo 20% e 1% BSA in PBS sulla diapositiva con un spotter di microarray a getto d'inchiostro ad un'umidità relativa del 60% (0,4 nL per ogni spot e ~ 200 µm di diametro). La spaziatura da centro a centro è 400 µm.
    2. a scatto il trasferimento con una nitrocellulosa rivestito (o un bicchiere funzionalizzato) dosaggio diapositive utilizzando un apparato di snap ( Figura 2) per trasferire le goccioline di cabina il vetrino di saggio.
      1. Disabilita tutti i sei pulsanti sul lato apparato snap di 90 gradi per tirare e bloccare tutti i tuffatori in posizione aperta. Inserire la diapositiva di trasferimento il portavetrini in suo recipiente con l'angolo tagliato rivolto verso il perno fisso pogo. Girare la prima serie di tre pulsanti per rilasciare i tuffatori con il perno d'oro pogo e assicurarsi che le diapositive vengono spinti contro i perni di allineamento.
      2. Inserire una diapositiva rivestite con nitrocellulosa in snap apparato capovolto udienza i 4 perni di pogo. Girare la seconda serie di tre pulsanti per rilasciare pressori con il perno d'argento e assicurarsi che le diapositive vengono spinti contro i perni di allineamento.
      3. Chiudere l'apparecchio snap posizionando il guscio superiore sulla porta diapositive utilizzando i pilastri di allineamento e fori per un posizionamento preciso.
      4. Inserire l'apparecchio snap chiuso nella sua gabbia e spingere la linguetta di chiusura completamente verso il basso per portare i microarrays faccia a faccia, esercitando la pressione appropriata. Tenere chiuso per 1 min.
    3. Separare le diapositive. Incubare il vetrino di saggio a temperatura ambiente per 1 h con un'umidità relativa del 60%. Lavare, bloccare e far asciugare il vetrino di saggio come descritto nei passaggi 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Mettere un altro trasferimento slide sul ponte spotter inkjet e spingere contro l'angolo inferiore sinistro. Soluzioni punto dAb contenente 50 o 100 µ g/mL di anticorpi (Vedi tabella 1), glicerolo 20% e 1% BSA in PBS. Garantire che ogni luogo è 0,8 nL e la spaziatura da centro a centro tra spot è 400 µm.
    5. Memorizzare il dosaggio e lo scivolo di trasferimento. Guarnizione sia saggio e trasferimento i vetrini in un sacchetto ermetico contenente essiccante e messo in un congelatore a-20 ° C.

2. Multiplexed immunodosaggi con snap chips

  1. recuperare il vetrino di saggio dal freezer. Lasciare il sacchetto sigillato per 30 min fino a quando la diapositiva viene a temperatura ambiente.
  2. Preparare 7 punti serie campione soluzioni diluite di chiodare proteine in PBS contenente 0.05% Tween-20.
    Nota: Qui, viene utilizzato un fattore di diluizione 5 volte. Le concentrazioni di partenza per ogni proteina sono elencate nella tabella 1.
  3. Preparare soluzioni campione come appropriato. Ad esempio, diluire il siero umano 4 volte in tampone PBST.
  4. Morsetto una guarnizione 16-vano sulla diapositiva test.
  5. Riempire una colonna di 8 pozzetti con le soluzioni di diluizione 7 proteina e una soluzione di tampone PBST privo di proteine di pipettaggio. Pipettare soluzioni campione in altri 8 pozzetti nella stessa diapositiva.
    Nota: 80 soluzioni µ l possono essere in forma in ogni bene. Altre diapositive possono essere utilizzati per misurare campioni supplementari quando necessario.
  6. Incubare i campioni su un agitatore a 450 giri/min per 1 h a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. lavare il vetrino tre volte con PBST sull'agitatore a 450 giri/min, 5 min ogni volta. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino sotto un getto di gas azoto.
  7. Recuperare la diapositiva di trasferimento con i tocchi dal freezer. Tenere il sacchetto sigillato per 30 min a temperatura ambiente. Quindi, incubare il vetrino in una camera chiusa (ad esempio casella vuota suggerimenti) contenente microsfere di stabilizzazione di umidità 60% per 20 min per reidratazione.
  8. a scatto la diapositiva di trasferimento con il vetrino di saggio utilizzando un apparato di snap ( Figura 2) per trasferire le goccioline di dAb. Vedere sezione 1.2.2 per il funzionamento dell'apparato snap.
  9. Separare le diapositive. Incubare il vetrino di saggio in una camera chiusa contenente microsfere di stabilizzazione di umidità 60% per 1 h. morsetto il vetrino di saggio con una guarnizione di 16-vano e sciacquare il vetrino 4 volte con PBST su un agitatore a 450 giri/min, 5 min ogni volta.
  10. Pipetta 80 µ l di soluzioni contenenti 2,5 µ g/mL streptavidina fluoroforo in PBS in ciascun pozzetto. Incubare per 20 minuti su un agitatore a 450 giri/min.
  11. Sciacquare il vetrino 3 volte con PBST e una volta con acqua distillata sull'agitatore a 450 giri/min. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino utilizzando gas azoto.

3. Far scorrere la scansione e analisi dei dati

  1. scansione il vetrino di saggio con uno scanner di microarray di fluorescenza usando il laser-nm-635.
  2. Estrarre l'intensità netta di ogni spot utilizzando un'analisi software (ad es. matrice-pro analizzatore) 16.
  3. Calcolare il limite di rilevabilità (LOD) di ogni proteina usando un software di statistiche e determinare le concentrazioni di proteina nei campioni.
    Nota: Il LOD è definito come l'intercetta Y della norma cuRVE incrementato di tre volte la deviazione standard dei tre saggi indipendenti.

Risultati

La procedura di analisi per singolo e doppio metodi di trasferimento è mostrato nella Figura 1. Nel singolo trasferimento, le cabine sono macchiate direttamente nella diapositiva saggio e i tocchi vengono trasferiti nella diapositiva di analisi al momento dell'impiego in un modello di specchio delle carrozze (Figura 1a). Un solo trasferimento procedura è necessaria, ma questo metodo soffre di disallineamento tra i due microarra...

Discussione

In questo lavoro, abbiamo presentato una tecnologia di chip di snap che rende i test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex ampiamente disponibili per i ricercatori con base messa a punto sperimentale. Diverso da microarrays dell'anticorpo esistente, nessun spotter microarray è necessaria per gli utenti finali. Sono dimostrati sia singola che doppia i metodi di trasferimento, e raddoppiare il transfer offre una precisione di allineamento superiore verso il basso per ~ 40 μm per macchie di 98%, con il più grand...

Divulgazioni

McGill University ha presentato una domanda di brevetto su alcuni aspetti di questo lavoro con Huiyan Li e David Juncker come inventori.

Riconoscimenti

Ringraziamo il Dr. Rob Sladek per l'uso del cercatore a getto d'inchiostro. Riconosciamo il supporto finale da istituti canadesi per Health Research (CIHR), scienza naturale e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC), l'Istituto di ricerca di società cancri canadese e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI). D.J. grazie sostegno da un Canada Research Chair.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline tabletFisher Scientific5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5Rocklands000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
Bovine serum albuminJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
GlycerolSigma-AldrichG5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray StabilizerSurModics, IncSG02
Nitrocellulose coated slidesGrace Bio-Laboratories, Inc305116
Aminosilane coated slidesSchott North America1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
Inkjet microarray spotterGeSiMNanoplotter 2.0
Slide module gasketGrace Bio-Laboratories, Inc204862
Humidity Stabilization BeadsParallex BioAssays Inc.PBA-HU60
Array-Pro Analyzer softwareMedia CyberneticsVersion 4.5
Fluorescence microarray scannerAgilentSureScan Microarray Scanner
Biostatistics softwareGraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
Endoglin capture antibodyR&D SystemsMAB10972
Endoglin proteinR&D Systems1097-EN
Endoglin detection antibodyR&D SystemsBAF1097
IL-6a (see Table 1)R&D Systems
IL-6b (see Table 1)Invitrogen

Riferimenti

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