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Resumo

O locus coeruleus é um pequeno aglomerado de neurônios envolvidos em uma variedade de processos fisiológicos. Aqui, descrevemos um protocolo para preparar seções de cérebro de rato para estudos de proteínas e metais neste núcleo.

Resumo

O locus coeruleus (LC) é um importante polo de noradrenalina produzindo neurônios que modulam a um número de funções fisiológicas. Anormalidades estruturais ou funcionais do LC impacto de várias regiões do cérebro, incluindo o córtex, hipocampo e cerebelo e podem contribuir para a depressão, transtorno bipolar, ansiedade, bem como doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Estes distúrbios são frequentemente associados com misbalance de metal, mas o papel dos metais na LC é apenas parcialmente compreendido. Estudos morfológicos e funcionais da LC são necessários para melhor compreender as patologias humanas e contribuição de metais. Os ratos são um modelo experimental utilizado, mas o mouse LC é pequeno (~0.3 mm de diâmetro) e difícil de identificar para um não-especialista. Aqui, descrevemos um protocolo baseado em imuno-histoquímica passo a passo para localizar o LC no cérebro do rato. Dopamina-β-hidroxilase (DAP) e, alternativamente, Tirosina Hidroxilase (TH), duas enzimas altamente expressadas na LC, são utilizados como marcadores imuno-histoquímicos em fatias de cérebro. Seções adjacentes às seções contendo LC podem ser usadas para uma análise mais adicional, incluindo histologia para estudos morfológicos, testes metabólicos, bem como imagens de metal por microscopia de fluorescência de raios-x (XFM).

Introdução

O locus coeruleus (LC) é uma região importante do tronco cerebral e um importante local de produção de norepinefrina (NE)1. A LC envia projeções em todo o cérebro2 para o córtex, do hipocampo e do cerebelo3 e regula os principais processos fisiológicos, incluindo o ritmo circadiano4,5, atenção e memória6, estresse emoção9,10, processos cognitivos8e7. Disfunção de LC tem sido implicada em distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos11, incluindo Parkinson doença12,13,14, doença de Alzheimer14, depressão15 ,16,17, transtorno bipolar,18,19e ansiedade20,21,22,23, 24. tendo em conta estes papéis, análise da LC é crucial para estudar sua função e disfunção.

Os ratos são amplamente utilizados para estudos de processos de alterações fisiológicos e fisiopatológicas. Devido ao seu pequeno tamanho, o mouse LC tem um diâmetro médio de ~ 300 μm, levando a dificuldade de localizar a estrutura. Durante o corte de cérebro, LC pode ser facilmente perdida nas secções coronais ou sagitais. Estudos disponíveis, descrevendo a identificação de LC em animais não oferecem um protocolo passo a passo que um não-especialista pode acompanhar1,25. Assim, para oferecer orientação para localização de LC, descrevemos um protocolo que desenvolvemos para localizar esta região do cérebro de rato para várias aplicações (Figura 1, Figura 2, Figura 3). O protocolo aplica-se cuidadosamente controladas cérebro seccionamento e imuno-histoquímica de deteção de DAP26,27, ou, alternativamente, TH24, ambas enzimas altamente enriquecidas em LC28. Uma vez que a LC está localizado por imuno-histoquímica, fatias de cérebro adjacente podem ser usadas para estudos adicionais, incluindo análises morfológicas e metabólicas, bem como estudos de imagiologia metais através de de microscopia (XFM) de fluorescência de raios-x29. Descrevemos XFM como exemplo neste protocolo (Figura 3).

Protocolo

Estudos dos animais foi aprovado pela Johns Hopkins University Cuidado Animal e uso (ACUC) protocolo número M017M385.

1. o cérebro de corte

  1. Para imobilizar, anestesia os ratos através da aplicação de 3% de isoflurano.
    1. Embeber uma bola de algodão com gotas de isoflurano e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora de 15 mL. Coloque o nariz do animal no tubo e permitir que inalar o isoflurano. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta ao dedo do pé-pitada.
  2. Coloque o animal em suas costas e imobilizá-lo fixando suas extremidades para baixo com um pino de T, tendo acesso ao seu abdômen.
  3. Cortar o animal com uma tesoura cirúrgica, fazendo um recorte da pele abdominal e cortar a pele na região do tórax. Segure a pele usando pinos T. Em seguida, quebre a membrana peritoneal até o tórax. Expor o coração de rachamento da cavidade torácica e o diafragma de corte.
  4. Corte a aurícula direita para permitir que o sangue flua para fora do animal. Introduza uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 25 no ventrículo esquerdo e perfundir com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS).
    Nota: Isto permite que a solução a fluir através da circulação sistêmica e saída através do átrio direito.
  5. Remova a seringa de 10 mL e inserir uma agulha de calibre 25 anexada para a seringa de 60 mL. Perfundir através do ventrículo esquerdo com 50 mL de paraformaldeído de 4% frio gelo (PFA).
    1. Preparar solução PFA 4% fria gelo diluir 10% solução PFA em H2O e refrigeração da solução final de PFA de 4% a 4 ° C.
  6. Isolar a cabeça do rato e remover o cérebro do crânio.
    1. Cortar a pele do pescoço e em seguida, corte em direção aos olhos para expor o crânio. Rachar o crânio do pescoço ao nariz e depois de um olho para o outro. Descasque o crânio para fora e excisar o cérebro todo.
  7. Incubar o cérebro em 4% PFA por 24 h a 4 ° C.
  8. Transferi o cérebro com pinças em um tubo cônico de 50 mL, preenchido com 25 mL de solução de sacarose de 30%. Manter a 4 ° C, durante 48-72 h até que o cérebro afunda até o fundo do tubo.
  9. Corte o cérebro com um cortador de cérebro de rato adulto coronal de matriz através do mesencéfalo (~ 3 mm posterior de bregma). Manter a seção do cérebro que contém o tronco cerebral.
    Nota: Isto irá resultar em duas seções do cérebro – contendo mais de córtex (anterior do corte) e contenha o tronco cerebral/cerebelo (posterior do corte). Use a seção de tronco cerebral para as etapas seguintes.
  10. Incorporar a secção do tronco encefálico com superfície de corte colocada no fundo de um molde de encastre, rodeado pela temperatura ideal corte composta (OCT); mover o cérebro incorporado para um freezer-80 ° C e congele pelo menos 12 h – até utilização posterior.
  11. Corte no criostato: lugar da incorporação do molde que contém o cérebro na OCT em criostato; -incube em criostato por várias horas ajustar a temperatura do bloco de cérebro do criostato.
  12. Descasca o molde incorporação para expor o OCT bloco que contém o cérebro.
  13. Use lâminas de barbear para remover o excesso de PTU da superfície do bloco sem tocar o cérebro.
  14. Monte o bloco OCT na bucha do criostato, expondo a superfície de corte do cérebro para a frente.
  15. Ajuste a superfície de corte do cérebro para que ele é orientado em paralelo com as lâminas do criostato.
  16. Apare o cérebro começando a medula, 100 µm de seções de corte rostral.
  17. Corte rostral até o cerebelo e tronco encefálico cortada como uma fatia contínua. Começa a colecionar fatias de 50 µm de espessura.
    Nota: Como um apara rostral da medula, do tronco encefálico e cerebelo cortará como duas seções separadas. Nas seções rostrais, o tronco cerebral e cerebelo irão eventualmente fundir-se ao nível do ventrículo 4th . Uma vez que as bordas laterais do ventrículo 4th são bem-formados, depois o cerebelo e o tronco encefálico vão sair como uma fatia contínua.
    1. Coletar o cérebro OCT-cercado fatia com fórceps e colocá-lo em um poço de uma placa de 24 preenchido com PBS (Figura 2a). A LC será mais proeminente quando o cerebelo e o colículo inferior encontrar um ao outro no ~-5.52 mm posterior de bregma (Figura 1b).
      Nota: A parte mais anterior da LC desaparecerão assim que o cerebelo tem sido totalmente seccionado e já não envolve o colículo inferior no ~-5.34 mm posterior de bregma (Figura 1C).

2. imuno-histoquímica para dopamina β-hidroxilase ou Tirosina Hidroxilase (Figura 2)

  1. Dia 1
    1. Lave as fatias selecionadas três vezes por 5 min em PBS.
    2. Permeabilize para 24h em solução salina tamponada fosfato de 0,5% com detergente (PBSD) a 4 ° C.
      1. Dilua 125 µ l de detergente em 25 mL de PBS.
  2. Dia 2
    1. Lave as fatias três vezes por 5 min em 0,5% PBSD.
    2. Adicione o anticorpo primário, anti-DAP ou anti-TH para 18 h, a uma diluição de 1: 500 em 0,5% PBSD a 4 ° C.
  3. Dia 3
    1. Lave as fatias três vezes por 10 min em 0,5% PBSD.
    2. Adicione o anticorpo secundário desejado (488 burro anticoelho para fluorescência verde) a uma diluição de 1: 1000 em 0,5% PBSD para 16 h.
    3. Embrulhe o prato bem 24 em alumínio e lugar a 4 ° C.
    4. Lave as fatias três vezes por 5 min em 0,5% PBSD.
    5. Lavagem por 5 min em PBS.
    6. Transfira as fatias com um pincel lápis em um recipiente de água.
    7. Monte fatias flutuando na água em slides carregados.
    8. Seções da lamela com mídia de montagem hard-set (sem DAPI).
    9. Seque as seções do cérebro montado por 30 min à temperatura ambiente.
    10. Fatias de cérebro de imagem em um microscópio confocal ou fluorescente com configurações para detectar o sinal de comprimento de onda do anticorpo secundário apropriado fluoróforo.
    11. Ajustar o microscópio para o plano focal da fatia cerebral e levar uma única imagem com ampliação de 10x.
    12. Para localizar uma possível região de LC na fatia do cérebro, use 4th ventrículo para orientação; o cerebelo situa-se acima do ventrículo, pons e tronco encefálico encontram-se abaixo de30.
    13. Para localizar o LC, concentre-se nas bordas laterais do 4th ventrículo; a LC origina-se das bordas do 4th ventrículo e pontos em direção a ponte / região de tronco cerebral (Fig. 2b, 2C).
    14. Seguir a imagem e a localização da LC em determinadas fatias do cérebro, armazenar slides contendo fatias de cérebro a 4 ° C.

3. detecção da LC em fatias de cérebro

  1. Para localizar a seção do cérebro contendo o LC, cortar o cérebro de rato, como descrito acima e recolher seções em PBS cheia 24 pratos bem, conforme mostrado na Figura 2a.
    1. Coloque uma seção de cérebro por alvéolo para permitir a localização adequada da LC.
  2. Colete um total de 48 fatias de cérebro que será immunostained por cérebro.
    Nota: Todos os poços dos dois pratos mostrados na Figura 2a contenham fatias do cérebro de um animal.
  3. Delgados cada fatia do terceiro ao quinto para DAP, ou th De preferência, realizar a imuno-histoquímica daquelas fatias de cérebro adjacentes àqueles que são doseados adicional (através de microscopia de fluorescência de raios-x, XFM).
    Nota: Este procedimento permite a localização exata da LC em fatias o ensaio final (Fig. 2a; rotulado com números entre os poços).
  4. Ajuste o número de fatias do cérebro que são immunostained dependendo da aplicação, por exemplo, se eles exigem a localização exata do centro e borda de LC, ou apenas uma aproximação áspera.
  5. Na sequência de imuno-histoquímica, detecta as fatias do cérebro contendo LC através de um padrão característico de expressão em ambos os lados do ventrículoth 4 (Fig. 2b, 2C). Ampliação do sinal do DAP em LC de fatias de cérebro consecutivos é mostrada na Figura 2d, 2e; a imagem ampliada da LC que é manchado por TH é mostrado em Figura 2f.
  6. Use as seções adjacentes para aqueles contendo LC para estudos adicionais - neste caso para XFM para quantificar os níveis de metal (Figura 3).
  7. Para executar a XFM, colete 10-30 µm (dependendo da configuração) cérebro coronal finas fatias na fina película polimérica com o qual podem ser montados em suportes de amostra e fotografadas no Síncrotron.
  8. Armazenar as fatias do cérebro que são preparadas na fina película polimérica para XFM à temperatura ambiente e realizar XFM.

4. metal Imaging em LC através de XFM

  1. Cortar o cérebro de rato de exemplo como descrito acima, LC de determinar e medir os níveis de metal através de XFM destas fatias de cérebro contendo o LC.
  2. Distribuições de imagem elementares na trajetória 2-ID-lés a fonte de fótons avançada (Argonne National Laboratory, Argonne IL).
  3. Gravar dados 'on the fly' conforme descrito anteriormente,31.
  4. Determine concentrações elementares em fatias de cérebro contendo o LC usando o programa mapas32,33.

Resultados

Alterações na homeostase de metal (tais como, Cu, Fe, Zn e Mn) são frequentemente observadas em distúrbios neurológicos, incluindo alterações na LC34,35. Assim, determinar níveis de metal no cérebro é necessário para a compreensão dos mecanismos da doença. As seções do cérebro geradas usando o protocolo descrito podem ser usadas para quantificar os níveis de Cu e outros metais em LC e compará-los com os níveis e...

Discussão

Orientar corretamente o espécime é um passo crucial no presente protocolo. Porque nós estamos usando características anatômicas da superfície dorsal do cérebro para localizar LC (fronteira entre o cerebelo e colículo inferior), é importante que as seções ser alinhados corretamente. Isto requer cuidado em definir corretamente o cérebro na matriz de fatiador de cérebro de rato. Recomendamos cortar ~ 500 μm mais tecido anterior e posterior à LC para evitar perder o núcleo. O erro mais comum é cortar seçõe...

Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

Agradecemos a Abigael Muchenditsi para a manutenção da colônia do mouse. Uso da fonte de fótons avançada no Argonne National Laboratory foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de base energia Ciências, sob o número do contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt para assistência na fonte de fótons avançada e suporte ao usuário. Este trabalho foi financiado pelo 2R01GM101502 de concessão Instituto Nacional de saúde para SL.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mouse brain slicer matrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
Confocal microscopeZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
Cryostat cutting bladesThermo Fisher ScientificMX35
Scissors Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit)B. Eipper-
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
MicroscopePascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
Optimal cutting temperature compound (OCT)VWR/ tissue tech102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10%Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way disposable embedding moldsPolysciences Inc.18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS)Life Tech14190250
Razor bladesAmazonASIN: B000CMFJZ2
SpatulasAntech Diagnostcs14374
T pinsOffice Depot344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit)EMD MilliporeAB152
Ultralene thin film for XRFSPEX Sample Prep3525
Wide-field fluorescent microscopeZeissAxio Zoom.V16

Referências

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