Gavage를 사용 하 여 신생아 쥐에 있는 Probiotic 연구

요약

이 연구는 gavaging 정확한 양의 신생아 쥐에 probiotics의 과정을 자세히 설명합니다. 실험 설정 포함 하도록 최적화 되었다 하지만 probiotic 주입, 관리의 방법 및 내장에 있는 박테리아의 정량화에 국한 되지 않습니다.

초록

인 간에 있는 질병의 진행 뒤에 메커니즘을 이해 하 성인 마우스 모델 널리 사용 되었습니다. 신생아 질병에 성인 마우스 모델에서 연구의 적용은 제한 됩니다. 더 잘 이해 하려면 질병의 진행, 호스트 응답 및 신생아의 개입의 장기적인 영향, 신생아 마우스 모델 가능성이 더 나은 적합 이다. 신생아 마우스 모델의 스파스 사용 부분에 이러한 작은 동물 들과 함께 작업의 기술적인 어려움을 지정할 수 있습니다. 신생아 마우스 모델 초기 생활에 probiotic 관리의 효과 결정 하 고 특히 신생아 마우스 창 자에 식민지를 설정 하는 기능을 평가 하기 위해 개발 되었다. 특히, 신생아 마우스에 probiotic 식민 평가, 유산 균 plantarum (LP) 신생아 마우스 위장에 직접 전달 했다. 이 위해, LP는 마우스 내 식도 (IE) gavage 통해 먹이로 관리 되었다. 높은 재현 방법 외상, 신생아 쥐의 취약성을 주어진 특히 중요 한 측면을 최소화 하면서 probiotic 약물의 정확한 관리를 허용 하는 IE gavage의 과정을 표준화 하기 위해 개발 되었다. 이 과정의 포함 가능성 식도 자극 또는 손상 및 포부의 경우 gavaged 잘못. 이 방법은 원심 식도로 IE gavage 포부의 기회를 줄일 수 있기 때문에 현재의 관행에 개선을 나타냅니다. Gavage, 따라는 probiotic의 식민 프로필 LP 특정 뇌관으로 추출 된 장 DNA의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)를 사용 하 여 추적 했다. 다른 쓰레기 설정 및 케이지 관리 기술 식민지 확산에 대 한 잠재력을 평가 하기 위해 사용 되었다. 프로토콜 IE 신생아 마우스 gavage 및 LP와 후속 식민 정량화의 복잡 한 세부.

서문

유아, 초 probiotic 노출 연결 되었습니다 immunomodulatory 효과 선도 necrotizing enterocolitis, 아 토 피 성 피부염 및 패 혈 증^1,2,3, 같은 질병의 발생률이 감소 하 ^{4 , 그러나 5}.,이 immunomodulatory 응답 뒤에 메커니즘은 도전 탐험 신생아 인체 실험 (순차 혈액 그립니다 및 생 검)에 샘플링에 한계를 주어진. 신생아 마우스 모델 장 microbiota에 변화와 probiotic 사용과 관련 된 신생아 면역 조절에 관련 된 행동의 메커니즘을 연구 수 있습니다. 불행히도, probiotics에 대 한 대부분의 마우스 모델 대부분에 초점을 맞춘 성인 쥐; 그러나, probiotics의 영향 가장 일찍 인생에서이 연령 그룹에 대 한 특정 모델은 유용한^3,6될 것입니다 제안 될 것입니다. 또한, 신생아 마우스 모델은 더 나은 질병 및 개입으로 그들은 더 밀접 하 게 모방 개발 면역 및 미생물 시스템^{7,8 것으로 예상 된다 인간 유아의 초기 생활에 응용 프로그램을 위한 연구에 적합 ,,910}. 목표 범위와 호스트와 그 미생물 간의 기계적 상호 작용에 초점을 맞춘 신생아 쥐의 probiotic 식민의 패턴을 공부 했다. 신생아 모델의 적합 한 묘사는 문학에서 찾지 못한 고 따라서 강력 하 고 표준화 된 방법의 개발에 대 한 필요성이 제시 되었다.

신생아 쥐에 다양 한 화합물의 구강 관리의 설립된 방법 임신 댐¹¹ 물 소스를 치료 하거나 관리를 촉진 하기 위하여 먹이 바늘을 사용 하 여 우유를 통해 원하는 화합물의 모성 전송 포함 oropharynx¹²로 원하는 화합물. 이러한 메서드는 정확한 복용량 요구 되어 있지 않은 및 치료 받는 사람 마우스에 의해 섭취 쉽게 실험을 위해 유용 합니다. Probiotics는 종종 함께 prebiotic galactooligosaccharide 및 fructooligosaccharide (FOS) probiotic 박테리아;에 대 한 영양의 근원으로 봉사 하는 등 관리 이러한 첨가물 화합물 점성 및 위에서 언급 한 방법론을 통해 관리 도전 솔루션을 확인 합니다. 초기 생활 (DOL)의 첫 날은 필요한 시작 하는 신생아 쥐에 probiotics 및 prebiotics의 정확한 금액을 관리 하는 방법 고안 (치료 제어 팔^13,14,,1516사이 다른 probiotic 연구 관찰)로 gavage 기법, 식민 확산의 가능성을 개발 하는 과정 테스트 식민지 유산 균 plantarum (LP) 다른 gavage 일정과 새끼의 창 자에서의 관계 되는 풍부를 평가 했다. LP (ATCC 202195 스트레인), 최근 인간의 재판³에 설명 된 대로 포 (prebiotic)과 maltodextrin (첨가제)와 혼합의 gavage 당 10⁹ 콜로 니 형성 단위 (CFU)는 실험에 사용 되는 probiotic 준비에 의하여 이루어져 있었다. Probiotic 배달 IE gavage를 사용 하 여 달성 되었다와 프로세스 프로토콜 아래에 상세한. probiotic의 식민 프로필 LP 특정 뇌관을 사용 하 여 전체 창에서 추출 된 DNA의 실시간 확대를 사용 하 여 평가 되었습니다.

프로토콜

동물 케어 시설 브리티시 컬럼비아의 대학에 지원 담당자에 의해 설립 지침에 관한 모든 절차 실행 되었다 및 모든 절차 UBC 동물 관리 위원회에 의해 승인 했다.

1. 관리 하는 probiotics의 정량화

참고:이 단계 probiotic 단 하나의 복용량에서 관리 될 수 있는 CFU의 정확한 금액을 결정 하는 것이 좋습니다. Probiotics 및 차량 (FOS maltodextrin)의 수량 솔루션의 포화 상태를 결정 합니다. 큰 볼륨 증가 위험 포부의 경험에서 더 이상 30 µ L (kg 당 ~ 20 mL) 액체의 돌 2에 마우스 시행 수 있습니다.

1. 살 균 5% 포도 당 염 분의 180 µ L을 포함 하는 각 관으로 직렬 희석 6 1.5 mL microcentrifuge 튜브 준비.
2. 무게는 probiotic prebiotic 혼합물의 약 0.2 g 수 살 균 방식으로 5% 포도 당 식 염 수의 1 mL에서 녹 이십시오.
3. 한 30 초 피펫으로 덩어리를 소용돌이. 볼 수 없는 수 풀은 관찰 될 때까지 반복 합니다.
   참고: Maltodextrin 솔루션 점성 만들고 솔루션 채도에 기여 합니다.
4. 직렬 희석 단계 1.1에서에서 준비 하는 튜브를 사용 하 여 수행 합니다. 소용돌이를 섞어입니다.
5. 부인 한 천 판의 이라는 사분면에 모든 희석의 40 µ L 플레이트. 중복에서 각 희석 접시
6. 아래 혐 기성 품 어 (또는 microaerophilic) 37 ° C에서 가스 팩을 사용 하 여 진공 항아리에 48 h에 대 한 조건.
7. 사분면 당 20-70 식민지의 범위 내에서 각 접시를 계산 합니다. 평균 접시 같은 희석으로 계산 하 고 원하는 단위를 다시 계산할.

2. gavage probiotics 및 prebiotics의 준비

참고: 적절 한 해체 probiotic의 고 prebiotic gavage 동안 먹이 바늘을 통해 액체의 원활한 주입을 보장 하기 위하여 필요한 이다.

1. Prebiotics 그리고 차량 살 균 microcentrifuge 튜브에 원하는 양의 동결 건조 된 probiotic 생물체의 필요한 금액을 결합 합니다.
2. Probiotic prebiotic 혼합물을 분해 하는 용 매 (5% 포도 당 염 분)의 적절 한 금액을 추가 합니다.
   참고: 해산의 용량 제한은 prebiotic와 사용 하는 차량입니다. 경험에서 포와 (maltodextrin)와 synbiotic 조합 1 mL의 용 매를 사용 하 여 2 mL microcentrifuge 튜브에 해산 하는 동안 약 0.3 g/mL에서 채도 도달 했습니다.
3. 모든 고체 해산 때까지 혼합 소용돌이입니다. 아래로 pipetting으로 용 매에 고체 입자의 소 헤어를 피펫으로 사용 합니다.
4. 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 솔루션을 품 어.
   참고: probiotic prebiotic 솔루션 라이브 문화에서 만든 경우이 단계를 생략 될 수 있습니다.
5. 5 시리즈 접시 gavage는 probiotic을 정확 하 게 계량 하기 전에 부인 한 접시에 10 희석이 강아지를 관리. 정확한 CFU 수 필요 하지 않은 경우이 단계를 생략 수 있습니다.

3입니다. biosafety 캐비닛의 준비

1. 무 균 기술을 유지 하는 biosafety 내각 probiotics를 작업할 때 사용 합니다. 댐 및 난방 담요 (약 38 ℃로 설정)에 강아지 케이지 하나에 설정 담요의 절반. 난방 담요의 나머지 절반에 깨끗 하 고 빈 동물 케이지를 놓습니다.
2. 소독 또는 멸 균, 흡수 성 패드 gavage 동안 마우스 경향이 난방 담요에 장소.
3. 기존, 댐 만든 둥지 위에서 새끼에 대 한 중첩 자료를 수집 하 고 장갑 낀된 손, 70% 에탄올을 사용 하 여 소독 하 고 건조를 사용 하 여 새로운 원뿔 중첩 컵을 만들. 깨끗 하 고 빈 들고 장에이 새로운 둥지를 배치 합니다. 이 gloved 손 둥지의 향기의 전송을 용이 하 게 하 고 따라서 cannibalization의 위험 감소 절차에 대 한 그들을 처리 하는 동안 강아지에 다른 향기의 도입을 최소화 합니다.
4. 케이지를 들고 원뿔 둥지에 새끼를 이동 하 고 캐비닛에서 댐 케이지를 제거 합니다. 이 절차 동안 새끼를 청문회에서 그것을 방지 하 여 댐에 대 한 스트레스를 줄인다.
   참고:는 probiotic murine 내장의 알려진된 식민지 개척자 인 경우 치료 조건 구분 되어야 합니다 감 금 소 또는 심지어 다른 biosafety 캐비닛을 교차 하는 식민지의 가능성을 피하기 위해.

4. 내 식도 gavage 신생아 마우스의

1. 쉬운 접근을 위한 주사기 포장을 엽니다. 살 균 방식으로 바늘의 포장을 열고 주사기의 머리에 그것을 연결 합니다. 70% 에탄올과 절차 전에 압력솥 바늘을 씻어. 치료 및 제어 그룹에 대 한 바늘의 다른 세트를 사용 하 여 오염을 방지.
2. 주사기에 probiotic 염료 솔루션의 원하는 금액 보다 좀 더 그립니다. 잡고 위로 향하도록 주사기. 그런 다음 풀 다운 추가 하 고 거품을 꺼내 려 하 고 원하는 볼륨에 도달할 때까지 거품과 여분의 액체 볼륨을 추방 하는 플런저에 밀어 손가락으로 끄 적. 그러면 바늘에 공기 공간이 있다. 돌 2 마우스, gavage의 볼륨 30 µ L 넘지 합니다.
3. 살 균 흡수 성 패드가 열 패드 상단에 강아지를 두십시오. 사용 하 여 먹이 바늘 (24 게이지, 1"바늘 길이, 1.25 m m 볼 지름) 외부에서 바로 칼 프로세스 (흉 골의 아래쪽 끝) 아래 바늘의 공을 배치 하 여 식도의 길이 측정. (그림 1) 바늘의 삽입의 제한 주의 주 둥이의 수준에서 바늘을 표시 합니다. 정기적인 호흡 및 피부 핑크 채색을 포함 하는 건강 신호에 대 한 강아지를 관찰 합니다.
4. 디 핑 용 매 (5% 포도 당 식 염 수 또는-매체는 probiotic을 분해 하는 데 사용 하 고 미리 biotic)에서 바늘의 팁을 찍어 먹이 바늘의 외부 표면에 기름칠을. 이 마우스의 식도에 바늘의 부드러운 항목을 지원합니다.
5. 강아지 아저씨 또는 부드럽게 잡고 엄지와 검지 손가락 사이 몸과 머리를 들어 올립니다. 머리, 목 고 몸 직선 위치에서 개최 됩니다. 보유 하지 않습니다 강아지에 대 한 아저씨에 의해 60 이상 거기 s는 질 식으로 이어지는 기도의 방해의 위험. 강아지 쉴 수 있는지 확인 합니다. Scruffing 너무 하드의 징후는 호흡 하는 무 능력, 중대 한 헐 떡 거리 고 혀는 입 밖으로 확장을 포함할 수 있습니다. 강아지의 색상 및 전체 절차 동안 호흡을 모니터링 합니다.
6. 그것은 목 구멍의 뒤쪽에 도달할 때까지 몸통의 평면에 45 ° 각도로 강아지의 입의 중앙에 바늘의 전구를 삽입 합니다.
7. 부드럽게 선회 바늘의 전구에 의해 바늘의 각도 변경 하 고 주사기를 이동 때까지 (강아지의 등 쪽 측)으로 gavaging 사람에서 멀리는 강아지의 척추 칼럼의 평면에 평행한. Scruffing 강아지 목 구멍 뒤쪽 자리에 바늘을 유지 하는 데 도움이 또한 몸 놀 림에서 마우스를 방지 한다. 바늘의 공 사전 하거나 각도 변경 하는 동안 목 구멍의 뒤쪽에 대 한 어떤 압력을 발휘 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
8. 마우스는 바늘을 삼 키 지 하려고, 그것은 자연스럽 게 아래쪽으로 슬라이드 하 고 주 둥이 바늘에 마킹 정렬 때 움직임을 체포 허용. 주사기 및 바늘은 일반적으로 충분히 기한 아래로 슬라이드 무거운 중력. 바늘의 무게에 항상 그래서 바늘은 gavage을 수행 하는 사람에서 더 하향 압력으로 식도 아래로 쉽게 슬라이드를 지원.
   1. 바늘 목 구멍 뒤쪽 저항을 충족 하는 경우 바늘과 다시 각도의 공을 꺼내 약간 gavage 바늘 작은, 1 mm 단위로 천천히 (처리기의 오른쪽) 마우스의 왼쪽을 향해 입 안으로 바늘을 철회 한다. 바늘은 쉽게 식도 아래로 슬라이드를 시작 한다.
   2. 바늘 바늘에 마킹 입에 도달 하기 전에 중지 하는 경우 솔루션을 주사 하지 마십시오.
   3. 20 개 이상에 대 한 삽입 바늘을 유지 하지 않는 s. 이 경우, 주사기 몸통에 평행 하 게 유지 하면서 천천히 바늘을 철회 하 고 30 종이 수건에 나머지 강아지 용 매와 바늘의 외부 표면 윤 활 후 다시 1 분 시도 gavaging s.
      참고: 마 취 사용 되지 않습니다 절차에 대 한 마우스의 응답 gavage의 성공을 측정 하는 데 필요한 만큼.
9. 때 먹이 바늘에 표시 주 둥이 위에 고 주 둥이 끝에 정렬, 이동 또는 더 이상 어떤 사전 바늘 게 하지 마십시오. 천천히 원하는 양의 액체를 주사. 액체 발음은 코를 통해 거품을 경우 즉시 주입을 중지 하 고 천천히 바늘을 철회.
   1. 강아지의 복구에 도움이 열 패드에 종이 타월에 똑바로 놓습니다. 지속적인된 호흡 문제에 대 한 밀접 하 게 모니터링 하거나 포부를 나타내는 강아지의 색상에서을 변경 합니다. 즉시 발음가지고 강아지 안락사
10. gavage 완료 되 면, 부드럽게 삽입 된 같은 각도로 먹이 바늘을 철회 한다. 따뜻하게 난방 패드에 종이 타월에 강아지를 두십시오. 정상적인 활동 및 호흡 패턴을 회복 하는 강아지에 대 한 대기 10 s. 강아지의 몸에 건강 한 분홍색 색조 표시 그리고 염료만 표시 되어야 위 구획에. 다시 다른 강아지와 새 장으로 이동 합니다.
    참고: Gavaging 블루 식용 색소는 위에서 설명한 절차를 연습 하는 우수한 방법. gavage 성공 하면 마우스의 위 블루 색상으로 표시 됩니다. 파란색 염료 (목, 가슴이 나 겨드랑이 지역) 강아지의 위장에 밖으로 발견 되 면 동물 해야 될 고통 없이 안락사 (동물 보호 규칙)에 따라이 식도 또는 포부의 파열을 나타냅니다.

5. 식민 분석을 위한 intestional 샘플의 수집

1. 후속 모니터링 또는 gavaging, 동안 새끼에서 지저분한 미생물 샘플을 수집 합니다.
   참고: 강아지 자주 urinates defecates 때 gavaged 그리고이 이번 미생물 분석을 위한 분 변 샘플을 수집 하는 기회로 사용할 수 있습니다.
2. 실험의 종료에 대 한 내장에서에서 수집 십이지 장 직장에 새끼의 안락사 후. 외과 보드에 강아지를 고정 하 고 70% 에탄올으로 피부를 소독. 70% 에탄올와 250 ° c.에 뜨거운 비드 살 균 소독 도구를 사용 하 여 복 층을 손상 하지 않고 4 개의 사분면으로 피부를 버려야
3. 살 균 도구의 다른 세트를 사용 하 여 4 개의 사분면으로 복을 잘라내어 내장 장기 노출 되는 방식에서 중심에서 이동.
4. 위장을 찾아서 pyloric 괄약근 아래와 직장의 끝을 꼬집어을 클램프를 사용 하 여. 소장을 간소화 하 고 mesenteric 조직과 결합 조직에서 그것을 해방 하는 무딘 도구 또는 집게를 사용 하 여 내장의 길이 실행 합니다. 일단 내장의 전체 길이 결합 조직, 클램핑 된 끝에 컷의 해제 되었습니다.
5. 표시 된 소장 방향 알루미늄 호 일, 안전한 방법으로 포장 및-80 ° c.에 동결
   참고: DNA 추출 절차는이 시점에서 동결 없이 밖으로 수행할 수 있습니다. 파란색 염료는 24 시간 이상 대 장 통과 보였다 또한 및 컬렉션 샘플의 창 자는 적어도 24 시간 수집 하는 때 식민 분석은 최고의 게시물 마지막 gavage. 뚜렷이 gavage 혼합물을 통과 하는 비-준수 박테리아에 의해 그 timepoint 전에 신호를 증폭 될 수도 있습니다.

6. DNA 추출 식민지 분석 창에서

참고: DNA 추출 이루어집니다 내장 DNA 추출에 대 한 프로토콜 수정 최적화와 상업 키트를 사용 하 여. 난방 장치 원하는 온도를 설정 하 고 솔루션을 변경 또는 미리 온난화 필요 적절 하 게 준비를 확인 합니다.

1. 효소 세포의 용 해 버퍼 (ELB)를 다음과 같이 준비: 20 mM Tris Cl, 2mm 나트륨 EDTA와 1.2% 솔루션 트라이 톤 X-100. PH 8.0에 조정 합니다. ELB를 사용 하기 전에 즉시 lysozyme 20 mg/mL의 최종 농도에 추가 합니다.
2. 미리 제거 모자 분석 균형에 가닛 비드 튜브 무게.
   참고:이 이루어집니다 있도록 필요한 무게 지나쳐 갔다 면 쉽게 장 내용을 제거 하.
3. 멸 균 일회용 메스를 사용 하 여 작은 세그먼트로 창 고 미리 무게 가닛 비드 튜브로 원하는 세그먼트를 특 종.
   참고: 각 샘플 사이의 scalpels DNA 유비 쿼터 스 하 고 PCR 결과 영향을 미칠 수 변경 해야 합니다.
4. 각 관 (에서 단계 6.1) lysozyme와 ELB의 1 mL를 추가 vortexing 구슬 때리는에 놓고 5 분 동안 최대 설정 (14)에서 실행 합니다.
5. 일단 조직 중단 37 ° C 물 목욕 튜브를 전송 하 고 30 분 동안 품 어.
   참고:이 단계 lysozyme 활성화 하 고 그람 양성 세균의 세포 벽 peptidoglycan의 붕괴를 유도 하기 위해 수행 됩니다.
6. ML 당 600 mAU의 농도에서 모든 샘플에 대 한 가수분해 K의 20 µ L 튜브를 준비 합니다.
7. 10 분 동안 400 x g 에서 튜브를 원심. lysate 구슬 위에 일부 조직 잔류물 명확 보일 것입니다.
8. 가수분해 K를 포함 하는 관으로 상쾌한 (상위 단계)의 180 µ L를 전송 하 고 튜브를 알 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 15 대 한 소용돌이를 섞어 s.
9. 10 분 동안 56 ° C에서 난방 블록에 튜브를 놓습니다.
10. 튜브를 100% 에탄올의 200 µ L를 추가 하 고 혼합 15 vortexing s.
11. (Kit)에서 스핀 열 lysate의 약 600 µ L를 추가 합니다.
12. 8000 x g에서 1 분간 원심 분리기. 통해 삭제 합니다.
13. 6.12 단계를 반복 하 여 모든 lysate 그려 왔다 열을 통해.
14. 새로운 컬렉션 튜브에 열을 배치 합니다. 1 분 동안 8000 x g 에서 AW1 버퍼 및 원심 분리기의 500 µ L를 추가 합니다.
15. 삭제를 통해 흐름. 8000 x g 3 분 동안에 500 µ L AW2 버퍼와 원심 분리기를 추가 합니다.
16. 통해 흐름을 무시 하 고 원심 8000 x g 3 분에 빈 컬렉션 튜브에 열.
17. DNA 차입 튜브에 열을 전송. 막에 직접 PCR 학년 초순의 60 µ L을 추가 하 고 실 온에서 2 분 동안 품 어.
18. 37 ° C에 미리 데워 차입 물을 사용 하 여 elute. 차입 절반 최종 차입 볼륨을 사용 하 여 두 번 수행할 수 있습니다 그리고 6.15 수확량 증가를 두 번 단계 반복.
19. 8000 x g elute DNA에서 1 분간 원심 분리기.
20. 원하는 정량화 방법을 사용 하 여 eluted DNA의 농도 측정 합니다. 추출 공정 수율 10-40 ng / µ L DNA의 범위에 있습니다.
21. -20 ° c.에 eluted DNA 저장

7. 정량 설정

1. PCR 조건
   1. 컴퓨터를 켜고 실시간 정량 Pcr 기계에 표 1 에 프로그램을 로드.
   2. 40 주기 위한 표 1 에 3 ~ 5 단계를 반복 하 고 반응의 끝에 4 ° C에서 샘플을 잡고.
2. PCR 실험 설치
   1. 사용 하 여 뇌관 및 온도 표 2에서 발견. 사용 하 여 농도 및 반응 조건 표 3에서 발견. 절차 상의 변화에 대 한 제어를 3 중에 각 반응을 설정 합니다.
3. 정량 시스템 및 프로그램 단계의 7.1 시스템에 로드 하는 실행에 PCR 반응 튜브/접시를 놓습니다.
4. 실행의 끝에 튜브 제거, 4 ° C에 그것을 배치 하 고 젤 로드에 대 한 준비.

8입니다. LP 식민의 정량화

1. 10 µ L 또는 표3 20 µ L 반응에 대 한 정량 믹스를 준비 합니다.
2. LP genomic DNA 표준 곡선 10⁷ 10¹ 복사본 / µ L를
   참고: 각 희석의 4 µ L 도금 될 것입니다, 이후 4 µ L에 10⁷ 복사본 또는 2.5 µ L 당 10⁶ 부 x 필요 시작 재고 합니다. 동일한 원리를 사용 하 여 커브의 나머지 부분에 대 한.
   1. 1:4 희석 준비: 50 µ L µ L 당 10⁷ 부.
      LPDNA + dH₂O의 46.85 µ L의 3.147 µ L = 2.5 µ L 당 10⁶ 복사본 x
   2. 직렬로 10 배 희석: 5 µ L 45 µ L dH₂O 10⁵ 복사본 / µ L x 1.25에 대 한 추가.
   3. 잘 당 희석 당 4 µ L 플레이트.
3. LP amplicons의 시각화
   1. 2 %agarose 젤을 사용 하 여 명확한 분리를 도달 하는 ~ 197 bp lp로 증폭된 한 파편.
   2. 젤에 PCR 제품 각의 9 µ L을 로드 합니다.
   3. 120 V에서 30 분간 젤을 실행 합니다.

결과

이 방법의 크기를 gavaging 기술의 그것의 적응 및 신생아 마우스의 나 약함에 달려있다. 이전 섹션 돌 2 마우스에서 성공적인 gavage 절차 수행에 중요 한 단계를 설명 합니다. 좋은 부 량 규모를 설정 하려면 표준 곡선 3 기술 복제 (그림 2)와 순수한 LP DNA를 사용 하 여 생성 되었습니다. 표준 곡선 뇌관을 사용 하 여 lp로 DNA의 탐지의 동적 범위를 제공 합니다. 동적 범위는 7, 28 주기 사이 어디에 10의 범위¹ LP DNA의 10⁷ 복사본을 감지 되었습니다. 표준 곡선의 꾸준한 사면 효율성 및 확장성 반응의 표현.

IE gavage의 절차는 상대적으로 쉽게 성인 쥐에 사용 되었습니다. 그러나, 신생아 마우스의 상부 위 장관 깨지기 이며 절차 동안 바늘 필요한 보정된 움직임은 gavage의. 반복된 gavages 처리로 인해 댐 내 식도 염증, 부상 및 실패 또는 거부의 가능성을 증가할 수 있었다. 따라서, 두 개의 서로 다른 gavaging 일정 테스트 하 고 창 자 식민지 전체 내장 homogenates에서 DNA를 사용 하 여 계량 했다. 쥐 돌 2-돌 8에서에서 gavaged probiotic 매일 또는 매 2 일 (그림 3)을 관리 했다. 각 샘플 포함 한 기술 복제 하 고 모든 조건을 두 개 이상 생물 복제 했다. Gavaged 새끼 7 복용량과 매일 gavaged 새끼 4 복용량과 매 2 일 약 10⁵ 복사본을 했다 반면 LP의 약 10³ 복사본을 했다. 복제 사이 결과의 일관성 기술의 정밀도에 신용을 추가 합니다. 더 많은 LP 이었던 gavaged 매일 강아지에 비해 매 2 일 새끼 gavaged의 창 자에서 발견 했다. 이 감안할 때 후속 실험 설정 했다 매일 gavage 일정 또한 강아지에 대 한 스트레스를 줄일 수 있습니다.

내 쓰레기 probiotic을 방지 하는 것이 중요 하다 probiotics 작업할 때 오염 교차. Littermates 미생물 같은 어머니와 중첩 환경 공유로 유사한 것으로 예상 되었다. 이 경우 치료 및 제어 조건 같은 쓰레기 내의 probiotic 유기 체는 microbiota의 일부가 될 가능성이 있다 probiotic 연구에 대 한 문제를 증명 ("식민 확산 '). 확인 하는 probiotic 것입니다 오염 치료 littermates 식민지, 쓰레기의 절반 이상으로 gavaged 고 창 정량에 대 한 수집. 돌 10 쥐의 장 정량 분석 비 gavaged littermates (그림 4)에서 낮은 학위를, 뿐만 아니라 gavaged 마우스에 lp로 DNA의 예상된 확대를 보여주었다. 치료 케이지에서 동일한 돌 생쥐의 창 자가 증폭 또는 사이클에서 최소한의 증폭 32 보다 큰 했다. 이 쓰레기 장에 내 미생물의 공동 공유에 대 한 증거 제공. 따라서, probiotics와 실험에 대 한 치료 그룹 교차 오염의 통해 변화에 대 한 제어를 연습장으로 분리 되어야 한다. 양 댐의 사용은 실험 내에서 설정 되어야 하는 경우 쓰레기 설정 하지만 효과 혼동 양 댐에서 저하 치료 좋아하고 거부 해야 평가 하 고 최적화 된 여겨질 수 있다. 마우스 gavaged 돌 8 남아 때까지 6 일 동안 치료 하 고 돌 14 장 DNA 분석은, LP의 대략 10의 사본 (그림 5) 발견 되었다. 따라서, LP의 식민 과도 발견 했다 하 고 시간이 지남에 감지 인구 감소.

그림 1 . 칼 프로세스 (흉 골의 아래쪽 끝)와 최대 삽입 바늘에 대 한 표시를 하도록 주 둥이 길이 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . Lp로 뇌관과 ATCC LP DNA를 사용 하 여 표준 곡선. 연구에 사용 하는 뇌관에 대 한 동적 감지 범위 설정 ATCC LP DNA의 직렬 희석이 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 . 매일 (7 회)와 매일 (4 회) 돌 10 새끼에서 장 DNA의 lp로 확대 예정된 gavages에 돌 2와 돌 8 사이 치료. Gavaging 매일 gavaging에 비해 더 높은 장의 LP 매일 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 . 2 처리와 2 돌 10 새끼에서 장 DNA의 LP 확대 4 강아지의 담가에서 치료. gavage 했다 돌 2와 돌 8 사이 예정 된 gavages에서 매일 (7 회). 두 probiotic 새끼 표시 예상된 증폭 프로 파일 취급. 치료 되지 않는 강아지 쓰레기 내 probiotic 유기 체의 공동 공유 나타내는 LP의 가변 증폭을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 . 매일 (7 회)와 매일 (4 회) 돌 14 강아지에서 장 DNA의 lp로 확대 예정된 gavages에 돌 2와 돌 8 사이 치료. 6 일에 걸쳐 LP의 주기 28 나타내는 허가 아래 LP 부하 방울 마지막 probiotic gavage 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단계	온도	시간
1	50 ° C	2 분
2	95 ° C	3 분
3	95 ° C	30 초
4	58 ° C	30 초
5	72 ° C	30 초

표 1. 정량 Pcr 증폭 조건. 온도 및 PCR 반응에 대 한 주기 조건의 수입니다.

대상	16S-23S intergenic 공백 지역
예상된 조각 크기	144 혈압
뇌관 Tm	58˚C
앞으로 뇌관 (FP)	Lpn-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT
반전 뇌관 (RP)	Lpn-2: TGT TCT CGG TTT 고양이 문신 GAA AAA ATA

표 2입니다. 정량 Pcr 반응의 구성 요소 세부 정보. 뇌관의 어 닐 링 온도 PCR 반응에 예상된 조각 크기에 세부 사항.

	농도	10 µ L 반응	20 µ L 반응
템플릿 DNA	200 pg / µ l	1 Μ L	1 Μ L
SYBR 마스터 믹스	-	5 Μ L	10 Μ L
FP	10 Μ M	0.3 Μ L	0.6 Μ L
RP	10 Μ M	0.3 Μ L	0.6 Μ L
dH2O	-	3.4 Μ L	8.8 Μ L

테이블 3입니다. 반응 볼륨 및 농도 당. 시 약 및 반응에 대 한 볼륨의 농도입니다.

토론

IE gavage의 절차는 안전 하 게 신생아 쥐에 있는 probiotic의 특정 복용량을 관리 하 개발 되었다. 액체의 소량 먹이 바늘을 사용 하 여 자신감 있는 복용량의 납품을 보장 하면서 포부를 방지 하기 위해 상부 위 장관에 전달 됩니다. 쥐의 창 자를 식민지 분석 2에 대 한 수집 및 6 일 게시물 gavage. DNA 추출에 대 한 절차는 probiotic 그람 양성 유기 체의 높은 수익률을 보장 하기 위해 수정 되었습니다. DNA의 정량 분석 추출 2 일 게시물 마지막 gavage 보여 상대적으로 높은 식민지 LP의 쥐 gavaged에 gavaged 마우스에 비해 2 일 마다 돌 2-8 사이의 매일. 또한 있었다 LP의 감소 6 일 동안 마우스의 장내에 변이 유기 체 것이 probiotic을 보여주는. 이러한 실험의 결과 높은 경직이 연령 그룹에서 함께 연구를 수행 하는 조건을 설정 합니다.

신생아 쥐에 probiotics의 장기 효과 관찰, 그것은 돌 2; 신생아 쥐에 투여 유사한 시작 시간 인간의 재판을 가리킵니다. Oropharyngeal 신생아 쥐의 문학에서 설명한 유와 실시 되었습니다만 돌 5-8^12,17 후 포부의 위험 때문에 잘된 삼 키는 역학 낮은 경우. 그러나, oropharyngeal 먹이 아니다 적합 돌 2 마우스에 대 한 포부의 파일럿 연구 (데이터 표시 되지 않음)에서 관찰 되었다. Probiotic 및 포부의 위험에 추가 prebiotic 솔루션의 점성 자연. IE gavaging 절차에 따라 위의 위장 지 대에 직접 원하는 볼륨을 제공 하면서 돌 2 마우스에 포부의 위험 최소화. 절차의 성공 처음 probiotic gavage을 주입 하는 식용 색소를 사용 하 여 검증 되었다. 식용 색소는 강아지의 피부를 통해 표시 되는 마커 역할을 합니다. 부정적 관찰 되었다 쥐에 gavaged와 식용 색소, 그리고 대규모 실험을 시작 하기 전에 이러한 방식 gavaging 절차의 유효성을 검사 하는 것이 좋습니다. 허 걱 반사 본된 게시물 gavage의 빠른 해상도 성공적인 gavage에 대 한 추가 표시기로 사용할 수 있습니다. 마우스 난방 담요에 배치 되 면 사후 gavage, 허 걱 반사 가시고 것입니다 하 고 호흡 주파수에 증가 20 초 이내에 관찰 될 것 이다. 30 초 이상 허 걱 반사의 연속 실패 gavage를 나타냅니다. 또한 성공적인 gavage는 먹이 바늘의 적절 한 삽입에 바로 위장의 심장 괄약근의 개통 위에 앉아 전구와 따라 다릅니다. 이 gavage 동안 칼 프로세스와 주 둥이의 끝 사이 길이 측정 하는 바늘에 표시는 마우스의 주 둥이 지난 이동 하지 않습니다 하 여 촉진 수 있습니다. 이 마우스에 부상의 위험을 최소화합니다. Gavage의 주파수는 실험 결과에 큰 영향을 가질 수 있습니다. 잦은 gavaging 또한 강아지와 장과 둥지의 지속적인 섭 동 때문에 어머니에 대 한 더 많은 스트레스를 만들 수 있습니다. 가장 최적의 gavage 일정 이며는 gavages는 적어도 자주 시간의 짧은 기간 동안 시스템에서 기대 효과 잃지 않고. 안전 및 절차의 불 임은 gavage 되도록 바늘 세척 및 압력가 마로 소독 사이 사용에 의해 살 균 해야 합니다. 스크럽과 여 물 압력가 마로 소독이 필요 하기 전에 주사기를 사용 하 여 바늘을 통해 어떤 남은 입자 내부 압력가 마로 소독 하는 동안 바늘에 encrust 수 있는 gavaging 절차를 방해할 수 있습니다 외부 사용에 엄격 하 게 세척.

다른 모든 gavaged 했다 새끼에서 높은 LP 식민 관찰 되었다 매일 새끼 gavaged에 비해 하루. 매일 그리고 잠재적으로이 새끼에 의해 섭취 상대적으로 더 많은 우유를 통해 더 많은 영양분을 받고 probiotic이 새끼 gavaged에 감소 된 스트레스로 인해 수 있습니다. Probiotic 치료 복용량 의존 이전 마우스 모델^18,19 에서 공부 하고있다 고 따라서 정확한 복용량의 관리는 중요 하다. 준비 하는 probiotic 솔루션 관리 CFU의 정확한 수를 얻으려면 모든 gavage 전에 도금입니다. Probiotic 유기 체 혐 기성 이면 그것은 차이 CFU aerobically 또는 anaerobically를 경작 하는 때에 인지 확인 하는 것이 중요입니다. LP facultative 혐 기성 이므로, 그것은 두 가지 방법 모두를 사용 하 여 경작 되었다 고 CFU에 차이가 관찰 했다.

게시물 gavage 장의 LP 부하 분석 수행은 높은 품질과 정량 DNA 샘플을 사용 하 여. 치료 및 제어 그룹 사이 LP DNA 오염을 최소화 하기 위해 다른 바늘, 먹이 biosafety 캐비닛 및 수술 장비 사용 되었다 최고 품질 샘플을 보장 하기 위해. 소장에 probiotic의 정확한 측정에 최적화 된 DNA 추출 방법이 필요합니다. 자에서 DNA 추출에 대 한 가장 효율적인 방법을 여러 구슬을 단계^20,,2122구타를 포함 한다. 이 메서드는 구슬 구타를 사용 하 여 창 자 박테리아의 추출에 대 한 채택 하 고 감소 표현을 관찰 (< 10² 복사본 복구) 전체 내장 DNA 추출에 LP의. LP는 세포 벽에서 peptidoglycan의 상당한 금액을 그램 양성 유기 체, peptidoglycan 해체 단계 lysozyme^23,24 효소 세포의 용 해 버퍼를 추가 사용 하 여 프로토콜 최적화 했다. 이 두 배 이상으로 동일한 장 샘플에 LP의 표현을 증가. Lysozyme 치료 단계를 치고 구슬 생물의 세포를 용이 하 게 하는 동안 외부 층의 해산을 보장 합니다. 조직의 금액의 최적화, 가닛 구슬의 유형 및 중단 비즈를 사용 하 여 기간 최적의 DNA 제품 PCR 분석을 얻기 위해 필요 하다.

예방 또는 치료 사전 용어 및 용어 신생아에서 시행 하는 probiotics의 긍정적인 영향 최근 연구^25,26,,2728에서 입증 됩니다. Probiotics에 대 한 적절 한 신생아 마우스 모델의 설립 probiotics의 보호 효과 풀고 보증 된다. 여기에 설명 된이 프로토콜 신생아 마우스 작업 probiotics를 사용 하 여 익숙하지 않은 연구자에 대 한 가이드를 나타냅니다. 인간의 건강과 질병을 공부 하는 동안 설치류 microbiota와 문제에도 불구 하 고이 메서드는 probiotics 인해 미생물의 변화를 이해에 초점을 맞춘 연구를 확장할 수 있습니다. 이 모델은 또한 다른 발달 단계에 걸쳐 호스트 미생물 상호 작용 및 면역 응답을 공부 하는 플랫폼을 제공 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe with slip tip	BD	309659
1.2% Triton X-100	Millipore-Sigma	X100-100ML
2 mM sodium EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
20 mM Tris·Cl	Thermo Fisher Scientific	15568025
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution	Baxter Corp.	JB1064
Alphaimager	Alpha Innotech	N/A	Gel imaging system
Anaerobic jar	Millipore-Sigma	28029-1EA-F	2.5 L
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets	BD	260678
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	288130
Disruptor Genie	Scientific Industries Inc.	SI-D236
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats	Cadence Science Inc.	01-290-1	24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter
Fructooligosaccharides	Millipore-Sigma	F8052	from chicory
Garnet bead tubes 0.70 mm	Qiagen	13123-50
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	172-5120
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al.	ATCC	BAA-793	for qPCR standard curve
Lyophilized probiotic bacteria	N/A	N/A
Lysozyme	Thermo Fisher Scientific	89833
Maltodextrin	Millipore-Sigma	419672	dextrose equivalent 4.0-7.0
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	1704406	Gel chamber
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	N/A
QIAamp Blood and Tissue kit	Qiagen	51504
StepOnePlus Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376600
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Ultrapure dH2O	Invitrogen	10977023