ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

要約

ここでは、C57BLにおけるブレオマイシンの気管内注射による肺損傷の誘導後に臍帯全体から得られた静脈内注入ヒト間葉間質間質細胞の抗線維活性を調べるための有効な方法を提示する。/6マウス。このプロトコルは、他の治療薬の前臨床試験に容易に拡張することができる。

要約

肺線維症は、異なる病因を持ついくつかのヒト肺疾患の特徴である。現在の治療法はかなり限られているので、マウスモデルは新しい抗線維性戦略を開発するために不可欠なツールであり続けています。ここでは、ブレオマイシン誘発性肺損傷の減衰において臍帯全体(hUC-MSC)から得られたヒト間葉間質間質細胞の生体内抗線維化活性を調べるための有効な方法を提供する。C57BL/6マウスは、ブレオマイシン(1.5U/kg体重)の単一の気管注射を受け、続いて、末静脈にhUC-MSC(2.5 x10 5)を二重注入し、ブレオマイシン投与後24時間および7日後に投与した。8日目、14日目、または21日目に犠牲を起こすと、炎症性および線維性変化、コラーゲン含有量、および移植された肺組織におけるhUC-MSCの存在が分析される。マウス気管へのブレオマイシンの注入は、肺の直接的な標的化を可能にし、広範な肺炎症および線維症を引き起こす。hUC-MSCの二重用量の全身投与は、ブレオマイシン誘発性肺損傷の早期鈍化をもたらす。静脈内注入されたhUC-MSCは、マウス肺に一時的に生着し、そこで抗炎症および抗線維芽生活性を発揮する。結論として、このプロトコルは、ヒト肺線維症の実験マウスモデルにおけるhUC-MSCの前臨床試験に正常に適用された。しかし、この技術は、肺の病態生理学に対する異なる気管内投与物質の効果を研究し、新しい抗炎症および抗線維性全身療法を検証するために、両方とも容易に拡張することができる。

概要

肺線維症は、細胞外マトリックス成分の過剰な沈着を特徴とする進行性病理学的プロセスであり、主にI型コラーゲン、肺間質において、肺機能障害を引き起こしうる。これは、異なる病因を持ついくつかのヒト肺疾患の特徴であり、貧弱な臨床予後因子を表す。現在の治療法はかなり限られている^ので、マウスモデルは、疾患の発症と進行に影響を与える病原性メカニズムのさらなる調査と新しい抗線維性の開発の両方に不可欠なツールであり続ける戦略^2,3.

今日まで、ブレオマイシンの投与は、実験的に誘発された肺線維^症4の最も一般的に適用されたモデルであった。複数の送達方法(静脈内、皮内、皮下、および吸入を含む)のほかに、ブレオマイシンの気管内注射または気管内注射は、最も頻繁に使用される経路4、5として出現している。我々がここで説明する方法は、気管粘膜に対するブレオマイシンのスケーリング効果を回避するために開発された。実際には、気管を外装し、作動顕微鏡を介して可視化することにより、上気道にこぼれることなく、ブレオマイシン溶液の全容積を直接下部気道に注入することが可能です。必要な外科的専門知識および器械使用が利用できる場合、この方法は以下に報告される肺の炎症および線維症の安全で、強く、再生可能な誘導を可能にする。

プロトコル

すべての動物のケアと実験手順は、イタリア保健省(認可n.456/2016-PR)によって承認され、ヘルシンキ条約の宣言に従って行われました。

1. マウス

1. それらを購入した後、マウスが注射の少なくとも7日間順応することを許可する。
   注:マウスは、病原体のない条件下で動物施設に収容され、12時間の光/暗いサイクルで一定の温度と湿度の下で維持され、水および標準的なペレット食品への自由なアクセスを与えられた。
2. メスのC57BL/6マウスを使用し、生後12~16週目に注射する。

2. ブレオマイシンの気管内注射

1. ブレオマイシン製剤
   注意:化学物質の分類と標識(GHS)の世界的に調和したシステムに基づいて、ブレオマイシンはGHS08健康被害に分類されます。
   1. 化学フードの下にブレオマイシンを準備します。
   2. 所望の作業濃度(0.05 U/100 μL)を得るために、無菌生理生殖塩分の30mLで凍結乾燥ブレオマイシン硫酸の15Uを再懸濁する。
   3. 血栓の形成を避けるためにチューブを反転してサンプルを慎重に混合します。
   4. チューブに再サスペンションの日付を適切にラベル付けし、4°Cに保管し、24時間以内にその内容を使用してください。
   5. インスティテーションの前に、ブレオマイシン溶液を室温に平衡化する。
      注:この実験では、ブレオマイシンの1.5U/kg体重の単回用量を使用して、C57BL/6マウスの肺損傷を誘導した。それにもかかわらず、各マウス株は、ブレオマイシン6、7に対して異なる感度を^有する。ブレオマイシンの滴定は、実験に使用されるマウス株における最適な用量を決定するために行われるべきである。
2. 麻酔
   1. 無菌生理食生の9mLと絶対エタノールの1mL(20mg/mLの作業濃度で)に2,2,2-トリブロモエタノールの0.2gを溶解することにより麻酔を調製する。
   2. 血栓の形成を避けるためにチューブを反転することによって完全に混合します。
   3. 適切に準備の日付とチューブをラベル付けし、暗闇の中で4 °Cでそれを保存し、3日以内にそれを使用します。
   4. マウス1匹につき250μLのトリブロモエタノール溶液(体重200mg/kgの最終用量)の経皮注射でマウスを麻酔し、1mL注射器と26G針を用いた。
      注:この用量では、マウスは少なくとも20分間意識不明である。必要に応じて、マウス応答に応じて投与量を調整し、獣医師と相談する。
   5. マウスの呼吸を監視します。呼吸速度はわずかに低下します。数分後、マウスの足の1つをつまんでペダル反射の欠如を確認します。
3. 気管内注射
   1. すべての手順の間に無菌状態を維持します。滅菌手術器具および材料を使用し、滅菌手袋を着用し、非滅菌表面との接触を避ける。
   2. 麻酔されたマウスを手術用プラットフォームの背中に置き、手術用テープストリップで脚を繊細に固定して所定の位置に保持します。
      注:マウスの脚の穏やかなテーピングは、マウスが回転中に外科プラットフォームから離れて滑るのを避けることをお勧めします(ステップ2.3.10)。
   3. 熱したマットの上にマウスを置き、直腸温度を介入を通じて37°Cで安定した状態に保ちます。直腸プローブで直腸温度を測定します。
   4. 子宮頸部の下に、例えば歯科綿ロールを「枕」を置くことによって、マウスの首をゆっくりと伸ばす。
   5. かみそり刃で喉をそっと剃ります。
   6. アルコールで外科領域から毛髪を取り除き、1%のポビドネヨウ素溶液でマウスの皮膚を数回消毒する。
   7. 解剖学的鉗子のペアで皮膚をつまみ、リングハンドル、湾曲した鈍いはさみを使用して、マウスのステルノヒオイド筋肉の対応で短い切開を行います。
      注:皮膚の切開は、長さ約0.5センチメートルです。取り除かれた対応する皮膚片は非常に小さいので、マウスの首に張力を生じさせます。
   8. 綿毛棒で出血を止めてください。
   9. 鈍い解剖によって気管を外装し、脂肪および他のティッシュから穏やかにそれをきれいにする。
   10. 外科用プラットフォームを回転させて、マウスの頭をオペレータに向けます。
       注:この位置は、オペレータが注射中に、それが肺にまっすぐに気管の自然なパスに従うように注射器を角度付けすることを可能にします。
   11. 操作顕微鏡の下にマウスを置き、気管の視覚化に役立ちます。イルミネーションを調整し、倍率(1~1.2)、フォーカス、シャープネスを設定します。気管は白い半透明の管として容易に区別することができ、気管リングは明確に見える。
   12. ブレオマイシン溶液を穏やかにピペッティングして混合し、100 μLを25Gの針で0.5mLの注射器に吸引し、気泡形成を避ける。
   13. 気管をはっきりと可視化したら、30°の角度で針先で慎重に穿刺する(図1A)。
   14. 100 μLのブレオマイシンまたは無菌生理生理(車両制御)を気管の内腔に直接注入します。ボリューム全体が針を下ろすまで数秒待ってから、気管から取り外します。
   15. 針が気管に正しく挿入されたときに発生する無呼吸の数秒を観察し、マウスがすぐに液体の体積全体を吸い込むようにします。
   16. マウスが液体を吸い込んでいない場合は、呼吸を注意深く監視し、針の位置を調整します。マウスが呼吸を停止した場合は、すぐに針を取り外し、マウスが正常に呼吸を再開してから再挿入できるようにします。
   17. 注射後に注射器と針を安全に捨てなさい。
   18. 皮下筋膜と皮膚創傷を5-0吸収性縫合糸で閉じる。
       注:完全に再吸収されない場合は、手術後7〜10日後に縫合糸を取り除きます。
4. 動物の回復
   1. 注入したマウスを回復用の加熱パッドの横に置きます。
   2. マウスの呼吸を監視し、マウスが動き始め、厳しい回復と完全な意識を取り戻すまで観察します。
   3. マウスの状態が良好であることを確認したら、元のケージに戻します。完全に回復するまで、他の動物の会社に返却しないでください。
   4. 長期の鎮痛を確保し、残存後の介入後の痛みを避けるために、皮下ブプレノルフィン(体重0.05mg/kgの最終用量で)を12時間の後気管注射ごとにマウスに投与する。
   5. ブレオマイシンの気管注射後24時間マウスを調べ、1日2回行う。呼吸困難、体重減少、行動異常、および罹患率の兆候がないか、マウスを監視します。

3. ヒト臍帯間間質間質細胞の尾静脈注入

1. 細胞製剤
   注:ヒト臍帯からの間葉間間間質間質細胞の単離、特徴付け、および培養は、以前に8、9、10について説明した。hUC-MSCは無菌的に操作され、注入されるべきである。したがって、無菌フードの下ですべてのステップを実行します。
   1. hUC-MSCを75cm2培養フラスコで早期通路(最大1~3個)に拡大します。
      注:hUC-MSCは、マウスへの注入の日に70%のコンフルエントでなければなりません。
   2. 無菌リン酸緩衝生理食べ物(PBS)の10mLで細胞を室温で洗浄します。
   3. トリプシンの2 mLを追加し、それらが切り離し始めるまで、約1分間37°Cで細胞をインキュベートします。
   4. 10%の胎児ウシ血清(FBS)を含むhUC-MSC完全培地の8 mLを添加してトリプシンを中和する。
   5. 350 x gで10分間遠心分離によって細胞を集める。
   6. 滅菌生理生理生でペレットを再懸濁し、Bürker室を使用して細胞を数えます。マウス当たりの無菌生理生殖水の200 μLで細胞を2.5 x 10⁵の最終濃度に希釈することにより、注入用の細胞懸濁液を調味する。すべてのマウスを注入するのに十分な体積があることを確認するために、余分な細胞懸濁液を準備します。
   7. 注入の前に氷の上に細胞を保つ。セクション 3.3 で説明するように、数時間以内に注入します。
2. 麻酔
   注:注射中にマウス尾静脈を損傷するリスクを最小限に抑えるために、マウスを動かしてはいけません。したがって、麻酔は、単純なマウス拘束よりも好ましい。
   1. 誘導室で4%イソファラン吸入によりマウスを麻酔する。
   2. マウスの呼吸を監視します。呼吸速度はわずかに低下します。数分後、マウスの足の1つをつまんで、適切な麻酔を確認します。
3. 尾静脈注入
   1. 意識不明が確認されたら、無菌hUC-MSC静脈内注入用の無菌フードの下にマウスを置きます。
   2. 1.5%のイソファランの連続的な流れを持つ顔のマスクを介して実験全体を通して全身麻酔を維持する。
   3. 血管拡張を促進し、より容易な注射を可能にするために、2分間温水にマウスの尾を浸します。
   4. 細胞が塊を形成しないことを確認するために穏やかにピペッティングによって細胞懸濁液を混合します。26 G の針を使用して 1 mL シリンジに 200 μL を吸引し、気泡の形成を回避します。
   5. マウスの尾を先端で持ち、そっとまっすぐにします。
   6. マウステールの横静脈を見つけます。メスでそっとこすり、70%エタノールで拭きます。
      注:尾の緩やかな削り取りは、髪を除去するために行われ、注射部位がより滑らかでクリーンになります。
   7. 尾部の遠位部分から始めて、針を15°の角度で静脈に挿入し、hUC-MSCまたは無菌生理食生の200 μLをゆっくりと注入する(図1B)。
   8. 抵抗なしで静脈に入る液体による静脈内注入の成功を監視し、贅沢の欠如によって。ボリューム全体が針を下ろすまで数秒待ってから、静脈から取り外します。
   9. 出血を防ぐために、無菌ガーゼで創傷口に圧力をかける。
   10. 注入後に注射器と針を安全に廃棄します。
4. 動物の回復
   1. 注入したマウスをヒーターパッドの横に置き、回復します。
   2. マウスの呼吸を監視し、マウスが動き始め、厳しい回復と完全な意識を取り戻すまで観察します。
   3. マウスの状態が良好であることを確認したら、元のケージに戻します。完全に回復するまで、他の動物の会社に返却しないでください。
   4. 尾静脈注入後24時間、1日おきにマウスを調べ、健康状態を監視し、苦しみや病理学的徴候を早期に検出する。

4. 臓器移植および組織処理

1. 注射麻酔薬の過剰摂取によりブレオマイシン投与後の8日目、14日目、または21日目にマウスを犠牲にする(図1C)。
2. 気管と肺を切除し、すぐに氷冷PBSでそれらを洗浄します。
3. 液体窒素中の右肺をスナップフリーズし、その後の分子^分析10のために-80 °Cでそれらを保存します。
4. 4%のパラホルムアルデヒドで左肺を膨張させ、24時間10%の中性緩衝ホルマリン溶液で固定します。その後、グレードのアルコールシリーズでそれらを脱水し、キシレンでそれらをクリアし、パラ^フィン10にそれらを埋め込みます。

結果

肺損傷は、無菌生理生殖量の100μLでブレオマイシン硫酸の1.5 U/kg体重の単一の気管注射によって誘発された。対照動物は、等量の生理生理生理の気管内注射を受けた。hUC-MSC(無菌生理食生の200μLで2.5 x 10⁵⁾の2ショットを、ブレオマイシン投与後24時間および7日後にマウス尾静脈に注入した。対照動物は、無菌生理生理の等量の静脈内注入を受けた。マウスは、?...

ディスカッション

気管内投与は、外因性薬剤を肺に送り込む優遇経路である。数年以来、気管へのブレオマイシンの直接注入は、肺線維^症13を誘導するために広く使用され、最近では、より高度な、非侵襲的な技術は、この14、15を達成するために開発されています ^、16.

ここで説明する方法は、いくつ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River	Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402
Barraquer Micro Needle Holder	Lawton	62-3755
Bleomycin sulfate	Sigma-Aldrich	B1141000
Bürker chamber	Brand	718905
Culture Flasks	EuroClone	ET7076
Disposable razors	Unigloves	4080
Dissecting Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
Heating pad	2Biological Instruments	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
Operating Microscope	Carl Zeiss	Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas Micro Scissors	Aesculap Surgical Instruments	OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm	Ethicon	VCP392ZH