JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

Resumen

Normas éticas y desafíos técnicos para la investigación en patología humana, Inmunología y desarrollo terapéutico han colocado pequeños modelos animales en alta demanda. Con un genético y de comportamiento parecido a los seres humanos, pequeños animales como el ratón son buenos candidatos para los modelos de enfermedades humanas, a través del cual se recapitulan respuestas y humano-como síntomas. Además, el fondo genético del ratón puede modificarse para dar cabida a diversas demandas. El ratónnulo (NSG) NOD/SCID/IL2rγ es una de las cepas más ampliamente utilizado de ratón inmunocomprometidos; permite engraftment de células madre hematopoyéticas humanas o tejidos humanos y el desarrollo subsecuente de un sistema inmune humano funcional. Este es un hito fundamental en la comprensión del pronóstico y la fisiopatología de enfermedades humanos específicos como el VIH/SIDA y ayudar a la búsqueda de una cura. Adjunto, Divulgamos un protocolo detallado para generar un modelo de ratón humanizado de NSG (hu-NSG) por trasplante de células madre hematopoyéticas en un ratón NSG neonatal radiación-condicionada. El modelo de ratón de hu-NSG muestra desarrollo multilineal de trasplantado células madre humanas y susceptibilidad a la infección viral por VIH-1. También recoge características biológicas en respuesta a la terapia combinatoria antirretroviral (carro).

Introducción

Porque el establecimiento de adecuados modelos animales para enfermedades humanas, es clave para encontrar una cura, modelos animales apropiados durante mucho tiempo han sido perseguidos y mejorado con el tiempo. Se han desarrollado múltiples variedades de modelos murinos immunocompromised que permitan el engraftment de células humanas o de los tejidos y la posterior ejecución de funciones humanizado1,2. Estos modelos de ratón humanizado son críticos para la investigación de enfermedades específicas de humanos3,4,5.

Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) resultando de la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es un ejemplo. Antes del establecimiento de modelos de ratón humanizado, limitaciones éticas y técnicas limitan estudios animales preclínicos de VIH/SIDA a primates no humanos3. Sin embargo, los altos gastos y requisitos para la atención especializada para tal animal dificultan estudios de VIH/SIDA en entornos académicos típicos. VIH principalmente infecta células humanas CD4 + T y afecta el desarrollo y la respuesta inmune de otras células humanas como células B, macrófagos y células dendríticas6; por lo tanto, pequeños modelos animales trasplantados con un sistema inmunológico humano funcional están en alta demanda.

Un avance se produjo en 1988, cuando CB17 -scid ratones con una mutación de Prkdcscid se desarrolló y demostró engraftment acertado del sistema inmunológico humano1. Los resultados de la mutación de Prkdcscid en funciones de las células T y B defectuosa y un sistema inmune adaptante seccionado en ratones, permitiendo el engraftment de humanos periféricos de la sangre las células mononucleares (PBMCs), las células madre hematopoyéticas (HSCs), y los tejidos hematopoyéticos fetales7,8. Sin embargo, niveles bajos del engraftment se observan con frecuencia en este modelo; las causas posibles son 1) residual actividad inmunológica innata modulada por natural killer (NK)-células y 2) el desarrollo de la etapa tardía de ratón (filtración) células T y B5. El desarrollo posterior de los diabéticos no obesos (cabeceo)-modelo de ratónscid logra dramático abajo-regulación de la actividad de células NK; así, es capaz de soportar un nivel más elevado y más sostenible engraftment del sistema inmunológico humano componentes9. Más suprimir o impedir el desarrollo de la inmunidad innata, modelos de ratón teniendo el truncamiento o el agujero ciego total de interleukin-2 receptor γ-cadena (Il2rg) en el (NOD) - Fondo descid fueron establecidos. Il2rg, también conocido como receptor del cytokine γ-cadena, es un componente indispensable de varios receptores de cytokine10,11,de12,13. Cepas como GUIÑO. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) y NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentan robusta interrupción de ratón señalización de citoquinas y la ablación completa de desarrollo de la NK-célula, en Además de deterioro severo de la inmunidad adaptativa14,15,16.

Tres modelos de ratón humanizado teniendo un scid mutación y Il2rg nocaut con frecuencia se emplean en la investigación del VIH/SIDA: el modelo BLT (médula ósea/hígado/timo), el modelo de ABP (leucocitos de sangre periférica) y el modelo de la fuente (SCID repoblación celular) 3. BLT el modelo se crea vía quirúrgico trasplante de hígado fetal humano y timo bajo la cápsula del riñón de ratón acompañada con la inyección intravenosa del hígado fetal HSCs3,17,18. El modelo de ratón de BLT ofrece eficacia alta engraftment, desarrollo de las células hematopoyéticas humanas en todos los linajes y el establecimiento de un fuerte sistema inmune humano; Además, las células T son educadas en un timo humano autólogo y exhiben respuestas inmunitarias restricción HLA4,5,17,19. Sin embargo, la necesidad de procedimientos quirúrgicos sigue siendo el mayor inconveniente del modelo BLT. El modelo de ratón PBL se establece por la inyección intravenosa con linfocitos periféricos humanos. El modelo ABP ofrece comodidad y rendimientos engraftment acertado de la célula de T, pero su aplicación es limitada debido a la insuficiente de la célula de B y engraftment de células mieloides, engraftment bajo niveles general y el inicio de la severa injerto - versus - host disease (GVHD)3 ,20. El modelo de ratón de fuente se establece mediante inyección de HSCs humanas en ratones SCID de adultos jóvenes o recién nacidos. Exhibe el engraftment promedio eficiencia por encima del 25% (evaluado como sangre periférica CD45 porcentaje) y apoya el desarrollo de múltiple-linaje de HSCs inyectados y la elaboración de un sistema inmune humano innato. Sin embargo, la limitación del modelo de fuente es que la respuesta de células T es ratón H2-restringido en lugar de humanos HLA restringida14,21.

El modelo de ratón de la fuente se considera un modelo fácil y confiable para el VIH/SIDA pequeño animal estudios preclínicos, ejemplificado por el engraftment consistente de un sistema inmunológico humano y acertado desarrollo hematopoyético. Previamente informó de la creación de un modelo de ratón de NSG Hu-fuente-SCID (hu-NSG) y se describe su aplicación en la replicación del VIH y latencia estudios22,23,24. Este modelo de ratón de hu-NSG exhibe altos niveles de la médula ósea autoguiado hacia el blanco, susceptibilidad a la infección por el VIH y recapitulación de la infección por VIH y la patogénesis. Además, el modelo de ratón de hu-GSN responde adecuadamente a la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y recapitula rebote viral del plasma sobre el retiro del carro, confirmando el establecimiento de un VIH latencia depósito25,26 ,27. Este embalse de latencia del VIH es más justificada por la producción de virus VIH réplica-competente ex vivo inducida por humanos CD4 + células T aisladas de ratones infectados y tratados con carro hu-NSG de descanso.

Adjunto, describimos el protocolo detallado para el establecimiento del modelo de ratón de hu-NSG de ratones neonatales de NSG, incluyendo procedimientos relacionados con el tratamiento del VIH infección y carro para el desarrollo de la latencia. Esperamos que este protocolo para ofrecer un nuevo conjunto de enfoques en los estudios animales sobre Virología VIH, latencia y tratamiento VIH.

Protocolo

Todos los procedimientos y cuidado de los animales se han realizado según protocolos revisado y aprobado por la ciudad de esperanza Animal atención institucional y Comité de uso (IACUC) llevó a cabo por el investigador principal de este estudio (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tejido hepático fetal humano se obtuvo de recursos avanzados de biociencias (Alameda, CA), una organización sin fines de lucro, conforme a las regulaciones federales y estatales. El vendedor tiene su propia Junta de revisión institucional (IRB) y cumple con los requisitos de protección del sujeto humano. PBMCs humanos están aisladas de las muestras de sangre periférica desechados de anónimos donantes sanos de esperanza sangre donantes del centro de ciudad (Duarte, CA), con la no identificación con respecto a edad, raza, género u origen étnico. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. general práctica aséptica

  1. Realizar experimentos de cultivo de tejidos en gabinetes de flujo laminar designado.
  2. Mantener el medio de cultivo de tejidos y complementos bajo condiciones estériles y filtrar utilizando a un previo de 0.22 μm filtración unidad a utilizar.
  3. HSCs humanas preparadas en tubos estériles de preservar y mantener en hielo hasta inyección.
  4. Como resultado de la deficiencia inmune severa, manejar ratones NSG asépticamente. Usar una bata de cirugía desechable, tapa de la pelo, mascarilla, cubiertas del zapato y guantes para evitar la contaminación. Desinfecte la superficie del Banco, titular de la irradiación y cámara de inducción de anestesia con esterilizante de base dióxido de cloro (p. ej., Clidox) antes y después de los experimentos.
  5. Aplique ungüento oftálmico basados en petróleo después de hemorragia retro orbitario para evitar la resequedad en los ojos.
  6. Cambiar a antibiótico que contiene dieta para prevenir la infección debido a hemorragia retro orbital.

2. manejo VIH, infectadas por roedores y las muestras de sangre y tejidos que contienen el Virus

PRECAUCIÓN: El VIH es un patógeno humano de clase 3; las normas de manejo deben seguirse exactamente.

  1. Manejar muestras que contienen el virus de VIH en un BSL2 designado + espacio de laboratorio 3. Cerradura de reactivos que contiene el virus de forma segura en un contenedor secundario durante el transporte. Desinfectar la superficie exterior de los recipientes de fondo limpiando con lejía del 10% y el isopropanol antes del transporte.
  2. Mantenga todos los desperdicios que contienen virus en contenedores designados con 2-3 capas de bolsas de residuos biosanitarios hospitalarios. Antes de la eliminación de residuos, desinfectar rociando generosamente los residuos con solución de nonilfenol etoxilado/yodo (por ejemplo, Wescodyne) y autoclave.
  3. Usar equipo de protección personal: tapa de la pelo, tapa frontal, pantalla facial contra salpicaduras, cubiertas del zapato, bata de cirugía desechable y guantes de doble capa.
  4. Manejar roedores infectados con extrema precaución. Realizar colecciones de sangre y las inyecciones, mientras que los ratones son bajo anestesia (pasos 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 y 8.1-8.2).

3. aislamiento de células madre hematopoyéticas

  1. Preparar solución de colagenasa/dispase para la digestión del tejido.
    1. Disolver el polvo para preparar solución stock a una concentración de 100 mg/mL de colagenasa/dispase y almacene la solución stock de colagenasa/dispase en 150 alícuotas μl a-20 ° C.
    2. Para trabajar la solución de colagenasa, diluir 150 μL del stock de colagenasa/dispase con 15 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% de penicilina/estreptomicina.
      Nota: La concentración final de colagenasa/dispase para la digestión del tejido es 1 mg/mL.
  2. Con una hoja de afeitar estéril, cortar tejido hepático fetal (16-24 semanas de gestación) en trozos pequeños (aproximadamente 2-3 mm3 en tamaño) seguido de digestión con colagenasa/dispase solución 1 mg/mL durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ajustar el volumen de solución de digestión para que todos los pedazos de tejido son totalmente sumergidos. Utilice el extremo posterior del émbolo de la jeringa suavemente moler la muestra de tejido para facilitar la digestión.
  3. Pasar la mezcla de digestión a través de un filtro de malla de nylon estéril de 70 μm para adquirir una suspensión unicelular.
  4. Enriquecer para CD34 + HSCs utilizando un sistema de MACS por instrucciones del fabricante.
  5. Cuenta el porcentaje viable de enriquecido CD34 + HSCs utilizando un hemacitómetro28 y proceder a la inyección intrahepática en ratones neonatales de NSG.
  6. Congelar los restantes enriquecido CD34 + HSCs de congelación los medios de comunicación (p. ej., CryoStor CS2) y preservar las células en un tanque de nitrógeno líquido. Uso futuro, narran el porcentaje viable de descongelado CD34 + HSCs antes de la inyección. Con el uso de los medios de congelación, descongelación posterior viabilidad es entre 80 a 90%.

4. intrahepática inyección de HSCs humano CD34 + en ratones neonatales NSG

Nota: Los ratones NSG Neonatal 2-3 días desde el nacimiento son más adecuados para este procedimiento, ya que son lo suficientemente fuertes como para soportar la irradiación en dosis media letal, mientras que los jóvenes bastante a totalmente han deteriorado sistemas inmunes. Anestesia no es necesaria para la inyección de HSC.

  1. Coloque la camada entera de ratones NSG neonatales (típicamente 5-10 ratones, ambos sexos) en una jaula estéril irradiación en forma de empanada y exponga a una dosis total de 200-250 cGy rayos gamma radiación de una fuente de la radiación de Cesio-137. Asegúrese de que la dosis de radiación está dentro de la gama, como pérdida de peso significativa o incluso la muerte puede observarse cuando se exponen ratones NSG a altas dosis de irradiación. 12
    Nota: La radiación es un peligro para la salud, se debe protección personal contra la radiación.
  2. Después de la irradiación, inyectar cada ratón NSG neonatal con 5 x 105 viable humano CD34 + HSCs utilizando una configuración de la aguja de la jeringuilla (figura 1). Directamente inyectar las células en el hígado.

5. engraftment validación mediante sangrado retro-orbital y análisis de citometría de flujo

  1. En la inyección de 10-12 semanas post-HSC, anestesiar ratones utilizando un aparato de inhalación isoflurano/oxígeno. Ajustar el flujo de oxígeno para mantener el porcentaje de isoflurano en 4-5%. La anestesia tarda 3-5 minutos, dependiendo de cada ratón. Adecuadamente anestesiados ratones muestran un lento y patrón de respiración profunda y ninguna reacción al estímulo del pellizco del dedo del pie.
  2. Recoger 50-100 μl de sangre periférica de cada ratón por muestreo retro-orbitales28. Almacenar las muestras de sangre en K2EDTA o tubos para recogida de sangre heparinizada para evitar la coagulación.
    Nota: Tubos sangre están obligados a tener capa de anticoagulante para poder PBMCs de ratón aislados de sangre para análisis de citometría de flujo. EDTA se sabe para inhibir reacciones enzimáticas tales como PCR y qRT-PCR; así, si se requieren reacciones enzimáticas posteriores, utilice un aparato de colección de sangre heparinizada.
  3. Centrifugar las muestras de sangre a 2.000 x g durante 20 minutos a 4 ° C para que sedimenten los glóbulos.
    1. Transferir el sobrenadante de plasma a nuevos tubos de microcentrífuga después de centrifugación y conservar a-80 ° C si se requiere el análisis del cytokine.
    2. Lisar los glóbulos rojos (gr) en el sedimento de células de la sangre a temperatura ambiente durante 10 minutos con tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla de materiales).
      Nota: Si no tienen muestras de plasma, lisar directamente la sangre con solución de lisis sin centrifugación.
  4. Pelotilla células sanguíneas restantes después de lisis de RBC a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C; aspirar el sobrenadante. Lavar el pellet celular con 0,01% de BSA con DPBS, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Repetir el lavado una vez más.
  5. Bloquear celdas con 100 μl de 1 x bloqueo cóctel (tabla 3 de la receta) durante 20 minutos a 4 ° C.
  6. Después de bloquear, directamente agregar cada solución de anticuerpo en la suspensión celular a una concentración de 2 μl/106 células e incube a 4 ° C durante 30 minutos. Anticuerpos para la validación del engraftment: anti-humanos CD45 (leucocitos, RRID: AB_2732068), humana CD3 (T-cells, RRID: AB_396896), humana CD4 (linfocitos T, RRID: AB_397037), anti humano CD8 (células T citotóxicas, RRID: AB_2722501), anti humano CD14 (monocitos, RRID: AB_10373536) y anti-humanos CD19 (linfocitos B, RRID: AB_10373382). Para el panel de flujo sugerido, ver tabla 4 y Tabla de materiales para números de catálogo, RRIDs y números de lote.
    Nota: Tinción de anticuerpo en solución de bloqueo elimina la fijación no específica de los anticuerpos anti-humanos hacia los marcadores de la superficie del ratón, como varios marcadores de la superficie comparten homología entre humanos y de ratón.
  7. Aislar PBMCs humanos de donantes sanos y preparar solo manchado flujo cytometry controles de compensación mediante PBMCs humano purificado. alternativamente, utilizar microesferas marcados con fluorescencia como compensación controla29.
  8. Analizar las muestras de sangre periférica utilizando un citómetro de flujo y cuantificar el porcentaje de células CD45 + humanas, humanas células CD3 +, células CD14 + humanas y humanas células CD19 + de las células de sangre periféricas total.
    1. Estudios de latencia y posterior infección por el VIH, calcular el porcentaje de CD8 + T-células dentro de las células CD3 + y CD4 + células de T.
      Nota: Por lo general, se observa una relación CD4:CD8 entre 1.5 y 2.5 antes de VIH infección30.

6. Análisis de la infección de ratones hu-NSG y la carga Viral en Plasma mediante qRT-PCR

  1. Propagar material viral VIH BaL en PBMCs humanos de donantes sanos, cosecha en infección posterior al día 10 y valorar uso de p24 ELISA kit31.
  2. Ratones de hu-grupo selecto con más de 20% humano CD45 + células en la sangre periférica para la infección por VIH.
  3. Anestesiar ratones hu-NSG utilizando un aparato de inhalación de oxígeno isoflurano (paso 5.1).
  4. Después de confirmar el animal está anestesiado, inyectar virus VIH BaL a dosis de 200 ng de p24 por ratón por vía intraperitoneal.
    Nota: Ser extremadamente cautelosos con la aguja, no reutilizar las agujas y desechar inmediatamente después del uso en envase agudo designado. Desinfectar la zona de la inyección después de la administración de virus.
  5. Infección después de tres semanas, anestesiar ratones hu-NSG y recolección de sangre periférica mediante retro-orbital sangrado con heparina tubos capilares y tubos de recogida.
  6. Plasma separado y células de la sangre por centrifugación a 2.000 x g durante 20 minutos.
  7. Lisar los glóbulos rojos. Block y manchas restantes células de la sangre con anticuerpos para los análisis de citometría de flujo (sección 5.3-5.8).
    Nota: Análisis de citometría de flujo debe centrarse en comparar la relación de CD4:CD8 antes y después de la infección. Se espera que la disminución significativa en el recuento de células CD4 +, como el CD4 antígeno sirve como un co-receptor para la entrada viral.
  8. Las muestras de plasma de uso analizar el viral del VIH la carga mediante qRT-PCR. Aislar el RNA viral de muestras de plasma usando un kit de mini RNA viral. Realizar qRT-PCR con primers específicos de LTR de HIV-1 y sonda fija (detalles de la secuencia en la tabla 5), usando el protocolo del fabricante.

7. oral Administración de carro y validación de supresión Viral (opcional)

Nota: Este paso es opcional para las investigaciones sobre el pronóstico del VIH, la virología o la fisiopatología relacionada con la infección durante la fase de infección aguda. Carro de tratamiento del VIH hu-NSG se utiliza para recapitular la latencia del VIH entre pacientes humanos recibiendo carro. Ratones con éxito VIH hu-NSG reciben carro durante 4 semanas. El régimen de carro consta de tenofovir disoproxil fumarato (TDF; 300 mg/cápsula), emtricitabina (FTC; 200 mg/cápsula) y raltegravir (RAL; 400 mg/cápsula). La dosis de carro para el tratamiento de ratones infectados por el VIH hu-NSG se ajusta según el cuerpo de superficie (tabla 1, ecuación 1, tabla 2)32.

  1. Calcular la cantidad de cada medicamento necesario para cada jaula durante una semana de tratamiento, teniendo en cuenta el volumen de la botella de agua, el número de ratones en cada jaula y un consumo promedio de agua diaria de 4 mL por ratón.
    Nota: El punto clave en este paso es asegurar que cada ratón adquiere su dosis diaria de 4 mL de agua potable.
  2. Moler todos los tres medicamentos con dosis ajustadas en polvo fino y disolver la mezcla en polvo en agua azucarada (por ejemplo, Medidrop Suralose). Cambiar la botella de agua cada semana con cóctel de carro recién disuelto en agua azucarada.
    Nota: El polvo de la droga no puede disolver inmediatamente, agite vigorosamente para lograr una suspensión homogénea antes de regresar la botella a la jaula de tenencia.
  3. Obtener muestras de sangre periférica mediante retro-orbital sangría cada dos semanas y analizar tanto la relación CD4:CD8 mediante citometría de flujo (sección 5.3-5.8) y la carga viral en plasma mediante qRT-PCR (sección 6.6).
    Nota: Por lo general después de 4 semanas de tratamiento, la carga viral en plasma disminuye a por debajo del límite de detección y se restablece una relación típica CD4:CD8.

8. validación del rebote Viral sobre carro de retiro (opcional)

Nota: Este paso es fundamental para validar el modelo de estado latente, como rebote viral sobre el retiro del carro proporciona evidencia directa de un depósito de latencia. Se recomienda también para servir como un experimento de control para investigaciones terapéuticas sobre VIH rebote supresores.

  1. Plan para la retirada del carro después de cargas virales del plasma de las muestras de sangre periférica por debajo del límite de detección y la relación CD4:CD8 se restaura en un rango entre 1.5 y 2.5.
  2. Recoger muestras de sangre periférica mediante retro-orbital sangrado cada 2 semanas después de la retirada del carro. Vigilar de cerca el cambio en las cargas virales del plasma (sección 6.6) así como la relación de CD4:CD8 (sección 5.3-5.8).

Resultados

Análisis de citometría de flujo se realiza con frecuencia para validar la pureza de HSCs aisladas, evaluar niveles de engraftment, perfil respuestas inmunes a la infección viral y encuesta sobre eficacia del carro. Un panel de anticuerpos típica contiene anticuerpos fluorescente etiquetados cada 4-6; así, un citómetro de flujo con láser múltiples y una amplia selección de filtros es fundamental para lograr resultados precisos.

Discusión

Immunocompromised ratones engrafted con células y tejidos humanos presentan características fisiológicas humanas y son un enorme valor para los estudios de patología, Fisiopatología e Inmunología sobre enfermedades específicas de humanos. Entre las múltiples cepas de ratones immunocompromised, el visto bueno. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) el modelo es el más inmunodeficientes debido a su falta de inmunidad innata y adaptativa, así como del cytokine de ratón específicos seccion...

Divulgaciones

Los autores no divulgar conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [otorgar números R01AI29329, R01AI42552 y R01HL07470 a J.J.R.] y el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud [número de licencia P30CA033572 para la ciudad de esperanza genómica Integrativa Farmacología analítica y núcleos de citometría analítica]. El siguiente reactivo se obtuvo a través de los NIH NIH SIDA programa de investigación y referencia reactivo, División de SIDA del NIAID,: virus VIH BaL.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory005557Order breeders instead of experimental mice
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectantFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needleHamilton80508Custom made
Blood collection tube (K2EDTA)BD Bioscience367843
Blood collection tube (Heparin)BD Bioscience365965
Capillary tube (Heparinized)Fisher Sicentific22-362574
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Aldrich11814389001
QIAamp Viral RNA mini kitQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG from human serumSigma AldrichI4506-100MG
IgG from mouse serumSigma AldrichI5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)BD Biosciences558116RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

Referencias

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Inmunolog a e infecci nn mero 143rat n Neonatal NSGhumanizado ratonesHSCsVIHcarrolatencia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados