Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

Riepilogo

Questo articolo fornisce un metodo per isolare puri tessuti embrionali da embrioni di pollo e quaglie che possono essere combinati per formare ex vivo chimerico organi.

Abstract

La capacità di isolare i tessuti embrionali era un passo essenziale per stabilire il sistema di quaglia-pollo chimera, che a sua volta ha fornito contributi indiscussi per svelare processi chiave nella biologia inerente allo sviluppo.

Qui è descritto un metodo ottimizzato per isolare i tessuti embrionali da quaglie e polli di microchirurgia e digestione enzimatica pur conservando le sue proprietà biologiche. Dopo l'isolamento, tessuti da entrambe le specie sono associati in un saggio in vitro organotipiche per 48 h. Quaglia e tessuti di pollo possono essere discriminate da distinte caratteristiche nucleari e marcatori molecolari, permettendo lo studio del cellulare cross-talk tra Associazione heterospecific dei tessuti. Questo approccio è, pertanto, uno strumento utile per lo studio delle interazioni complesse del tessuto in processi di sviluppo con modifiche spaziali altamente dinamiche, come quelle che si verificano durante la morfogenesi della faringe e la formazione della del foregut endoderma-derivato organi. Questo approccio sperimentale è stato sviluppato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi di formazione di timo. In questo, l'endoderma-derivato prospettico rudimento timico e mesenchima derivato dal mesoderma, sono state isolate da embrioni di pollo e quaglia, rispettivamente.

La capacità dei tessuti associati per generare gli organi possa essere ulteriormente testata mediante innesto li sulla membrana corio-allantoidea (CAM) di un embrione di pollo. Il CAM fornisce le sostanze nutrienti e consente lo scambio di gas ai tessuti espiantati. Dopo 10 giorni di sviluppo di ovo, gli organi chimerici possono essere analizzati in espianti di raccolti con i metodi morfologici convenzionali. Questa procedura permette anche di studiare tessuto-specifici contributi durante la formazione dell'organo, dal suo iniziale sviluppo (sviluppo in vitro) alle fasi finali dell'organogenesi (in sviluppo di ovo).

Infine, il metodo migliore isolamento fornisce anche tridimensionale (3D) conservato tessuti embrionali, che possono essere utilizzati anche per analisi topografiche ad alta risoluzione dei modelli di espressione genica tessuto-specifica.

Introduzione

Agli inizi del 1970, un sistema elegante quaglia-pollo chimera è stato sviluppato da Le Douarin, aprendo nuove vie per comprendere il ruolo della migrazione cellulare e interazioni cellulari durante lo sviluppo^1,2. Il modello è stato ideato sulla premessa che scambio di cellule tra le due specie non vorrei disturbare notevolmente l'embriogenesi, successivamente confermato quando utilizzati per lo studio di numerosi processi di sviluppo, tra cui la formazione del sistema nervoso e l'ematopoietiche sistemi¹. Prendendo quest'ultimo come un esempio, le onde cicliche dei progenitori ematopoietici colonizzando il rudimento epiteliale del timo in primo luogo è stata osservata mediante quaglia-pollo chimera system³. Per questo, il territorio prospettico del timo, l'endoderma dei sacchetti di terzi e quarto pharyngeal (3/4PP), era meccanicamente ed enzimaticamente isolato da embrioni di quaglia (q) in 15-30 - fase somite [giorno embrionale (E) 1.5-E2.5]. Queste fasi corrispondono al pollo Hamburger e Hamilton⁴ (HH) - fasi 12-17. Le procedure di isolamento iniziato con l'uso di tripsina enzimaticamente dissociare l'endoderma dal mesenchima allegato. L'endoderma isolato è stato innestato nella regione somatopleura di embrione di pollo (c) ospite presso E3-E3.5 (HH-fasi 20-21). Questo mesenchima eterologa è stato considerato "permissivo" allo sviluppo di epitelio timico che contribuiscono anche alla formazione dell'organo³. In seguito, ondate successive di cellule progenitrici ematica di pollo ospite infiltrato la controparte quaglia donatore timici epiteliali che contribuiscono alla formazione di timo in embrione host³.

Più recentemente, una versione modificata di questo approccio è stato anche dimostrata di essere importante per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo⁵. A questo proposito, i tessuti coinvolti nella formazione del timo ectopico in embrioni chimerici³ erano isolati, sia da donatore e host embrioni e associati ex vivo. Un protocollo migliorato è stato usato per isolare l'endoderma 3/4PP di quaglia (E2.5-E3) e il mesoderma somatopleura di pollo (E2.5-E3). Brevemente, i tessuti embrionali sono stati isolati di microchirurgia e soggetto a digestione in vitro pancreatina. Inoltre, le condizioni di digestione enzimatica, temperatura e tempo di incubazione sono state ottimizzate secondo tessuto tipo e Stadio di sviluppo (tabella 1).

Successivamente, i tessuti isolati sono stati associati in un organotipiche sistema in vitro per 48 h, come precedentemente segnalato^5,6. L'associazione in vitro di tessuti imita il locale interazioni cellulari nell'embrione, superando alcune restrizioni della manipolazione in vivo. Questo sistema è particolarmente utile per studiare le interazioni cellulari in eventi morfogenetici complessi, quali lo sviluppo dell'apparato faringeo.

Il contributo di ogni tessuto nell'istogenesi di timo, così come la capacità dell'associazione heterospecific per generare un timo può essere ulteriormente esplorato utilizzando la metodologia di CAM, precedentemente dettagliate^5,7,8. Succintamente, i tessuti coltivati sono stati innestati la CAM di embrioni cE8 e ha permesso di sviluppare in ovo per 10 giorni. Quindi, formazione di timo è stata valutata mediante analisi morfologica in espianti di raccolti. Come gli studi classici di quaglia-pollo³, l'epitelio timico quaglia è stata colonizzata da cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da un embrione di pollo, che più successivamente è stato indicato per contribuire allo sviluppo di organo^9,10 . La HPCs migrati dall'embrione al timo ectopico chimerico attraverso l'altamente vascularized CAM^5,7,8. Quaglia epitelio timico derivata può essere identificato mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi specie-specifici (cioè, QCPN - MAb Quaglia perinucleare), superando la necessità di marcatori molecolari del tessuto-specifica.

Questo metodo sperimentale, come l'approccio in due fasi segnalato nella precedente pubblicazione⁸, consente la modulazione della trasduzione del segnale dalla regolare somministrazione di agenti farmacologici durante in vitro e in sviluppo di ovo. Inoltre, espianti possono essere raccolto in qualsiasi momento del corso dell' esperimento⁸.

Infine, il protocollo di isolamento qui dettagliato consente la conservazione delle proprietà naturali e 3D-architettura di tessuti embrionali, particolarmente utili per dettagliare modelli di espressione genica in situ dei territori embrionali altrimenti inaccessibili da metodi convenzionali. Inoltre, approcci di analisi del trascrittoma, tra cui RNA-seq o microarrays, possono anche applicarsi in tessuti isolati senza la necessità di marcatori genetici, fornendo un'analisi di tessuto-specifico elevato throughput "omics".

Protocollo

Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e orientamenti etici del Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. l'incubazione delle uova di quaglia e pollo fertilizzato

1. Posto fecondate le uova di quaglia giapponese (Coturnix japonica del coturnix) in un incubatore di 38 ° C per 3 giorni. Incubare le uova (estremità smussata uovo) rivolto verso l'alto nella camera d'aria.
   Nota: L'ambiente umidificato si ottiene inserendo un contenitore di acqua nella parte inferiore dell'incubatore.
2. Incubare uova fecondate di pollo (Gallus gallus) per 2,5 giorni in un incubatore di 38 ° C. Incubare le uova in posizione orizzontale e segnare la parte superiore utilizzando un pezzo di carbone per identificare la posizione di embrione.
   Nota: Iniziare con 40 uova di quaglia e 60 uova di gallina, quando si stabilisce questo esperimento.

2. isolamento di endoderma quaglia contenente il dominio prospettico del rudimento timico

Nota: Utilizzare una cappa a flusso laminare orizzontale e strumenti sterilizzati e materiali per le procedure di manipolazione di uovo in condizioni sterili.

1. Rimuovere l'area embrionale contenente il territorio presuntivo di rudimento timico, la regione arco faringea contenente il 3^rd e 4^th archi (3/4PAR), come descritto^7,8.
   1. Riempire una ciotola di vetro borosilicato di grandi dimensioni (100 x 50 mm; 100 cm³) con 60 mL di soluzione fredda tampone fosfato salino (PBS).
   2. Con l'aiuto di forbici curve, toccare e tagliare un foro circolare nel guscio di una quaglia uovo che è stato incubato per 3 giorni. Praticare il foro sul lato opposto dell'uovo smussato e trasferire il tuorlo (con l'embrione) alla ciotola con PBS freddo.
   3. Rimuovere l'embrione dal tuorlo tagliando la membrana vitellina esternamente ai vasi extra-embrionali utilizzando forbici curve.
   4. Con l'aiuto di pinzette sottili, trasferimento dell'embrione in una piccola ciotola (60 mm x 30 mm; 15 cm³) riempito con 10 mL di PBS freddo.
   5. Con una schiumarola, spostare l'embrione in una capsula di Petri con una base nera di 100 mm (Vedi Tabella materiali) contenente 10 mL di PBS freddo e posizionarlo sotto un microscopio stereoscopico.
   6. Sezionare il 3/4PAR, come descritto in precedenza⁸.
   7. Aspirato il 3/4PAR e trasferirlo in un piatto di vetro tre quarti pieno di PBS freddo utilizzando una pipetta Pasteur sterile di 2 mL.
2. Isolare l'endoderma contenente il territorio presuntivo di rudimento timico (l'endoderma 3/4PP) digestione enzimatica con pancreatina.
   1. Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, transfer 3/4PAR a un piatto di vetro tre quarti pieno di fredda pancreatina (8 mg/mL; diluizione di 1:3 di 25 mg/mL con PBS freddo).
   2. Incubare per 1 h sul ghiaccio per digestione enzimatica.
      Nota: Il tempo di digestione enzimatica dipende della fase di sviluppo (tabella 1).
   3. Mettere il piatto di vetro sotto lo stereomicroscopio (ingrandimento 40x x-60) per isolare l'endoderma da 3/4PAR.
      Nota: Tenere tutte le superfici e soluzioni fredde durante questa procedura. Modificare una nuova soluzione di pancreatina freddo se impiega troppo tempo per sezionare i tessuti (> 15 min). Come fonte di illuminazione, utilizzare luci a LED incorporati nello stereomicroscopio o in fibre ottiche, considerando il carico di calore limitato.
   4. Per isolare l'endoderma dai tessuti circostanti, è possibile utilizzare due acciaio inossidabile microscalpels nei supporti del perno.
      Nota: Utilizzare microscalpels con un diametro compreso tra 0,1 mm e 0,2 mm e ai titolari di pin di nichel con un diametro di apertura mascella da 0 a 1 mm.
      1. Prima di rimuovere il tubo neurale e mesoderma attaccate alla superficie dorsale dell'ipoblasto pharyngeal.
      2. Dal lato dorsale, attentamente staccare e rimuovere il mesenchyme tra gli archi pharyngeal ed esporre i sacchetti pharyngeal. Eseguire questa procedura su entrambi i lati di 3/4PAR.
      3. Rimuovere il tubo di cuore e il mesenchima che circonda i sacchetti anteriori.
      4. Dal lato ventrale, tagliare l'ectoderma della 2^° e 3^rd archi pharyngeal e rimuovere con cautela il mesenchyme collegato per le buste. Ripetere questa procedura sul lato opposto del 3/4PAR. In questa fase il rudimento della tiroide dovrebbe essere visibile.
      5. Rimuovere tutte le cellule mesenchymal rimanenti attaccate all'endoderma faringeo con i due microscalpels.
      6. Fare un taglio trasversale tra la 2^nd e 3^rd PP, dissociando l'ipoblasto pharyngeal contenente il 3^rd e 4^th sacchetti dalla parte anteriore dell'endoderma avendo il rudimento della tiroide e 2^nd sacchetto pharyngeal.
      7. Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, trasferimento l'endoderma 3/4PP isolato a un piatto di vetro tre quarti riempito con 100% freddo siero bovino fetale (FBS).
3. Tenere il piatto di vetro con i tessuti isolati sul ghiaccio durante la preparazione di analisi in vitro. In alternativa, possono conservarsi tridimensionalmente i tessuti isolati e analizzati in situ per espressione genica.

3. isolamento del mesoderma somatopleura pollo

Nota: Eseguire uovo procedure di manipolazione in condizioni sterili, utilizzando materiali e strumenti sterilizzati e cappa a flusso laminare orizzontale.

1. Rimuovere il territorio embrionale contenente il mesoderma somatopleura a livello di somiti 19-24 (ss19-24).
   1. Togliere l'uovo di pollo dall'incubatrice dopo 2,5 giorni di incubazione.
   2. Con forbici curve, è possibile aprire un piccolo foro nel guscio. Inserire un ago ed aspirare 2 mL di albumina con una siringa da 10 mL per abbassare il volume di albumina nell'uovo e prevenire danni dell'embrione (che si trova sotto l'area marcata della shell). Scartare l'albumina aspirato.
   3. Tagliare una circolare del foro (fino a due terzi della superficie superiore) della regione contrassegnato della shell utilizzando forbici curve.
   4. Tagliate la membrana vitellina esternamente ai vasi Extraembrionali tenendo l'embrione con una pinza sottile.
   5. Sotto un microscopio stereoscopico, posto l'embrione in una capsula di Petri di 100 mm con una base nera contenente 10 mL di PBS freddo.
      Nota: Utilizzare uno stereomicroscopio da questo punto in avanti per l'ingrandimento progressivo di procedure di microchirurgia.
   6. Utilizzare quattro spilli entomologici sottili per contenere l'embrione alla parte inferiore della piastra. Inserire i perni della regione extraembryonic formando una forma quadrata.
   7. Eseguire due tagli tra i somiti 19 e 24 trasversalmente all'asse dell'embrione e attraversando tutto il territorio dell'embrione, usando le forbici wecker occhio.
   8. Rilascio della sezione di embrione, ss19-24, da taglio bordi marginali embrionale.
   9. Aspirato il ss19-24 tessuti e trasferimento in un piatto di vetro tre quarti pieno di PBS freddo utilizzando una pipetta Pasteur sterile di 2 mL.
2. Isolare il mesoderma laterale dalla regione somatopleura (ss19-24) per digestione enzimatica con pancreatina (8 mg/mL; diluizione di 1:3 di 25 mg/mL con PBS freddo).
   1. Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe, trasferimento i tessuti ss19-24 per un vetro piatto tre quarti riempiti con soluzione fredda pancreatina.
   2. Incubare per 30 min in ghiaccio per digestione enzimatica.
   3. Sotto lo stereomicroscopio, isolare il mesoderma dai tessuti circostanti utilizzando due microscalpels in un supporto.
      Nota: Tenere tutte le superfici e soluzioni fredde durante questa procedura. Modificare una nuova soluzione di pancreatina freddo se impiega troppo tempo per sezionare i tessuti (> 10 min.). Come fonte di illuminazione, utilizzare luci a LED incorporati nello stereomicroscopio o in fibre ottiche, considerando il carico di calore limitato.
   4. Durante l'isolamento del mesoderma, rimuovere prima l'ectoderma sulla superficie, seguita da un'attenta separazione dei tessuti splancnopleura situato ventralmente.
   5. Rilascio del mesoderma laterale di destra della somatopleura tagliando in un movimento parallelo al tubo neurale.
   6. Ripetere la separazione di mesoderma del lato sinistro dell'embrione.
      Nota: Assicurarsi di microscalpel movimenti lenti durante questa procedura. Le proteine della matrice extracellulare esposta bastone ai tessuti e agli strumenti impedendo movimenti fluidi.
   7. Con l'aiuto della spatola e sottile forcipe transfer mesoderm isolato a un piatto di vetro tre quarti pieno di freddo FBS.
3. Tenere il piatto di vetro con i tessuti isolati sul ghiaccio durante la preparazione di analisi in vitro.

4. In vitro organotipiche dosaggio: heterospecific associazione di endoderma 3/4PP Quaglia e pollo somatopleura mesoderma

1. Preparare il terreno di coltura con RPMI-1640 supplementato con 10% FBS e 1% Pen/Strep^3,5.
2. Posizionare una griglia metallica in una capsula di Petri con 5 mL di terreno di coltura da 35 mm.
   Nota: Rimuovere l'eccesso di liquido per livellare la superficie media con la parte superiore della griglia.
3. Con l'aiuto di pinzette sottili, immergere un filtro a membrana nel terreno di coltura e poi è posto sulla parte superiore della griglia per avere una superficie a contatto con aria.
   Nota: Un quarto della zona della membrana (con 13 mm di diametro) è adeguato per l'associazione di tessuto.
4. Sotto lo stereomicroscopio, associare i tessuti isolati sulla parte superiore del filtro a membrana. Prima trasferire l'endoderma 3/4PP (passaggio 2) dal piatto di vetro facendo scorrere dolce con l'aiuto di una spatola (o cucchiaio di trapianto) e sottile forcipe. Ripetere questa procedura per il mesoderma isolato (passaggio 3).
   Nota: Con l'aiuto di un microscalpel, mescolare i tessuti per massimizzare la sua associazione.
5. Posizionare con attenzione i tessuti associati in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂ per tessuti coltivati h. 48 possono essere innestati sulla membrana corio-allantoidea (CAM).
   Nota: Formazione ectopica dell'organo nel CAM era precedentemente dettagliate⁸.

Risultati

Il protocollo in dettaglio un metodo per isolare i tessuti embrionali aviaria per essere utilizzato in diversi approcci tecnici di biologia cellulare e dello sviluppo. Questo metodo è stato precedentemente impiegato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo⁵. Nel presente documento, nuovi risultati sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2, utilizzando...

Discussione

La procedura di isolamento del tessuto embrionale dettagliata qui è stata migliorata dalle precedenti tecniche per produrre gli embrioni chimerici quaglia-pollo in diversi contesti biologici^3,5,6.

Questo approccio è adatto per isolare i tessuti embrionali puri senza la necessità di manipolazione genetica o l'uso di marcatori tessuto-specifici, che spesso sono indeterminati, limitando l'uso di model...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)	Pintobar, Portugal		Poultry farm
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)	Interaves, Portugal		Bird farm
15 mL PP centrifuge tubes	Corning	430052
50 mL PP centrifuge tubes	Corning	430290
60 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 48
Metal grid	Goodfellows		fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter	Millipore	DTTP01300	0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm	Sigma-Aldrich	P5112
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)			from supermarket
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)			from supermarket
Transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S	2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette	Normax	5426015
Clear plastic tape			from supermarket
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5	BMA Biomedicals	T-1302
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific		Standart FBS
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P-3292	Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	10010023
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit	ELKEM/Silmid	RH141001KG	To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08	Curved scissors
Insect pins	Fine Science Tools	26001-30	0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula	Fine Science Tools	10087-12	Transplantation spoon
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Skimmer
Wecker Eye Scissor	Fine Science Tools	15010-11
Camera	Leica Microsystems	MC170 HD
Microscope	Leica Microsystems	DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner	Hamamatsu Photonics	C13220-01
Stereoscope	Leica Microsystems	Leica M80