Простой проточной цитометрии на основе анализа для определения в Vitro антитела зависит повышение вируса денге, с помощью вируса Зика выздоравливающих сыворотки

Резюме

Мы опишем простой и простой протокол для измерения антитела зависит повышение инфекции от Зика выздоравливающих сыворотки вирус с помощью вируса денге репортер вирусных частиц.

Аннотация

Было показано, что антитела зависит от укрепления инфекции играют важную роль в патогенезе вирусной лихорадки денге. Традиционные анализы, которые измеряют антител или сыворотки способность повышения инфекции в недопустимых клеточных линий полагались на использование вирусных вывода в СМИ, следуют налета анализов для количественного определения инфекции. Совсем недавно эти анализы изучили денге вируса (DENV) в клеточных линий, с помощью дневно обозначенные антитела. Оба эти подхода имеют ограничения, которые ограничивают широкое использование этих методов. Здесь мы опишем простой в vitro пробирного с помощью денге репортер вирусные частицы вируса (РВП) которые выражают Зеленый флуоресцирующий белок и клетках K562 для изучения антитела зависит от повышения (ADE) DENV-инфекции с использованием сыворотки, которая была получена от резус макак 16 недель после инфицирования вирусом Зика (ZIKV). Эта техника является надежным, предполагает минимальный манипуляции клеток, не связаны с использованием живой репликации вируса и компетентных и может быть выполнена в формате высокой пропускной способности, чтобы получить количественные индикации с помощью проточной цитометрии. Кроме того этот assay может быть легко адаптирована для изучения антитела зависит от расширения (ADE) других flavivirus инфекций, таких как вирус желтой лихорадки (YFV), вирус японского энцефалита лошадей (ДЖИВ), вирус Западного Нила (ВЗН) и т.д., где имеются РВП. Простота настройки анализа, анализа данных и интерпретации результатов делает его очень поддаются большинство лабораторных параметров.

Введение

Антитела зависит от расширения (ADE) инфекции — это процесс, согласно которому частично cross-reactive антитела реакций, вызванных серотипа вируса повышает усвоение другого серотипа вируса, приводит к увеличению вирусной репликации и виремии. Аде был хорошо документированы в инфекции вируса (DENV) денге, где распространены четыре основных серотипов. В подгруппе пациентов Аде связан с геморрагической лихорадки денге (ГЛД). Недавно мы показали, что инфекции вируса (ZIKV) Зика индуцированной значительно высокий уровень DENV cross-reactive антитела ответов, которые вызвали Аде DENV в пробирке и вероятно, способствовали укреплению DENV виремии в естественных условиях^{1 , 2}. антитела зависит улучшение анализов являются ценным инструментом для оценки способности антител для повышения вторичной инфекции, связанной с вирусами и предоставлять ценную информацию в патогенезе flavivirus инфекций и информировать разработка вакцин.

Assay описанные здесь использует DENV РВП наряду с K562 клетки, которые обычно неприемлемы для инфекции. РВП являются структурно нетронутыми репликации некомпетентных DENV вирусных частиц которые кодируют репликоном суб геномных Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), которая выражается после одного раунда репликации³. Таким образом клетки, которые инфицируются РВП флуоресцировать Грин и могут быть легко обнаружены с помощью проточной цитометрии или микроскопии. РВП, используемые в этот assay были получены из коммерческих источников. Они могут однако, быть против других вирусов и используется в assay, описанные в этой рукописи. Тем временем K562 клетки являются FcγIII рецепторов выражая лейкемии клеток линии, привязка к региону Fc антител и заразиться присутствии югу нейтрализации концентрации антител в^4,5.

Аде анализы широко использовались в исследования, изучения факторов риска для тяжелой денге и определить механизмы в vitro Аде^6,,78. Assay Аде, описанные здесь можно быстро и легко использоваться для определения способности сыворотки для повышения в vitro инфекции с помощью РВП и проточная цитометрия, по сравнению с другими анализов, используемых в настоящее время, которые требуют либо определения формирования зубного налета единицы (ОРП) в клетках Vero или антитело пятная из инфицированных клеток^{6,,78,9,10,11}, оба из которых являются много времени и труда интенсивный.

протокол

Образцы сыворотки, используемый для демонстрации протокол, описанные здесь были получены от макак резус, которые были размещены и заботились в соответствии с местных, государственных и федеральных политики в ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных уход Международный (АААЛЖ)-аккредитованных объекта. Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом и образцы были приобретены через ткани, протокол обмена.

1. день 1

Примечание: Выполните все шаги, описанные ниже в стерильных ламинарного потока биобезопасности кабинета для тканевой культуры в лаборатории BSL-2.

1. Оттепель образцы сыворотки при комнатной температуре и передачи 100 мкл каждого образца сыворотки в стерильную пробирку. Тепла инактивирует 30 мин на 56° C в водяной бане или регулируемой температуры thermomixer. Сделайте десятикратного серийных разведений образца сыворотки: от 1:1 до 1:1,000, с использованием холодного RPMI-10 (RPMI с плода бычьим сывороточным 10%).
2. Передача 10 мкл серийно разреженных сыворотки образца в каждой скважине стерильные 96-луночных V-днище. Включать два набора контроля скважин, RPMI-10 с РВП и без образца сыворотки и RPMI-10 только без РВП и образцов сыворотки. Настройка каждого образца сыворотки и RPMI-10 элементов в triplicates.
3. Удаление денге-1, 2, 3 и 4 РВП от-80 ° C морозильника и оттепели их в ванну воды 37 ° C. Переноса размороженных РВП сразу на льду. Получения РВП примерно 170 мкл для каждого образца сыворотки (10 мкл РВП x 3 скважин для каждого разведения сыворотки (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) и 10 мкл РВП x 3 скважин для каждого из RPMI-10 с RVP только контроля скважин).
4. Пипетка 10 мкл РВП в каждый хорошо 96-луночных V-нижней плиты, содержащий образец сыворотки и RPMI-10 с РВП (сыворотка крови) контроля скважин. Не добавляйте РВП RPMI-10 только (не сыворотки образца и не RVP) скважин. Смесь тщательно, закупорить вверх и вниз 5 – 10 раз. Добавить 10 мкл холодной RPMI-10 вместо РВП для каждой холодной RPMI-10 только (не сыворотки образца и не RVP) контроля скважин.
5. Передать инкубатор 96-луночных V-днище и инкубировать пластину за 1 часа при 37 ° C в присутствии 5% CO₂. В то время как 96-луночных V-днище инкубации, очистить поверхность шкафа с 70% этанол биобезопасности и запустите УФ света за 15 мин.
6. Удалить полностью вырожденная T75 колбу K562 клеток из инкубатора, сочетание клетки, также с помощью пипетки стерильный 5 мл и передать стерильные 15 мл Конические трубки 5 мл клеток.
   Примечание: Клетках K562 поддерживаются в RPMI-10 и subcultured в 1 x 10-6/мл.
7. Подсчитать количество ячеек путем удаления 10 мкл клетки из стерильных 15 мл Конические трубки и смешать с 10 мкл tryphan синий. Подсчет количества ячеек, используя Горяева, чтобы определить общее количество клеток в 15 мл Конические трубки.
8. Центрифуга 15 мл конические с клетки на ~ 1200 x g 10 минут, сцеживаться супернатант и Ресуспензируйте клетки в теплых RPMI-10 в концентрации 80 000 клеток/30 мкл СМИ (2,66 х 10⁶ клеток/мл).
9. Удаление 96-луночных V-Нижняя пластина из инкубатора (шаг 1.6), передачи 30 мкл K562 клеток в каждой скважине 96-луночных V-нижней плиты и тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз 5 – 10 раз. Передать инкубатор 96-луночных V-днище и инкубировать пластину за 1 ч при 37 ° C в присутствии 5% CO₂.
10. После инкубации в течение 1 ч, удалите 96-луночных V-Нижняя пластина из инкубатора и центрифуги на ~ 1200 x g за 5 минут. После центрифугирования сцеживаться СМИ из скважин, превратив пластину вниз головой в контейнер, содержащие отбеливатель 10%.
11. Мыть ячейки в каждой скважине, resuspending их в 125 мкл теплых RPMI-10, тщательно перемешать с пипетки и центрифуги пластину на ~ 1200 x g для 5 минут Decant СМИ, превратив пластину вниз головой в контейнер, содержащие отбеливатель 10%. Повторите этот шаг мыть два раза.
12. После мытья, 100 мкл теплой RPMI-10 для каждого, смешать вверх и вниз с пипетки и инкубировать пластину для 48 ч при 37 ° C в присутствии 5% CO₂.

2. день 3

1. Удалить 96-луночных V-нижней плиты, содержащей 100 мкл клеток и СМИ/из инкубатора и переместить его к биобезопасности кабинета. С помощью многоканальных дозаторов, смесь содержимое каждого Ну и передачи клетки и СМИ к 96 хорошо U-нижней пластины или предварительно пометил 5 мл полипропиленовые трубы.
2. Промойте каждую лунку в 96-луночных V-днище с 100 мкл 1% параформальдегида (PFA) в 1 x фосфат буфер солевой (PBS) и передачи соответствующих скважин в 96 хорошо U-днище или помечены 5 мл полипропиленовые трубы из шага 2.1 выход в финал концентрация 0,5% PFA/ну или трубки. Смесь тщательно с использованием многоканальные пипетки, крышка с алюминиевой фольгой и пусть сидят в инкубаторе для 30 минут, чтобы исправить клетки.
3. Подготовьте проточный цитометр (см. Таблицу материалов например), запустив неокрашенных K562 клетки для калибровки стороны и вперед разброс вместе с параметрами флуоресценции. Только флуоресценции канала требуется как значения параметров FL1, GFP является единственным флуоресценции, излучаемый из клеток. Приобрести ~ 30 000 – 50 000 клеток от каждого образца.
   Примечание: Любые проточный цитометр способны читать один флюоресценции может использоваться для получения данных, как клетки, инфицированные РВП только выдают зеленой флуоресценцией благодаря наличию GFP, а другой канал флуоресценции не требуются.

3. анализ данных

1. Анализ данных, полученных на проточный цитометр, с помощью любого программного обеспечения cytometry анализ потока (см. таблицу материалы).
   1. Первые ворота основе FSC-A (вперед разброс – район) против FSC-H (вперед разброс – высота) включают отдельные ячейки и исключить из анализа¹²авто люминесцентные Дуплеты. Затем, ворота синглетно жилой ячейки, основанные на SSC-A (стороне разброс – район) против FSC-A, чтобы исключить любой autofluorescent мусора.
   2. Анализировать SSC-A против закрытых ячеек FSC-A для экспрессии гена GFP основе SSC-A против GFP-A. Определите процент GFP + клеток для каждого разведения образцов сыворотки и управления, установив ворот вокруг GFP + клеток.
2. Определите средний процент GFP + клеток для каждого разбавления образца сыворотки и контроля скважин, разделив общий процент GFP + клеток в трех экземплярах лунки на 3.
3. Вычислить фолд повышение инфекции путем деления средний процент GFP + клеток в образцах сыворотки для каждого разведения, деленное на средний процент GFP + клеток в RPMI-10 с РВП (не образца сыворотки) контроля скважин.
4. Граф фолд повышение (ось y) против разрежения (ось x) и выполнять статистический анализ с использованием дисперсионного анализа, следуют Тьюки в пост hoc тест для нескольких сравнений.

Результаты

Sera от 4 резус макак были собраны 16 недель после инфекции с ZIKV и проверяются на их потенциал для повышения DENV-1, 2, 3 и 4 инфекции в клетках K562. Животные имели пик виремии ~ 1 х 10⁵ копий РНК/мл ZIKV плазмы на 3 день после заражения, что снизилась до уровней, которые были ниже п?...

Обсуждение

Flaviviruses как DENV и ZIKV поделиться существенные доказательства гомологию в обоих их структурных и неструктурных белки, которые генерируют антитела, которые cross-react друг с другом^13,14. Было показано, что эти ответы cross-reactive антитела расширения инфекции как в ест...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 cells	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin	MP biomedicals	1670049	100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)	Sigma	M7145	1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate	Cellegro	25-000-Cl	1mM in RPMI-10
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25005CI
Sterile V-bottom plates	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes	VWR	60819-728
Non-sterile U-bottom plates	Falcon	Ref 353910	A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette	Denville	P7127
200uL sterile pipette tips	Denville	P3020 CPS
20uL sterile pipette tips	Denville	P1121
50-200uL multichannel pipette	Denville	P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette	Denville	P3975-9-B
20% formadehyde	Tousimis	#1008B
Water Bath	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator	ThermoFisher	13-998-213
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer	Becton Dikinson
Liquid Bleach	Fisher Scientific	NC9724348