JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של F1-ATPase משלב חרקים בתרבית של Trypanosoma brucei. ההליך מניב מורכב מאוד טהור, הומוגנית, פעיל מתאימים ללימודי אנזימטי מבניים.

Abstract

F1-ATPase הוא subcomplex קטליטי ממברנה-חיצוני של F-type ATP סינתאז, אנזים העושה את הכוח המניע של פרוטון מעבר ממברנות ביולוגיות לייצר אדנוזין טריפוספט (ATP). בידודו של ה-F שלם1-ATPase ממקור מקורי שלו הוא תנאי חיוני לאפיון של האנזים חלבון קומפוזיציה קינטית פרמטרים, רגישות מעכבי. מאוד טהור, הומוגניות F1-ATPase יכול לשמש ללימודים מבניים, אשר מספקים תובנה המנגנונים המולקולריים של סינתזת ATP, הידרוליזה. מאמר זה מתאר הליך של הטיהור של F1-ATPase מן Trypanosoma brucei, סוכן סיבתי של אפריקה trypanosomiases. ה F1-ATPase מנותקת שלפוחית מיטוכונדריאלי, אשר מתקבלים על ידי פירוק היפוטוניק של trypanosomes במבחנה תרבותי. השלפוחיות המוגלתיות הן מכנית מפוצל על ידי sonication ו ה נ1-ATPase הוא שוחרר מן קרום מיטוכונדריאלי הפנימי על ידי החילוץ כלורופורם. המתחם אנזימטי מטוהר עוד יותר על ידי exchange אניון רצופים ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. ספקטרומטר מסה רגיש טכניקות הראה כי המתחם מטוהרים נטול מזהמים כמעט כל חלבון, לכן, מייצג חומר מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ. ה-F מבודד1-ATPase תערוכות פעילות hydrolytic ATP, אשר יכול להיות מעוכבים באופן מלא על ידי אזיד הנתרן, מעכב חזק של F-type ATP synthases. המתחם מטוהרים נשאר יציב ופעיל לפחות שלושה ימים בטמפרטורת החדר. משקעים על ידי אמוניום סולפט משמש לאחסון לטווח ארוך. נהלים דומים שימשו לטיהור של F1- ATPases רקמות מידע יונקים, שמרים או חיידקים. כך, הפרוטוקול שהוצגו יכול לשמש קו מנחה עבור ה F1-ATPase בידוד של אורגניזמים אחרים.

Introduction

Synthases F-type ATP הם מאוגד-ממברנה סיבוב קומפלקסים multiprotein רוברטסונית פרוטון זה זוג מעבר אנרגיה-transducing ממברנות של חיידקים, המיטוכונדריה מהכלורופלסט עם היווצרות של ATP. הפרטים מולקולרית של מנגנון סיבובי של סינתזת ATP ידועים בעיקר בשל לימודי המבנית של מטוהרים בקטריאליים ו מיטוכונדריאלי synthases ATP ושלהם subcomplexes1. F-type ATP סינתאז שמאורגנים moieties ממברנה-פנימי, חיצוני-ממברנה. החלק ממברנה-חיצוני, המכונה F1-ATPase, מכיל שלושה אתרים קטליטי, שבו מתרחשת זירחון של אדנוזין diphosphate (ADP) ATP או התגובה הפוכה. F1-ATPase יכול להשתחרר השפעול של moiety קרום-מהותי תוך שמירה על היכולת שלה hydrolyze, אבל לא לסנתז, ATP. המגזר מאוגד-ממברנה, שנקרא Fo, ומתווך רוברטסונית חלבון, אשר מניע את הסיבוב של החלק המרכזי של האנזים. F1 ו- Fo . סקטורים מחוברים באמצעות מרכזי והיקפי הגבעול.

הראשון מנסה לטהר את F1-ATPase ניצני שמרים, הלב שור המיטוכונדריה תאריך חזרה לשנות ה-60. פרוטוקולים אלה נעשה שימוש שחולצו המיטוכונדריה, אשר היו מובסים sonication, fractionated על ידי משקעים סולפט אמוניום או מה לעזאזל קרה, ואחריו כרומטוגרפיה אופציונלי step(s) וטיפול בחום2,3,4 5, ,6. הטיהור היה מאוד השתפר, פשוטה על ידי השימוש בכלורופורם, אשר משחרר בקלות את F1-ATPase מן קרום מיטוכונדריאלי שברים7. החילוץ כלורופורם שימש אז כדי לחלץ נ1- ATPases וממקורות שונים בעלי חיים, צמחים, חיידקי (למשל, עכברוש כבד8, תירס9, אראם maculatum10ו Escherichia coli 11). עוד טיהור של F שפורסמו כלורופורם1-ATPase מאת זיקה או גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) הניב חלבון טהור מאוד מורכבת, אשר היה מתאים מכשור לקביעת קשיות ומבנה ברזולוציה גבוהה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, כמו שתיעד את המבנים של F1-ATPase מן הלב שור12,13 ו האפייה14. F1-ATPase מבנים נקבעו גם של אורגניזמים שקשה לטפח, לפיכך, כמות החומר הביולוגי הראשוני היה מוגבל. במקרה זה, ה-F1-ATPase subunits היו באופן מלאכותי הביע ומצורפים המתחם ב e. coliוטיהרו האנזים heterologous כל היה מאת זיקה כרומטוגרפיה דרך של יחידת משנה מתויגות. גישה כזו הובילו הקביעה של F1-ATPase מבני שני המינים חיידקי לרום, Geobacillus stearothermophilus15 , Caldalkalibacillus thermarum16, 17. עם זאת, מתודולוגיה זו הוא מעדיף מצוייה F האיקריוטים1- ATPases מאז זה מסתמך על מכשיר prokaryotic protheosynthetic, עיבוד posttranslational, מכלול מורכבים.

החילוץ מבוססי כלורופורם השתמשת קודם לכן כדי לבודד F1- ATPases Trypanosoma cruziפרזיטים חד־תאיות digenetic18 ו brucei ט19, חשוב פתוגנים בתרבית של גורם אמריקאי ו Trypanosomiases אפריקאי, בהתאמה, ומתוך monogenic חרק טפיל Crithidia fasciculata20. Purifications אלה הובילו רק תיאור פשוט של ה F-1- ATPases, מכיוון שאין יישומים במורד הזרם שימשו לאפיין באופן מלא את הרכב, מבנה ומאפייני אנזימטי של המתחם. מאמר זה מתאר שיטה ממוטב עבור F1-ATPase טיהור מהבמה מחזור חיי חרק בתרבית של brucei טי. השיטה מפותח בהתבסס על הפרוטוקולים הוקמה עבור בידוד של שור ושמרים F1- ATPases21,22. ההליך התשואות מאוד טהור, הומוגניות אנזים מתאים במבחנה אנזימטי או מעכבות מבחני, אפיון מפורט פרוטיאומיה מבנית באמצעות ספקטרומטר מסה23, קביעת מבנה24. פרוטוקול טיהור ואת הידע של F1-ATPase מבנה בשלב האטומי פותח אפשרות לעצב מסכים כדי לזהות מעכבי מולקולה קטנה, וסיוע בפיתוח של תרופות חדשות נגד trypanosomiases אפריקה. יתר על כן, הפרוטוקול ניתן להתאים לטהר F1-ATPase של אורגניזמים אחרים.

Protocol

1. מאגרי ופתרונות

  1. הכינו את הפתרונות המפורטים להלן. דגה כל מאגרים עבור כרומטוגרפיה נוזלית. מוסיפים מעכבי ADP benzamidine, פרוטאז רק לפני השימוש.
    1. להכין מאגר ת: 50 מ מ טריס מאגר עם חומצת מלח (HCl-טריס) pH 8.0, 0.25 M סוכרוז, benzamidine 5 מ"מ, 5 מ"מ אמינו קפרון מעכבי חומצה (ACA) ולאחר פרוטאז (10 מיקרומטר amastatin 50 מיקרומטר bestatin, pepstatin 50 מיקרומטר, 50 מיקרומטר leupeptin, diprotin 50 מיקרומטר A).
    2. להכין מאגר ב': 50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 0.25 M סוכרוז, 4 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), benzamidine 5 מ"מ, 5 מ"מ ACA, 1 מ מ. ADP, מעכבי פרוטאז (10 מיקרומטר amastatin 50 מיקרומטר bestatin, pepstatin 50 מיקרומטר, 50 מיקרומטר leupeptin, diprotin 50 מיקרומטר A).
    3. הכנת מאגר Q-עמודה: 20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 4 מ מ EDTA, 10 מ מ MgSO4, benzamidine 5 מ"מ, 5 מ"מ ACA ו- 1 מ מ ADP.
    4. הכנת מאגר • תנאי Q-עמודה: עמודות Q מאגר עם 1 M NaCl.
    5. הכנת מאגר שניה: 20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 10 מ מ MgSO4, 100 מ מ NaCl, 1 מ"מ ADP.
    6. להכין את הכלורופורם רווי טריס-HCl M 2 pH 8.5. לערבב כלורופורם עם 2 מ' טריס-HCl pH 8.5 בכ-1:1 יחס בבקבוק בורג-קאפ, לנער, אתן את השלבים ולא מימית אורגניים נפרדים, למדוד pH של השכבה העליונה מימית עם רצועת נייר pH-אינדיקטור. לאחסן בטמפרטורת החדר. לפני השימוש, לנער שוב ולתת את שלבי נפרדים. השתמש השכבה התחתונה כלורופורם.
      התראה: כלורופורם הוא תנודתי, מעצבן את העיניים והעור. לעבוד בשכונה fume. השתמש בטיחות משקפיים כאשר רועד.

2. הכנה של חלקיקים תת-מיטוכונדריאלי

  1. Resuspend שלפוחית מיטוכונדריאלי (mitoplasts) מבודדת על ידי פירוק היפוטוניק25 מ עונה 1 פרק 1011 עונה 2 פרק 1011 תאים של procyclic ט brucei ב 5 מ של המאגר הקר א לשמור הדגימה מקורר עד שלב 3.2.
  2. לקבוע ריכוז חלבון ההשעיה על ידי bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay26 בהתאם להוראות היצרן.
    1. השתמש סדרה דילול אלבומין שור (BSA) במים הנדסה גנטית כדי לבנות את עקומת סטנדרטי. לדלל את כמות קטנה של מדגם 20 - 100 פעמים עם מים הנדסה גנטית כדי להתאים הסטנדרטים טווח של BSA.
    2. לחשב את הסכום הכולל חלבון במדגם ולהביא את ריכוז חלבון 16 מ"ג/מ"ל מאת לדלל אותה עם המאגר הנוסף א
  3. קטע mitoplasts לתוך שלפוחית הפוכה וחתיכות הממברנה על ידי sonication של ההשעיה 7 x עבור 15 s עם האנרגיה הכוללת של 70 עד 100 J לכל דחף עם microtip עם קוטר של 3.9 מ מ. אם מהמגן אולטראסאונד אינו מציג תפוקת האנרגיה, להתחיל אופטימיזציה ב-50% של כוח מקסימלי. דגירה המדגם על הקרח ב-30 s בין דחפים. לאחר sonication, המתלה הופך מעט כהה יותר.
  4. משקעים הקרום קטעים מאת ultracentrifugation g x 54,000 עבור 16 h או 98,000 g x עבור 5 שעות-4 מעלות צלזיוס. Decant את תגובת שיקוע, להמשיך עם מיצוי כלורופורם, או הקפאה המשקע של חנקן נוזלי ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.

3. שחרור של F1-ATPase מן הממברנה על ידי כלורופורם

  1. Resuspend בגדר של ממברנות מיטוכונדריאלי במאגר B בעזרת מהמגן קטן דאונס. חישוב הנפח של מאגר B בהתבסס על הסכום הכולל של מאגר שימוש בנוסחה שלבים 2.1 ו- 2.2 באמצעות הפעולות הבאות: נפח (מאגר B) = נפח (מאגר A) x 12/21. להעביר את המתלים צינור חרוטי 15 - מ או 50-.
  2. להסיר את דגימת קרח ולשמור, מעכשיו, לדוגמה, כל הפתרונות כדי לשמש בטמפרטורת החדר.
  3. להוסיף כלורופורם רווי טריס-HCl M 2 pH 8.5; הנפח של כלורופורם שיתווספו שווה לחצי מנפח של ההשעיה. סגור/י היטב את הכובע. לנער אותו נמרצות בדיוק 20 ס Centrifuge זה מיד על סך של 8,400 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. העברה השלב העליון מימית מעונן 1.6-mL microtubes. מוסיפים מעכבי פרוטאז (10 מיקרומטר amastatin 50 מיקרומטר bestatin, 50 מיקרומטר pepstatin, leupeptin 50 מיקרומטר, מיקרומטר 50 diprotin A) כדי להחליף את מעכבי הוסר על ידי טיפול כלורופורם. Centrifuge את הדגימות ב x 13,000 g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את תגובת שיקוע microtubes טריים וחזור על צנטריפוגה כדי להסיר את כל חומר לא מסיסים.

4. החלפת אניון כרומטוגרפיה

  1. Equilibrate העמודה exchange (Q) 5-mL אניון המחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר עם המאגר Q-עמודה בספיקה של 5 mL/min עד ספיגת ב 280 nm ו את המוליכות לייצב (כ 50 מ"ל של המאגר).
  2. לטעון את תגובת שיקוע מהשלב 3.3 על העמודה equilibrated בספיקה של 1 מ"ל לדקה. חכה עד ספיגת ב 280 ננומטר מייצבת ברקע. להחיל מעבר צבע ליניארי של 25-mL המאגר • תנאי Q-עמודה בין 0% ל-100% בקצב הזרימה של שברים 1-mL לאסוף 0.5 מ ל לדקה.
  3. Assay שברים בודדים המתאימים לשיא • תנאי מרכזי לפעילות hydrolytic ATP על ידי assay פולמן ATPase2 ב- pH 8.0. השתמש µL 10 של כל שבר לכל 1 מ"ל של תערובת התגובה. בריכת שברים כי התערוכה פעילות ATPase. באופן אופציונלי, להפריד בין 10 µL של כל שבר על סודיום dodecyl פוספט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), מכתים את הג'ל על-ידי Coomassie כחול להמחיש F בודדים1-ATPase subunits וחלבונים משחיתה.
  4. תתרכז המדגם במאגר אולטראפילטרציה ממברנה באמצעות עמודה ספין עם מסנן MWCO PES 100,000 ל- 200-500 µL. להמשיך שניה או חנות המדגם ללילה בטמפרטורת החדר.

5. גודל-הדרה כרומטוגרפיה

  1. Equilibrate בעמודה שניה המחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית לפחות 48 מ"ל (שני כרכים עמודה) המאגר שניה בספיקה של 0.5 mL/min.
  2. להחיל את הדגימה על העמודה ולהפעיל כרומטוגרפיה בספיקה של 0.25 mL לדקה לאסוף 0.25-mL שברים.
  3. הפעל את µL 10 של שברים מקבילים הפסגות של UV280nm ספיגת המעקב בדף-מרחביות, תכתים אותם על-ידי Coomassie כחול. השיא העיקרי הראשון מכיל את F1-ATPase. Assay השברים המתאימים זה שיא עבור ATP hydrolytic פעילות של אזיד הרגישות מאת וזמינותו פולמן ATPase. לקבוע ריכוז החלבון על ידי BCA וזמינותו.
  4. לשמור על ה-F מטוהרים1-ATPase בטמפרטורת החדר להשתמש בו בתוך בתלת-ממד לאחר טיהור ליישומים במורד הזרם. לחלופין, לרכז את הדגימה באמצעות עמודה ספין עם מסנן MWCO PES 100,000 > 1.5 מ"ג / מ"ל, precipitate אותו על ידי ערבוב זה עם רוויה אמוניום סולפט להתאים ל- pH 8.0 (1.2 x האחסון), ואחסן אותו ב 4 º C.

תוצאות

הוא לטיהור טיפוסי (איור 1) מתחיל עם שלפוחית מיטוכונדריאלי (mitoplasts) מבודד על המילוי ההדרגתי Percoll מ hypotonically lysed עונה 1 פרק 1011 כדי עונה 2 פרק 1011 procyclic ט brucei תאים25 תרבותי בתקן גלוקוז-עשיר SDM-79 בינוני27. Mitoplasts יש מפוצלים מאת son...

Discussion

הפרוטוקול עבור F1-ATPase טיהור מ ט brucei פותחה על בסיס שיטות שפורסמו קודם לכן עבור בידודו של F1-ATPase קומפלקסים של מינים אחרים,13,14. השיטה אינה דורשת כל שינוי גנטי (למשל, תיוג) ותשואות מתחם פעיל מלא עם כל subunits הנוכחי. צעד קריטי הוא שחרור הקלו כלורופ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי משרד החינוך ERC CZ הענק LL1205, המענק גרנט סוכנות של צ'כיה 18-17529S, ולא על ידי ERDF/ESF פרויקט מרכז לחקר פתוגניות, התקפה אלימה של טפילים (מס ' CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)ApplichemA0948
Amastatin HydrochlorideGlantham Life SciencesGA1330
Aminocaproic AcidApplichemA2266
BCA Protein Assay KitThermoFischer Scientific/Pierce23225
Benzamidine HydrochlorideCalbiochem199001
Bestatin HydrochlorideSigma Aldrich/MerckB8385
ChloroformAny supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-freeRoche4693159001Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)Any supplier
Hydrochloric AcidAny supplierFor pH adjustment
Ile-Pro-IleSigma Aldrich/MerckI9759Alias Diprotin A
LeupeptinSigma Aldrich/MerckL2884
Magnesium Sulfate HeptahydrateAny supplier
Pepstatin ASigma Aldrich/MerckP5318
Protein Electrophoresis SystemAny supplier
Sodium ChlorideAny supplier
SucroseAny supplier
TrisAny supplier
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, PolyallomerBeckman Coulture328874
DounceTissues Homogenizer 2 mLAny supplier
Glass Vacuum Filtration DeviceSartorius516-7017Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mLGE Healthcare Life Sciences17115401Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mmSartorius18406--47------NDegasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences29091596Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PESSartoriusVS0641
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AKTA Pure 25GE Healthcare Life Sciences29018224Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601ShimadzuOr similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti RotorBeckman CoultureOr similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000BioLogics0-127-0001Or similar ultrasonic homogenizer

References

  1. Walker, J. E., Wikström, M. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143F1 ATPaseTrypanosoma bruceiATPF type ATPase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved