Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca^{2 +} Import Assay mit Ca^{2 +} sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca^{2 +} Farbstoffs Rhod-2/AM.

Zusammenfassung

Ca^{2 +} Handhabung durch Mitochondrien ist eine kritische Funktion reguliert physiologische und pathophysiologische Prozesse in einem breiten Spektrum von Zellen. Die Fähigkeit, genau den Zustrom und Ausfluss von Ca^{2 +} von Mitochondrien zu messen ist wichtig für die Bestimmung der Rolle der mitochondrialen Ca^{2 +} Umgang in diesen Prozessen. In diesem Bericht stellen wir Ihnen zwei Methoden zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Handhabung in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Wir beschreiben zunächst eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme über die Ca^{2 +} sensibler Farbstoff Kalzium grün-5N. Leser-basierte Plattenformat umgeht die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung und Kalzium grün-5N Farbstoff ist ideal geeignet zur Messung von Ca^{2 +} aus isolierten Gewebe Mitochondrien. Für unsere Anwendung beschreiben wir die Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in den Mitochondrien von Herzgewebe Maus isoliert; Allerdings kann dieses Verfahren angewendet werden, zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in den Mitochondrien isoliert von anderen Geweben wie z. B. Leber, Skelettmuskel und Gehirn. Zweitens, beschreiben wir eine konfokale Mikroskopie-basierten Test zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} in permeabilized Zellen mithilfe des Ca^{2 +} sensibleren Farbstoffs Rhod-2/AM und imaging mit 2-dimensionale Laserscanning-Mikroskopie. Dieses Protokoll Permeabilisierung beseitigt cytosolischen Farbstoff Kontamination, spezifische Aufzeichnung der Veränderungen der mitochondrialen Ca^{2 +}ermöglicht. Laserscanning-Mikroskopie ermöglicht darüber hinaus hohe Bildraten erfassen schnelle Veränderungen mitochondrialen Ca^{2 +} als Reaktion auf verschiedene Medikamente oder Reagenzien in die externe Lösung angewendet. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in vielen Zelltypen, einschließlich Primärzellen wie kardialen Myozyten Neuronen und immortalisierte Zelllinien zu messen.

Einleitung

Mitochondrien sind kritische Websites der intrazellulären Ca^{2 +} -Lager- und Signaltechnik. Jahrzehntelange Forschungen haben gezeigt, dass Mitochondrien die Fähigkeit haben zu importieren und sequester Ca^{2 + 1,2}. Mitochondrien, sind jedoch nicht nur passive Websites von Ca^{2 +} -Lager. Ca^{2 +} auf die mitochondriale Kompartiment führt grundlegende Signalisierung Funktionen einschließlich der Regulierung metabolische Ausgabe und Aktivierung von mitochondrialen vermittelte Zelle Tod wegen, wurde zuvor³überprüft. Für die Stoffwechselregulation erhöht Ca^{2 +} die Aktivität von drei Matrix-lokalisierte Dehydrogenases Tricarboxylic Säure Zyklus sowie die Atmungskette komplexe, Erhöhung der Mitochondrien Energie Produktion^4,5 . Mit mitochondrialen Ca^{2 +} Überlastung und Dysregulated mitochondriale Ca^{2 +} Handling Ca^{2 +} Trigger mitochondrialen Permeabilität Übergang pore (MPTP) Öffnung, was zu inneren mitochondrialen Membran Permeabilisierung, Membran Verlustrisiko, mitochondriale Dysfunktion, Schwellungen, Bruch und letztlich Zelle Tod^6,7,8,9. Daher wirkt sich mitochondriale Ca^{2 +} Signalisierung direkt zelluläre Leben und Tod Wege durch metabolische Kontrolle und MPTP-Tod-Achse.

In den letzten Jahren, es wurde rasch erweitert Interesse an der Erforschung der mitochondrialen Ca^{2 +} Dynamik im großen Teil zur Identifizierung der molekularen Bestandteile der mitochondrialen Ca^{2 +} Uniporter Komplex, eine mitochondrial Inner Membran-Transporter, der eine primäre Ca^{2 +} ist in der mitochondrialen Matrix ^10,11,12importieren. Identifizierung von diesen strukturellen und regulatorischen Untereinheiten der Uniporter hat die Möglichkeit, gezielt genetisch mitochondriale Ca^{2 +} Zustrom zu modulieren, mitochondriale Funktion und Dysfunktion hervorgebracht und erleichtert das Studium der der Beitrag der Uniporter komplex und mitochondriale Ca^{2 +} Zustrom Krankheit^13,14,15. In der Tat hat die mitochondriale Ca^{2 +} Signalisierung in den Pathologien von den unterschiedlichsten Krankheiten wie Herzerkrankungen, Neurodegeneration und Krebs^{16,17,18verwickelt, 19,20}.

Angesichts der grundlegenden Bedeutung der mitochondrialen Ca^{2 +} signalisieren in den Stoffwechsel und Zelltod und kombiniert mit der großen Reichweite von biologischen Systemen auswirkt, mitochondriale Ca^{2 +} Signalisierung, Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom von großem Interesse sind. Nicht überraschend, wurden eine Vielzahl von Techniken und Instrumenten zur mitochondrialen Ca^{2 +} Messung entwickelt. Dazu gehören Methoden, die nutzen Sie Tools wie z. B. fluoreszierende Ca^{2 +}-empfindlichen Farbstoffen^21,22 und genetisch codierte Ca^{2 +} Sensoren gezielt zu den Mitochondrien, wie z. B. Cameleon und Aequorin^{23, 24}. Das Ziel dieses Artikels ist, markieren Sie verschiedene Methoden und Modellsysteme in denen mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme gemessen werden kann. Wir präsentieren zwei experimentelle Methoden zur Beurteilung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom Kapazität. Mit kardialen Mitochondrien als Beispiel, wir ausführlich eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme mit Ca^{2 +} sensible färben Kalzium grün-5N, die ideal geeignet ist für isolierte Gewebe Mitochondrien¹⁴ . Mit kultivierten Zellen der NIH-3 t 3, erläutern wir im folgenden eine konfokalen Mikroskopie Imaging-basierte Test zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} in permeabilized Zellen mit der Ca^{2 +} sensibler Farbstoff Rhod-2/AM²⁵.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Emory University genehmigt.

Hinweis: Der erste Teil ist die Versuchsdurchführung zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom in isolierten kardialen Mitochondrien mit einem Teller-Reader.

(1) Reagenzien und Lösungen

1. 500 mL MS-EGTA-Puffer für die mitochondriale Isolierung zu machen: 225 mM Mannit, 75 mM Saccharose, 4 5 mM-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), 1 mM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA), pH auf 7,4 eingestellt mit KOH. Durch einen 0,22-μm-Filter zu sterilisieren und bei 4 ° c Lagern Sicherstellen Sie, dass der MS-EGTA-Puffer vorgekühlt auf 4 ° C vor dem Gebrauch ist.
2. 100 mL KCl Puffer vorzubereiten: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA und pH-Wert auf 7.2 mit KOH eingestellt. Bei Raumtemperatur lagern.
3. Bereiten Sie 1 mM Kalzium grün-5N Lager in Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Die Kalzium-grün-5N-Aktie kann Aliquotted und bei-20 ° c gelagert
4. Substrate für Ca^{2 +} Aufnahme vorzubereiten.
   1. 1 M Natrium Pyruvat, pH 7.4 vorbereiten. Bewahren Sie es an Aliquote bei-20 ° C.
   2. 500 mM Malate, pH 7.4 vorbereiten. Bewahren Sie es an Aliquote bei-20 ° C.

2. Isolierung der kardialen Mitochondrien

1. Die Maus nach institutionellen Standards einschläfern.
   Hinweis: Für unsere institutionell anerkannte Methode der Euthanasie, Mäuse wurden betäubt durch Isofluorane Einatmen und durch zervikale Dislokation geopfert.
2. Sammeln Sie Herzen durch Eröffnung der Brusthöhle, schneiden auf beiden Seiten der Rippen entlang flankieren das Herz, die Membran wegschneiden und Herzgewebe besteuert.
   Hinweis: In diesem Protokoll erfolgt mitochondriale Isolierung aus ganzem Herzen gesammelt von einer Erwachsenen Maus (ca. 120 mg), die was für 3-4 Versuche ausreichen sollte. Für mitochondriale isoliert von anderen Mitochondrien-reichen Geweben wie der Leber kann bis zu 200 mg des Gewebes nach dem beschriebenen Protokoll verwendet werden.
3. Spülen Sie das Gewebe gründlich in 25 mL eiskaltes 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) um sicherzustellen, dass alles Blut aus den Herzkammern herausgedrückt wird.
   Hinweis: Das Herz wird ausreichend gespült werden, wenn die Flüssigkeit aus dem Herzen drückte klar ausgeführt wird.
4. Hacken Sie das Herz in kleine Stücke in 5 mL eiskaltes 1 X PBS mit einer scharfen Schere.
5. Verwerfen der PBS und Hackfleisch Herzgewebe zu einem vorgekühlt 7 mL Glas-Teflon Dounce Homogenisator mit 0,10 bis 0,15 mm Spiel zu übertragen.
6. Fügen Sie 5 mL eiskaltes MS-EGTA-Puffer und homogenisieren Sie Probe zu, bis Gewebe Stücke nicht mehr sind sichtbar (ca. 11 Striche).
   Hinweis: Nicht das Gewebe zu homogenisieren, als das Ziel ist intakte und funktionsfähig Mitochondrien zu erhalten.
7. Übertragen Sie das Homogenat auf eine 15 mL-Tube.
8. Zentrifugieren Sie das Homogenat 600 X g bei 4 ° C für 5 min zum pellet-Kerne und ungebrochene Zellen.
9. Den überstand auf eine frische 15 mL Tube übertragen und bei 10.000 x g bei 4 ° C für 10 min in Mitochondrien pellet Zentrifugieren.
10. Verwerfen Sie den überstand und halten Sie die mitochondriale Pellet auf Eis.
11. Waschen Sie die mitochondriale Pellet zweimal mit eiskalten MS-EGTA-Puffer. Für jede Wäsche Aufschwemmen der mitochondrialen Pellets in 5 mL MS-EGTA Puffer, bei 10.000 x g bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren und den überstand verwerfen.
12. Nach der letzten Wäsche überstand verwerfen und Aufschwemmen der Mitochondrien in 100 μL des Eis kalt MS-EGTA-Puffer. Halten Sie die Mitochondrien auf Eis.
    Hinweis: Mitochondrien sollte für Experimente innerhalb 1 h verwendet werden.
13. Mitochondriale Proteinkonzentration mit einem Bradford Protein Assay-²⁶zu messen.

3. Platte Leser-basierte Messung der mitochondrialen Calciumaufnahme

Hinweis: Hier ist es beschrieben das Protokoll für die Analyse der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme mit einem multimode-Platte-Reader mit Injektoren ausgestattet. Jede Platte Leser mit der Fähigkeit des Lesens Kalzium grün-5N Fluoreszenz (Anregung/Emission von 506/532 nm) in einem kinetischen Modus mit automatisierten Reagenz Injektoren, die Reaktion vor Licht geschützt zu halten verwendet werden können.

1. Programm der Platte Leser eine kinetische durchführen von Kalzium grün-5N Fluoreszenz mit Messungen pro Sekunde für eine gesamte Assay 1.000 lesen s. zusätzlich, Reagenz Injektoren, 5 μL CaCl₂ -Lösung auf die 30 zu verzichten-Programm s, 150 s, 300 s , 480 s und 690 s Zeitpunkten.
   Hinweis: Der Zeitplan für das CaCl₂ Injektionen sind benutzerdefiniert und experimentelle Bedürfnissen angepasst werden können.
2. Erstklassige Reagenz Injektoren mit CaCl₂ -Lösung verwendet werden.
   Hinweis: Die Konzentration der CaCl₂ -Lösung ist benutzerdefiniert und in nachfolgenden Ausführungen zu den Betrag von Ca^{2 +} erforderlich, um MPTP Öffnung auszulösen titrieren eingestellt werden kann.
3. Geben Sie 200 μg der Mitochondrien in einer einzelnen einer 96-well-Platte.
4. Geben Sie das entsprechende Volumen der KCl-Puffer in der, so dass das Gesamtvolumen der Mitochondrien und KCl Puffer um 197 μL geht.
5. Die Mitochondrien-Mischung 1 μL 1 M Pyruvat und 1 μL von 500 mM Malate hinzufügen. Pipettieren sanft zu mischen, und inkubieren der Mitochondrien mit der Substrate für 2 min bei Raumtemperatur erlauben Mitochondrien um erregt zu werden.
6. Fügen Sie 1 μl 1 mM Kalzium grün-5N bestand. Mischen Sie vorsichtig, durch pipettieren.
   Hinweis: Schützen Sie die Reaktion von Licht nach Zugabe von Kalzium grün-5N Farbstoff.
7. Starten Sie die vorprogrammierte kinetische Protokoll und Monitor Kalzium grün-5N Fluoreszenz.

(4) Reagenzien und Lösungen

Hinweis: Der zweite Teil ist Experimentelles Verfahren für die konfokale Bildgebung der mitochondrialen Ca^{2 +} in kultivierten Zellen

1. Tyrode Lösung (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM Glukose und 10 mM HEPES, pH 7,2 mit KOH) zu machen. Bei 4 ° c Lagern Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
2. Waschlösung (100 mM Kalium Acetat, 15 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 5 mM Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl₂, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM Phosphokreatin, 10 mM HEPES, pH 7,2 mit KOH) vorzubereiten. Bei 4 ° c Lagern Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
3. Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung, enthält 0,005 % Saponin in Waschlösung. Bereiten sie täglich frisch.
4. Bereiten Sie 0 Ca^{2 +} interne Lösung (100 mM Kalium Acetat, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH-Wert auf 7,2 mit KOH eingestellt). Bei 4 ° c Lagern Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
5. Bereiten Sie interne Lösung mit Ca^{2 +}. Die interne Lösung über fügen Sie CaCl₂ erreichen die gewünschte Konzentration von freien Ca^{2 hinzu +}. Die Höhe der CaCl₂ hinzufügen wird berechnet mit dem MaxChelator-Programm (maxchelator.stanford.edu).
6. Bereiten Sie 1 mM Rhod-2/AM Lager in DMSO und bis zur Verwendung bei-20 ° C lagern.
7. Bereiten Sie 1 mM MitoTracker Grüne Lager in DMSO und bis zur Verwendung bei-20 ° C lagern.

5. Beschichtung Zellen für die Bildgebung

1. 22 x 22 cm² Glasdeckgläser mit 100 % Ethanol waschen und Deckgläsern an der Luft trocknen lassen.
2. Legen Sie die Glasdeckgläser in einzelnen Vertiefungen der Gewebekultur 6-Well Platte.
   Hinweis: Deckgläsern können mit Laminin, Poly-L-Lysin oder ähnliche Matrix zur Förderung Zellhaftung beschichtet werden.
3. Trypsinize und Platte der Zellen auf den Deckgläsern für ca. 70 % Zusammenfluss mit dem Ziel, am Tag der Bildgebung.

6. Laden Zellen mit dem Rhod-2/AM und MitoTracker Green

1. Bereiten Sie Rhod-2/AM-MitoTracker green funktionierende Lösung. Fügen Sie 20 μL Rhod-2/AM 1 mM Lager, 0,2 μl MitoTracker Grün 1 mM Lager und 2,5 μL 20 % Pluronic F-127 zu 1 mL der Tyrode Lösung. Die Endkonzentration von Rhod-2 in die Arbeitslösung 20 µM und die Endkonzentration von MitoTracker Green 200 nM.
2. Entfernen Sie vorsichtig das Wachstumsmedium aus dem Deckglas.
   Hinweis: Ein Waschschritt ist nicht vor dem Farbstoff Lösung zusätzlich notwendig.
3. Fügen Sie die Rhod-2/AM-MitoTracker grüne Lösung tropfenweise Weise auf das Deckglas bis das Deckglas gerade ist bedeckt (ca. 3-4 Tropfen pro Deckglas).
4. 30 min bei Raumtemperatur, damit die Zellen mit den Farbstoffen laden lichtgeschützt inkubieren.
5. De-esterify Rhod-2/AM. Entfernen Sie vorsichtig die Rhod-2/AM-MitoTracker grüne Lösung, mit frischen Raumtemperatur Tyrode-Lösung zu ersetzen, und inkubieren Sie es für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden.

(7) confocal Imaging der mitochondrialen Rhod-2/AM und MitoTracker Green Fluoreszenz

1. Übertragen Sie das Deckglas auf dem Mikroskop imaging Kammer und füllen Sie die Kammer mit Waschlösung.
2. Stellen Sie unter Einstellungen für die Beobachtung von Zellen im Phasenkontrast bei 40 X die Bildschärfe bis Zellen sichtbar sind und im Fokus.
3. Permeabilize der Plasmamembran von Rhod-2/AM-MitoTracker Green geladen Zellen, Zytosol lokalisiert Rhod-2, unter Beibehaltung der Mitochondrien lokalisiert Farbstoff zu entfernen.
   1. Entfernen Sie die Waschlösung aus dem Deckglas.
   2. Ersetzen Sie es durch Permeabilisierung Lösung für ca. 1 min.
   3. Überwachen Sie visuell die Plasmamembran Morphologie im gesamten Permeabilisierung Prozess. Permeabilized Zellen entwickeln eine aufgeraute Oberfläche.
   4. Wenn Permeabilisierung abgeschlossen ist, sofort entfernen Sie die Permeabilisierung Lösung und ersetzen Sie es mit 0 Ca^{2 +} interne Lösung.
4. Gleichzeitig Bild Rhod 2 Fluoreszenz (Anregung mit dem 559 nm Laserlinie und Emission gesammelt bei Wellenlängen zwischen 575-675 nm) und MitoTracker grüne Fluoreszenz (Anregung mit 488nm Laserlinie und Emission bei Wellenlängen zwischen gesammelt 505-525 nm). Fokus auf permeabilized Zellen anzeigen eine klare ns1 Rhod-2 und MitoTracker grün.
5. Verringern des Mikroskop-Lasers und gain-Einstellungen so, dass die mitochondriale Rhod 2 Fluoreszenz dim und gerade noch sichtbar ist.
6. Wählen Sie Mikroskop Einstellungen, 2-dimensionale Scans auf einem entsprechenden Frame Rate und Zeit Platz für die jeweilige Anwendung zu erwerben. Eine Bildrate von 30 Bilder/s wird empfohlen, die Kinetik der Veränderungen der mitochondrialen Ca^{2 +}genau zu erfassen.
7. Entfernen Sie die 0 Ca^{2 +} interne Lösung ohne zu stören, die Zellen oder Mikroskop Fokus.
8. Starten Sie Bildaufnahme.
9. Fügen Sie Ca^{2 +}-vollgestopft interne Lösung bei 10 s zeigen entweder manuell oder mit einem Perfusion System.
10. Wählen Sie Regionen von Interesse (ROIs) Regionen des ns1 mitochondriale Rhod-2 bis MitoTracker grün-Signal in der Bild-Datenerfassungs-Software umfassen.
    Hinweis: Für jede ROI werden willkürlich Fluoreszenz (F) Werte für jeden Zeitpunkt der Aufnahme erzielt. Diese Werte sind Hintergrund subtrahiert und normiert auf die anfängliche Fluoreszenz (vor Ca^{2 +} Zusatz; F₀) und im Laufe der Zeit zur Datenpräsentation und Quantifizierung der Amplitude der Änderung der mitochondrialen Ca^{2 +}als F/F₀ dargestellt.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt mitochondriale Ca^{2 +} Aufnahme Messungen in isolierten kardialen Mitochondrien mit der Platte Leser-basierte Plattform und die Ca^{2 +} Kalzium grün-5N färben. Unter Kontrolle Bedingungen (Abbildung 1A), kardialen Mitochondrien in KCl-Puffer, enthält Kalzium grün-5N ausgesetzt waren und dann vor der Herausforderung, sequentielle Impulse von CaCl₂ (5 μl einer 0,6 mm CaCl₂

Diskussion

Hier beschreiben wir zwei verschiedene Ansätze zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom. Die Platte Leser-basierte Kalzium grün-5N Methode Monitore Extramitochondrial Ca^{2 +} Ebenen und ist ein Ca^{2 +} Aufnahme Assay, der gut geeignet für Messungen in isolierten Mitochondrien ist. Während wir repräsentative Ergebnisse aus isolierten murinen kardialen Mitochondrien gezeigt haben, kann dieser Assay Mitochondrien isoliert von Geweben mit hoher mitochondriale Fülle einschließlich Lebe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440