Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'integrità di barriera ematotesticolare iniettando inulina-FITC in testicoli. Si tratta di un metodo efficiente in vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare che può essere compromessa da elementi genetici e ambientali.

Abstract

Spermatogenesi sono lo sviluppo di spermatogoni in spermatozoi maturi nei tubuli seminiferi del testicolo. Questo processo è supportato da giunzioni delle cellule di Sertoli alla barriera ematotesticolare (BTB), che è la barriera più stretta di tessuto nel corpo dei mammiferi e segrega l'epitelio seminifero in due scomparti, una basale e un adluminal. La BTB crea un microambiente unico per le cellule germinali nella meiosi I / II e per lo sviluppo della postmeiotiche spermatidi in spermatozoi tramite spermiogenesi. Qui, descriviamo un test affidabile per monitorare l'integrità BTB del testicolo topo in vivo. Un intatto BTB blocca la diffusione di inulina FITC coniugato dal basale al compartimento apicale dei tubuli seminiferi. Questa tecnica è adatta per lo studio dei candidati gene, virus o tossici ambientali che possono influire sulla funzione BTB o integrità, con una procedura facile e un requisito minimo di abilità chirurgiche rispetto ai metodi alternativi.

Introduzione

Spermatogenesi mammifera sono considerato un processo altamente strutturato che comprende degli spermatogoni auto-rinnovamento e differenziazione attraverso spermatociti in spermatozoi aploidi tramite mitosi e meiosi spermiogenesi, durante il quale drammatica si verificano cambiamenti biochimici e morfologici. Cellule germinali in via di sviluppo sono progressivamente trasportate dalla base del tubulo seminifero verso il lume. Questo processo è regolato da contatti cellula-cellula fra le cellule germinali e le cellule Sertoli^1,2. Cellule di Sertoli adiacenti formano il BTB che si trova vicino alla base del tubulo seminifero. La BTB divide fisicamente l'epitelio in un basale e un vano di adluminal. Durante fasi VIII - IX del ciclo epiteliale, preleptotene/leptotene spermatociti dai comparti basali migrano attraverso il BTB, entrando il adluminal scomparti³. Di conseguenza, la funzione del BTB è di fornire un microambiente di nuova per il completamento della meiosi e spermiogenesi^4,5,6. A differenza di altre barriere di sangue-tessuti (ad es., barriera emato - encefalica) che sono composti solo da giunzioni strette (TJs), il BTB è formata da quattro diverse giunzioni (TJs, specializzazioni ectoplasmatica, giunzioni di gap e basati su filamento intermedio desmosomi) tra Sertoli cells^1,7.

Molti studi hanno utilizzato topi geneticamente modificati, infezioni da virus e tossici ambientali per studiare i meccanismi di BTB integrità^7,8,9. La rottura di BTB induce la spermatogenesi alterata e infertilità o sterilità. Poiché la formazione di BTB e l'integrità sono stati confermati per essere influenzata dai contatti tra le cellule di Sertoli⁸, un modello in vitro basato su colture primarie di cellule di Sertoli isolate è stato usato per lo studio BTB. Tuttavia, questo modello non può simulare accuratamente BTB dynamics in vivo. Inoltre, nessun tale co-coltura delle cellule di germe con le cellule di Sertoli è stato stabilito come capace di riflettere tutti i relativi componenti strutturali e funzionali dei BTB^10,11.

In generale, in vivo BTB integrità saggi sono in genere basati su piccole molecole, come EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e coniugato FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la diffusione della biotina o inulina-FITC dal vano basale è bloccata dalla struttura BTB. Pertanto, siamo in grado di utilizzare questo metodo per valutare l'entità del danno BTB rispetto ai gruppi di controllo. Mentre BTB può essere compromessa con determinati tipi di stimoli, quali il trattamento con cadmio cloruro (CdCl₂)¹², BTB diventa accessibile a piccole molecole, che alla fine entrare nel compartimento di adluminal come indicatori.

Un'analisi iniziale di in vivo BTB integrità consiste nell'iniettare biotina o inulina-FITC nella vena giugulare, che comporta un intervento chirurgico ed è invasivo, complicato e richiede molto tempo. Inoltre, le sostanze di reporter diffondono attraverso tutto il corpo attraverso la circolazione, la concentrazione locale di biotina o inulina-FITC nei tubuli seminiferi è limitata. Inoltre, l'esposizione sistemica può indurre reazioni immuni. Qui, presentiamo un semplice ed efficace in vivo BTB integrità dosaggio consentendo ad iniezione diretta di una piccola aliquota di inulina-FITC nell'interstizio di un testicolo. Utilizzando il metodo di etichettatura fluorescente, il processo di colorazione è conveniente, come gli anticorpi secondari non sono necessari. Qui, il processo di tintura fluorescente entrando il testicolo è visualizzato.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal Comitato Università medica di Nanchino. Topi maschii C57BL/6 sono stati tenuti sotto condizioni controllate fotoperiodo e sono stati forniti con cibo e acqua.

1. preparati

1. Capillari di microiniezione
   1. Utilizzare i capillari microiniezione con un diametro esterno e interno dimeter lunghezza di 1.0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, rispettivamente.
   2. Tirare tubi capillari in vetro con un estrattore capillare (Figura 1A). Testare e regolare le impostazioni a seconda della macchina estrattore capillare che viene utilizzato.
   3. Rompere le punte di pipetta con pinze per utilizzare per ottenere i capillari di diametro 50-µm sulla punta.
      Nota: I suggerimenti potrebbero essere troppo lunghi per penetrare il testicolo.
   4. Affilare la punta in un angolo di 30° utilizzando un frese per micropipetta (Figura 1).
2. Reagenti
   1. Preparare 1% di sodio pentobarbital: sciogliere 100 mg in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) (punto 2.3.3) di sodio pentobarbital.
   2. Preparare 10 mg/mL inulina-FITC: sciogliere inulina-FITC 1 mg in 100 μL di PBS (passo 2.1.6).
   3. Preparare la paraformaldeide al 4%: sciogliere paraformaldeide (PFA) 4 g in 100 mL di PBS (punto 2.3.3).
   4. Preparare il 30% di saccarosio: sciogliere saccarosio 3 g in 10 mL di PBS (passo 2.3.4).
   5. Preparare il cloruro di cadmio 0,1%: sciogliere il cloruro di cadmio 10 mg in 10 mL di PBS (punto 2.1.1).

2. metodi

1. Anestesia e presurgery preparazione
   1. Pesare i topi maschii C57BL/6 di 8-settimana-vecchio e calcolare la dose necessaria di CdCl₂. Trattare un gruppo di topi (n = 3) con CdCl₂ (5 mg/kg di peso corporeo, i.p.) per 3 d prima della chirurgia. Trattare un altro gruppo di topi maschii C57BL/6 di 8-settimana-vecchio (n = 3) con PBS come controllo.
   2. Eseguire un intervento chirurgico in condizioni di asepsi mediante pinze, aghi, forbici e siringa sterile.
   3. Preparare la soluzione di lavoro di anestesia appena. La dose necessaria di anestesia è 70 mg di sodio pentobarbital/kg di peso corporeo. In media, un topo adulto C57BL/6 a 8 settimane di età pesa ~ 25 g, che corrisponde a 175 μL di 1% sodio pentobarbital (1,75 mg per topo).
      Nota: Il sodio pentobarbital è disciolto in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). La soluzione è filtrata da 0.22 um unità filtrante prima di essere utilizzati.
   4. Pulire la zona per la chirurgia con 75% di etanolo e coprire l'area con un telo di tessuto pulito.
   5. Accendere il riscaldatore termostatico e regolare la temperatura a 37 ° C.
   6. Preparare soluzione di lavoro di inulina-FITC (10 mg/mL) il giorno dell'intervento chirurgico.
2. Procedura chirurgica
   1. Pesare i topi maschii C57BL/6 di 8-settimana-vecchio e calcolare la dose necessaria di anestesia.
   2. Eseguire un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital utilizzando la siringa sterile 1 mL. Tenere il mouse in una gabbia pulita.
   3. Osservare la risposta riflessa occhio e modello di respirazione del mouse per confermare che è sotto anestesia completa.
      Nota: Di solito 10-15 minuti sono necessari fino a quando il mouse è profondamente anestetizzato, con una totale mancanza di risposta di pizzico di punta e la manutenzione di respirazione lenta e progressiva.
   4. Spostare il mouse nell'area di operazione e coprire la zona degli occhi con una velina umida per evitare secchezza durante l'anestesia (Figura 2A).
   5. Radere il pelo addominale con un rasoio e disinfettare la zona di chirurgia con etanolo al 75%.
   6. Con forbici affilate, fare un'incisione della pelle 1 cm sopra le ghiandole prepuziali per esporre la parete addominale. Sollevare la parete addominale con una piccola pinza e praticare un'incisione di 0,5 cm per esporre la cavità peritoneale (Figura 2B).
   7. Usare pinze per cercare di cuscinetti adiposi intorno il testicolo e l'epididimo. Estrarre delicatamente i cuscinetti adiposi per esporre chiaramente il testicolo allegato (Figura 2 e 2D). Di solito, di operare su un testicolo in un momento.
      Nota: Evitare di toccare i cuscinetti adiposi e testicolo con le mani.
   8. Posizionare una carta (9 cm di diametro) sotto i cuscinetti adiposi e testicolo (Figura 2).
   9. Iniettare una pipetta microiniezione di inulina-FITC e collegarlo all'unità micromanipolatore (Figura 1). Delicatamente inserire la pipetta di microiniezione sotto la tunica albuginea e caricare un totale di 20 μL di inulina-FITC nell'interstizio del testicolo (Figura 2E e 2F).
      Nota: Premere con cura la pipetta di microiniezione per evitare lo spostamento.
   10. Monitorare il movimento di inulina-FITC nel testicolo (Figura 2).
   11. Subito rimesso il testicolo nella cavità addominale dopo il completamento dell'iniezione.
   12. Ripetere la procedura sul testicolo controlaterale. Questo testicolo viene iniettato con 20 μL di PBS come controllo.
   13. Chiudere la pelle con una sutura chirurgica e sposta il mouse in una piastra di calore di una stufa termostatica (Figura 1B). Somministrare una dose di 1 mg di analgesico (buprenorfina) per 1 kg di peso corporeo tramite iniezione sottocutanea.
3. Raccolta dei testicoli e la preparazione di sezioni congelate
   1. 40 min dopo l'iniezione, eutanasia il destinatario mouse di dislocazione cervicale secondo la cura degli animali e attenersi alle linee guida.
   2. Utilizzare un paio di forbici affilate per raccogliere i testicoli. Posizionare i testicoli in 1 mL di PBS ghiacciata per rimuovere eventuali contaminazioni di sangue.
   3. Difficoltà i testicoli in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 ° C per 12-24 h. scartare il 4% PFA e lavare il tessuto 3 x 1,5 ml di PBS + 1% a temperatura ambiente.
   4. Disidratare il tessuto in saccarosio 30% durante la notte. Mettere il testicolo nella cornice incorporamento e coprire il tessuto con temperatura ottimale di taglio composto (OCT). Dopo l'OCT è congelato, riempire il fotogramma incorporamento con OCT in modo che l'intero testicolo può essere coperto con OCT.
   5. Taglio 5-μm di spessore, congelati sezioni trasversali dei testicoli in un criostato a-20 ° C e farli aderire ai vetrini da microscopio.
      Nota: Ricongelare tessuti incorporati in ghiaccio secco può aumentare la rigidità per il taglio.
4. Richiesta di immagine
   1. Porre i vetrini in una scatola umidificata. Scaldare i vetrini a temperatura ambiente per 10 min.
   2. Lavare le sezioni 3 x con soluzione fisiologica tamponata (TBS) a temperatura ambiente.
   3. Asciugare all'aria per 5 min al buio. Pulire qualsiasi residuo TBS con carta privo di polvere.
   4. Coprire le sezioni trasversali con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Porre il coprivetrino invertito su un vetrino da microscopio.
   5. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale. Un totale di 20 ingrandimenti è generalmente sufficiente per rilevare il segnale luminoso fluorescente.

Risultati

Il set-up sperimentale per eseguire il dosaggio di integrità BTB è illustrato nella Figura 1. Tirare e affinare i capillari di microiniezione con un estrattore capillare e frese per micropipetta, rispettivamente (Figura 1A e 1C). Il riscaldatore termostatico e attrezzature per il microinjection sono illustrate nella Figura 1B e 1D.

Discussione

Spermatogenesi avviene nell'epitelio seminifero ed è un processo altamente ordinato e dinamico che è disciplinato dalle cellule germinali e le cellule somatiche (per es., cellule di Sertoli)¹³. La struttura BTB, che è costruita dalle cellule di Sertoli, divide l'epitelio seminifero in un basale e un compartimento apicale. Lo sviluppo delle cellule germinali meiotiche e aploidi avviene nel compartimento apicale che forma una barriera immunologica¹⁴.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary puller	SUTTER INSTRUMENT (USA)	P-97
10x PBS	Hyclone (USA)	SH30258.01	dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma (USA)	F6057
Adhesion microscope slides	CITOGLAS (China)	80312-3161
Cadmium chloride	Sigma (USA)	655198-5G
Confocal microscope	Zeiss (Germany)	LSM700
Dust-free paper	Kimberly-Clark (USA)	34120
Inulin-FITC	Sigma (USA)	F3272
Microinjection capillaries	Zhengtianyi (China)	BJ-40	1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler	NARISHIGE (JAPAN)	EG-400
OCT	SAKURA (JAPAN)	4583
Paraformaldehyde	Sigma (USA)	P6148
Pentobarbital sodium	Merck (Germany)	P11011
Shaver	Yashen (China)
Stereo microscope	Nikon (JAPAN)	SMZ1000
Sucrose	Sangon Biotech (China)	A610498
Surgical instruments	Stronger (China)		scissors, forceps, needle holder
Syringe	KDL (China)	20163150518	0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater	KELL (Nanjing, China)	KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris	Sangon Biotech (China)	A600194
1.37 M Nacl	Sangon Biotech (China)	A610476