Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea

Resumen

Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades metastásicas humanas.

Resumen

Los pacientes con cáncer tienen mal pronóstico cuando la afectación del ganglio linfático (LN) está presente tanto en el carcinoma de células uroteliales de alto grado (HG-UCC) de la vejiga y el cáncer colorrectal (CRC). Más del 50% de los pacientes con UCC invasiva muscular, a pesar de la terapia curativa para la enfermedad clínicamente localizada, desarrollarán metástasis y morirán dentro de 5 años, y la CRC metastásica es una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Se necesitan modelos de xenoinjerto que imitan constantemente la metástasis UCC y CRC que se observado en los pacientes. Este estudio tiene como objetivo generar modelos de xenoinjerto ortotópico (PDOX) derivados del paciente de UCC y CRC para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales LN imitando la progresión de enfermedades metastásicas humanas para la detección de fármacos. Se obtuvieron tumores frescos de UCC y CRC de pacientes consentidos sometidos a resección de HG-UCC y adenocarcinoma colorrectal, respectivamente. Co-inoculada con células HK analógicas de células estromales LN (LNSC), células UCC etiquetadas con luciferasa se inculcaron intravesically (IB) en ratones femeninos de inmunodeficiencia combinada diabética/grave (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones en ratones diabéticos no obesos/graves combinados de inmunodeficiencia (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones en ratones diabéticos no obesos/graves combinados de inmunodeficiencia (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones en ratones femeninos de inmunodeficiencia diabética no obesa/combinada grave (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intrarectalmente (IR) en ratones femeninos de inmunodeficiencia diabética no obesa/combinada grave (NOD/SCID), y las células CRC se inyectaron intra ratones macho NOD/SCID. El crecimiento tumoral y la metástasis se monitorizaron semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI). Tras el sacrificio, se cosecharon, pesaron y fijaron la formalina para la hematoxilina y la eosina y la inmunohistoquímica. En nuestros modelos pDOX únicos, los tumores de xenoinjerto se asemejan a los tumores preimplantacionales del paciente. En presencia de células HK, ambos modelos tienen altas tasas de implantación tumoral medidas por pesos DE BLI y tumorales, 83,3% para UCC y 96,9% para CRC, y altas tasas de metástasis de órganos distantes (33,3% detectada metástasis hepática o pulmonar para UCC y 53,1% para CRC). Además, ambos modelos tienen una mortalidad cero por el procedimiento. Hemos establecido modelos PDOX únicos y reproducibles para HG-UCC y CRC humanos, que permiten la formación de tumores, el crecimiento y los estudios de metástasis. Con estos modelos, las pruebas de nuevos fármacos terapéuticos se pueden realizar de manera eficiente y clínicamente mimética.

Introducción

Se ha demostrado que la metástasis de los ganglios linfáticos (LN) es un indicador de pronóstico deficiente en muchas neoplasias malignas de órganos sólidos, incluido el carcinoma de células uroteliales (UCC) de alto grado de la vejiga y el cáncer colorrectal (CRC)^1,2. Más de la mitad de los pacientes con UCC invasiva muscular (MIUCC), a pesar de la terapia curativa para la enfermedad clínicamente localizada, desarrollarán metástasis y morirán en un plazo de 5 años. La CRC metastásica es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos.

Se estima que en 2018 se producirán 81.190 nuevos pacientes y 17.240 muertes específicas por cáncer en 2018 en los Estados Unidos debido a la UCC de la vejiga^3,4. Mientras que los pacientes predominantemente (70%) presente con enfermedad invasiva no muscular, 30% tendrá MIUCC⁵. A pesar de la terapia curativa (cistectomía radical [RC] con o sin quimioterapia sistémica) para la enfermedad clínicamente localizada, la mitad de los pacientes con MIUCC de la vejiga seguirán desarrollando metástasis y morirán dentro de los 5 años^3. La afectación de los ganglios linfáticos se encuentra en aproximadamente el 20% al 25% de los pacientes que han sufrido RC^6,7,8. La tasa de supervivencia a cinco años en pacientes con LN positivo es inferior al 35% incluso después de RC, lo que sugiere la afectación de LN como un predictor negativo crucial para el pronóstico en pacientes con UCC.

El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común diagnosticado tanto en hombres como en mujeres en los Estados Unidos. Los resultados del paciente dependen en gran medida de las características tumorales y del microambiente tumoral, como la profundidad de invasión, la afectación del LN y las metástasis de órganos distantes. Aunque la tasa de mortalidad en la CRC disminuyó en la última década debido a la detección y cirugíasefectivas, se estima que casi el 50% de los pacientes con CRC desarrollarán metástasis o enfermedad recurrente 9.

Los modelos animales pequeños proporcionan una plataforma expeditiva, reproducible y modificable para estudiar la progresión tumoral y diferentes patrones metastásicos. Actualmente no hay modelos de xenoinjertos descritos que imitan consistentemente la metástasis CRC y UCC que se ve en los pacientes. La principal vía de la metástasis distante del cáncer es a través de la diseción linfática. Nuevas investigaciones sugieren que los LN proporcionan a los tumores un microambiente único, y no sólo son objetivos estacionarios donde las células cancerosas pasan transitoriamente, sino que también juegan un papel integral al interactuar con las células cancerosas en el proceso metastásico. De hecho, nuestros estudios descubrieron que, además de educar y promover la progresión tumoral y las metástasis, el microambiente estromales LN también es responsable de la resistencia a los fármacos en CRC^10,11. Nuestro laboratorio confirmó recientemente los efectos tumorígenos de las células estromales LN (LNSC) en CRC y UCC utilizando modelos de ratón de xenoinjerto ortotópico (PDOX) derivados del paciente^12,13.

El desarrollo de modelos PDOX proporciona una plataforma importante para la investigación traslacional del cáncer^14,15. Al mantener las principales características histológicas y genéticas de su tumor donante, los modelos PDOX se mantienen estables a través de pasajes y hacen buenas plataformas para la investigación traslacional del cáncer^12,15. Los modelos de DODO se utilizan para la evaluación preclínica de fármacos, la identificación de biomarcadores y la evaluación preclínica de estrategias de medicina personalizada que permiten la predicción de los resultados clínicos. Actualmente, no hay modelos de xenoinjerto descritos que consideren la importancia de la afectación del LN y sean capaces de reproducir consistentemente el tumor primario y la metástasis de órganos distantes en CRC y UCC. En este estudio, describimos el desarrollo de modelos PDOX en ratones NOD/SCID con reproducción de enfermedades metastásicas CRC y UCC con afectación lNSC.

Protocolo

Todos los métodos descritos en estos estudios en animales se llevaron a cabo bajo las directrices aprobadas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Sistema de Salud de Ochsner y de acuerdo con las directrices de investigación en animales. Todos los tumores de pacientes para este estudio fueron recogidos de pacientes consentidos sometidos a cirugías de resección de cáncer de acuerdo con la Junta de Revisión de Investigación del Sistema de Salud de Ochsner y las normas éticas del Comité Institucional de Experimentación. Los patólogos certificados por la Junta en el Sistema de Salud de Ochsner determinaron los diagnósticos patológicos de las muestras de pacientes en función de las características microscópicas de las células tumorales, su tipo histológico y el nivel de grado.

NOTA: El siguiente protocolo describe los pasos para dos modelos de xenoinjerto separados, un modelo DE UCC a través de la electrocauterización de la pared de la vejiga para inculcar células UCC y una inyección intrarectal de células CRC para su estudio en un modelo CRC. Todos los pasos que se preparan y supervisan los experimentos son idénticos para ambos modelos, mientras que las secciones 7 y 8 describen específicamente el procedimiento para la insinversión UCC y la inyección de CRC, respectivamente.

1. Culatar líneas celulares

1. Cultivar células DE Hk en medio completo de RPMI-1640 suplementado con suero bovino 10% fetal, 2 nM de glutamina, 100 U/ml de penicilina G y 100 mg/ml de estreptomicina a 37oC en una incubadora humidificada de 5% CO 2.
   NOTA: Las células HK son células dendríticas foliculares humanas normales y se pueden cultivar y ampliar para 15 pasajes in vitro^16.
2. Para prepararse para un experimento, intente las células.
   1. Retire los medios y agregue 2 ml de 1% de trippsina en la solución salina equilibrada (HBSS) de Hank a las células. Vuelva a colocar las células en la incubadora humidificada 5% CO₂ a 37 oC durante 4 min.
   2. Recoja las células del plato en un tubo de 15 ml con una ayuda de pipeta de mano con un pipeta serológico de 10 ml unido. Añadir 8 mL de medio RPMI-1640 completo.
   3. Combine 40 s de células y 40 l de trippan azul en un solo pozo de una placa de 96 pocillos. Añadir 10 ml de mezcla a un hemocitómetro y contar las células vivas. Agregue 1 millón de células en un medio RPMI-1640 completo de 25 ml a un plato tratado con cultivo de tejido estéril de 150 mm para continuar cultivando las células.
      NOTA: La suspensión de células HK preparada en este paso debe utilizarse dentro de una hora para mezclarse con células tumorales para inyección.

2. Recolección de muestras de pacientes

1. Recoger los tumores UCC del paciente consentido 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) y 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) en la cirugía de resección.
2. Recoger tumores CRC del paciente consentido 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) y 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) en la cirugía de resección.

3. Expansión del tumor del paciente

1. Recoger tumores en cirugía en frío medio estéril de McCoy que contiene penicilina G (500 U/ml) y estreptomicina (500 mg/ml).
2. Implante tumores directamente en el flanco izquierdo y derecho de los ratones NOD/SCID hembra sin semanas de 6 a 8 semanas.
   1. Mecánicamente picar los tejidos en trozos pequeños (1 mm³) utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas.
   2. Implante de tejido por vía subcutánea en el flanco izquierdo y derecho utilizando agujas de biopsia de aspiración de médula ósea de 13 G.
      NOTA: Implante un volumen total de 8 mm³ dividido uniformemente a ambos lados del flanco.

4. Etiquetado y enriquecimiento de tumores etiquetados con luciferasa

1. Mida el crecimiento del tumor cada dos semanas con una pinza digital.
2. A 1 cm de diámetro, tumor transducto. Inyectar directamente en el tumor con una sola dosis de Luc/proteína fluorescente roja (RFP)-lentivirus (50 l/tumor, dilución 1:30 a partir de un bote concentrado de lentivirus de alta titer) utilizando una jeringa de 1 cc con una aguja de 27 G.
   NOTA: El tumor del paciente normalmente alcanza 1 cm de diámetro en 1 x 2 meses. Sin embargo, la tasa de crecimiento es extremadamente variable y se basa en una serie de factores, incluyendo el grado y el tipo de tumor.
3. Supervise el tumor semanalmente mediante imágenes bioluminiscentes (BLI) en animales vivos.
   1. Pesa los ratones. Inyectar ratón consciente con 150 mg/kg de luciferina por vía intraperitoneal y esperar 5 minutos para que el sustrato circule en el cuerpo del ratón.
   2. Anestetizar el ratón con 2,5% de isoflurano en 100% de oxígeno, 1 L/min en una cámara de inducción.
   3. Coloque el ratón sobre el estómago en una máquina de imágenes BLI con el flujo de isoflurano y la imagen. Tome imágenes secuenciales para confirmar la presencia de regiones tumorales positivas Luc/RFP (imagen bioluminiscente de color falso). Devuelva el ratón a la jaula después de que se complete la toma de imágenes.

5. Seleccione la porción apropiada del tumor para la digestión enzimática

1. El día del procedimiento UCC o CRC, el ratón de la imagen con la luciferasa etiqueta el tumor como en los pasos 4.3.1-4.3.3.
   NOTA: El tiempo para que el tumor subcutáneo crezca depende de la velocidad de crecimiento del tumor y del número planificado de animales que se inyectarán en el experimento.
2. Cosecha el tumor del flanco del ratón y la imagen.
   1. Euthanizar el ratón por inhalación de CO₂ después de la toma de imágenes. Coloque el ratón en la cámara de CO2, encienda el gas a 1,4 L/min hasta que se detenga la vía respiratoria y déjelo encendido durante 3 minutos.
   2. Limpie la piel con 70% de etanol. Piel de tienda directamente sobre el tumor. Con tijeras quirúrgicas hacer una pequeña incisión en la piel. Separe la piel del tumor con tijeras.
   3. Retire el tumor y colóquelo en un petri-dish estéril. Imagen de todo el plato en una máquina de imágenes.
3. Utilice tijeras estériles o bisturí para separar las secciones negativas de luciferasa de las secciones positivas de luciferasa en el tumor y volver a crear una imagen.
4. Repita hasta que solo queden la mayoría de las piezas tumorales altamente positivas.

6. Digestión enzimática del tumor

1. Bajo la campana de flujo laminar, mince luciferasa piezas tumorales positivas (paso 5.4) en las piezas más pequeñas posibles utilizando tijeras quirúrgicas estériles y ponerlas en un tubo cónico estéril de 50 ml.
   NOTA: La picadura del tumor en las piezas más pequeñas posibles producirá más células individuales.
2. Preparar la solución digestiva añadiendo 10 ml de colagenasa IV (1,5 mg/ml), 80 ml de hialuronidasa (20 mg/ml) y 160 ml de desoxirribonuclea I (0,1 mg/ml) a 40 ml de HBSS. Mezclar la solución invirtiendo.
3. Añadir 35 a 40 ml de la solución digestiva al tumor picado. Incubar a 37oC con rotación continua durante 2 h.
   NOTA: Agitar vigorosamente el tubo periódicamente durante la incubación para evitar que el tejido tumoral se agrupe.
4. Filtrar toda la digestión a través de un colador celular estéril de 100 m seguido de un colador de células de 40 m para eliminar los desechos. Guarde el flujo y deseche los desechos.
5. Lave las células libres añadiendo 20 ml de HBSS y centrífuga a 329 x g durante 5 min. Apiratee el sobrenadante y resuspende el pellet en 30 ml de HBSS.
6. Combine 10 ml de solución celular y 90 ml de trippan azul en un solo pozo de una placa de 96 pocillos. Cuente las células vivas usando un hemacitómetro.
7. Transfiera 1 x 10⁴ a 1 x 10⁶ células tumorales por ratón a un tubo cónico estéril de 15 ml. Agregue 3 x 10⁵ células HK del paso 1.2.3 por ratón, al mismo tubo con células tumorales.
   NOTA: Utilice un tubo cónico estéril de 50 ml si el volumen total supera los 15 ml. Calcule siempre más dosis para animales adicionales por grupo de estudio para tener en cuenta la pérdida de líquido durante el uso de la jeringa. Por ejemplo, si un grupo contiene 5 ratones, haga suficientes células para 6 o 7 ratones.
8. Centrífuga a 329 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante ya sea aspirando o pipeteando.
9. Resuspenda las celdas en 50 s por ratón para el modelo UCC o 10 s por ratón para el modelo CRC en medios RPMI completos. Mantenga la suspensión celular sobre hielo hasta que esté lista para su uso.

7. Modelo de ratón UCC

1. Preparación de ratones para el procedimiento
   1. Obtenga un ratón NOD/SCID femenino de seis a ocho semanas de edad. Afeitar la parte inferior de la espalda del ratón usando crema de depilación. Anestetizar el ratón en una cámara de inducción con isoflurano (2,5% en 100% de oxígeno, 1 L/min).
   2. Una vez sedado, coloque el ratón en posición supina con su hocido en un cono de nariz de isoflurano y la espalda desnuda firmemente puesta a tierra sobre un electrodo dispersivo.
      NOTA: El ratón está completamente sedado si no responde al pellizco del dedo del pecho.
2. Inculcar células UCC preparadas en el paso 6.9 a la vejiga usando un angiocatéter (Figura1Aa, Ab).
   1. Configure una máquina de electrocauterización monopolar y ajuste a una potencia de 4 W. Lubricar un angiocatéter estéril de 24 G con gelatina lubricante e insertara a través de la uretra del ratón hembra.
      NOTA: Se puede sentir una ligera resistencia. Empuje suavemente hacia adelante o retire el angiocatéter y repita. No fuerces. Si el catéter se dobla al entrar, inserte un cable guía estéril (ver 7.2.2) hasta la mitad del catéter para proporcionar estabilidad.
   2. Inserte completamente el cable guía recto de núcleo fijo de 0.025" 1 mm más allá del extremo del angiocatéter.
      NOTA: El cable está marcado con cinta adhesiva antes del procedimiento para indicar el punto de parada de 1 mm y asegurar la consistencia.
   3. Sujete el pasador monopolar al cable guía durante 1 s permitiendo la irritación eléctrica de la mucosa de la vejiga.
   4. Fije un angiocatéter estéril fresco a la jeringa de 1 cc de luer-lok y extraiga 200 ml de células recogidas del paso 6.9.
      NOTA: Se pierden al menos 100 ml del angiocatéter en la jeringa. Compensar el volumen de pérdida al calcular el volumen de la suspensión de la célula necesaria.
   5. Retire el alambre guía y el angiocatéter de la uretra del ratón. Inserte el angiocatéter con la jeringa de las células unidas a la uretra.
      NOTA: El avance debe ser más fácil que antes.
   6. Inculcar 50 s de células a la vejiga del ratón. Espere unos segundos antes de extraer el angiocatéter para permitir que las células se adhieran a la pared de la vejiga.
      NOTA: Las células permanecen en la vejiga y se convierten en un tumor primario.
3. Retire el ratón del cono de la nariz de isoflurano y de la almohadilla de puesta a tierra. Observe el ratón durante 1 h el siguiente procedimiento. Busque signos de angustia, es decir, espalda encorvada, respiración trabajada, etc.

8. Modelo de ratón CRC

1. Anestetizar de seis a ocho semanas de edad ratón NOD/SCID con isoflurano (2,5% en 100% oxígeno, 1 L/min) en la cámara de inducción. Confirme la sedación con un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del sol.
2. Coloque el ratón anestesiado en posición supina bajo un microscopio de disección, asegurándose de fijar su hocico a una nosecona de isoflurano y asegurar sus extremidades delanteras con cinta adhesiva para mayor estabilidad.
   NOTA: Se pueden utilizar las ledas en lugar de un microscopio de disección. Un objeto pequeño se puede utilizar para mejorar la visibilidad y el ángulo cuando se coloca debajo de la base de la cola, elevando el ano. Típicamente, pequeñas secciones de gasa se enrollan en una forma de cilindro de 1 pulgada de diámetro.
3. Dilatar el canal anal con fórceps con puntas romas lubricadas curvadas para exponer la mucosa anal y rectal distal. Retire las heces.
4. Utilice una aguja estéril extraíble de 30 G en una jeringa de vidrio de 50 ml para inyectar 10 ml de células tumorales y de HK (del paso 6.9) en la submucosa rectal distal de 1 a 2 mm por encima del canal anal. El bisel de la aguja debe estar cubierto por la mucosa. Tenga cuidado de no pasar a la cavidad pélvica.
5. Retire el ratón del cono de la nariz de isoflurano. Observe el ratón durante 1 h el siguiente procedimiento. Busque signos de angustia, es decir, espalda encorvada, respiración trabajada, etc.

9. Imágenes bioluminiscentes

1. Supervise semanalmente la carga metastásica primaria del tumor, el hígado y los pulmones utilizando un sistema de imágenes bioluminiscente para la actividad de la luciferasa.
   1. Obtenga un ratón de UCC o CRC experimento y pese. Inyectar 150 mg/kg de luciferina por vía intraperitoneal y esperar 5 minutos a que el sustrato circule en el cuerpo del ratón.
   2. Ratón anestetiza con 2,5% de isoflurano en 100% de oxígeno, 1 L/min en la cámara de inducción.
   3. Coloque el ratón en la máquina BLI Imaging con la nariz fijada en nosecone. Al exponer la imagen, asegúrese de que el área de interés esté orientada hacia la cámara. Para la inyección UCC y CRC, el lado ventral debe estar frente a la cámara para cada imagen. Ratón de imagen en posición supina.

10. Recolectordes órganos y tumores

1. Cuando el resplandor de luminiscencia tumoral primaria alcanza 1 x 10¹¹ fotones o si los ratones presentan signos de angustia (es decir, pérdida de peso, encorvado, respiración dura/trabajada, etc.), eutanasia ratones por inhalación de CO₂ (como en el paso 5.2.1) después de la luciferina inyección e imágenes de todo el cuerpo.
2. Retire el hígado y el pulmón, colóquelo en una placa de petri y la imagen para identificar cualquier metástasis. Retire el tumor, pese e imagen. Fijar órganos y tumores en una formalina tamponada neutra al 10% durante 48 h a temperatura ambiente.
   NOTA: Limpie/limpie las tijeras y los fórceps entre cada órgano para evitar la transferencia de tejido.

11. Evaluación histológica

1. Incruste los tejidos fijos de formalina en la parafina y corte los tejidos a 5 m de espesor en un microtome para la hematoxilina y la eosina (H&E) y la tinción inmunohistoquímica (IHC).
   NOTA: Todas las manchas de H&E de diapositivas de parafina se realizaron en el laboratorio de patología del sistema de salud Ochsner, y toda la tinción de IHC en este artículo se realizó en un laboratorio de investigación de Ochsner Health System después de la recuperación de antígenos a alta temperatura usando Ki67 y anticuerpos de citoqueratina 20, seguidos de anticuerpos secundarios biotinylados, y complejos de aviina-biotina-peroxidasa según las instrucciones del fabricante^13,17.

Resultados

En el modelo DE DOP UCC, las células BlCaPt15 o BlCaPt37 de los pacientes UCC fueron inculcadas intravesicamente (IB) en presencia de células HK en la vejiga de ratón NOD/SCID femenina (Figura1A). Veinticinco de los treinta (83,3%) los animales generaron tumores primarios y mostraron un crecimiento de tumores primarios dependientes del tiempo basado en BLI semanal (Figura1B,C y Tabla1). Del mi...

Discusión

La enfermedad metastásica es responsable de la mayoría de las muertes de pacientes con cáncer. En las pruebas terapéuticas preclínicas, es crucial establecer modelos de ratón que emulen más de cerca el crecimiento tumoral humano con metástasis espontáneas de órganos distantes. El uso de modelos murinos con células cancerosas derivadas de tumores de pacientes implantados (xenoinjertos) permite una mejor comprensión de la biología tumoral y biomarcadores predictivos, así como pruebas y predicción de los efec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avidin-biotin-peroxidase	Vector Labs Inc	PK-6100
Biotinylated secondary antibody	Vector Labs Inc	BA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL)	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)	Sigma	D4263
D-Luciferin (150 mg/kg)	Perkin Elmer	122796
Formalin (10% neutral buffered)	Leica	46129
glutamine (2 nM)	Fisher Scientific	35050061
Hair Removal Cream	Church & Dwight Co., Inc	1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	SH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL)	Sigma	H3884
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	108333
Luc/RFP-lentivirus	From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s medium	Life Technologies	110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL)	Fisher Scientific	15140-122
RPMI-1640 Medium	American Type Culture Collection	110636
Trypan Blue	Sigma	T6146
Trypsin/EDTA	Life Technologies	15400-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Gas
100% Oxygen	Airgas Inc	OX USP200
100% CO2	Airgas Inc	CD USPE
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male)	Jackson Lab	001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female)	Jackson Lab	001303
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemistry
Hematoxylin	Sigma	GHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody	Thermo Scientific	RM-9106-S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools
40 µm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-1
100 µm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-19
15 mL Conical Tube	Sarstedt	11799
50 mL Conical tube	Sarstedt	15762
150 mm Tissue Culture Dish	USA Scientific Inc	CC7682-3614
96 Well plate	USA Scientific Inc	CC7682-7596
Forceps	Symmetry Surgical Inc	06-0011
Surgical scissors	Symmetry Surgical Inc	02-2011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5% CO2 humidified incubator	Thermo Scientific	3110
Bioluminescent (BLI) Imaging Machine	Perkin Elmer	CLS136334
BLI Imaging Machine Software	Perkin Elmer	CLS136334
Centrifuge	Beckman	366830
Deconvoluting Microscope	Intelligent Imaging Innovations	Marianas
Deconvoluting Microscope Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations	+1 (303) 607-9429 x1
Digital caliper	Fowler Tools and Instruments	54-115-330
Dissecting microscope	Precision Instruments LLC	(504) 228-0076
Electrosurgical generator	ValleyLab	FORCE1C20
Isoflurane Induction Chamber	Perkin Elmer	119038
Microtome	American Optical Corporation	829
Pipet Aid	Fisher Healthcare	13-681-15E
Serological pipet (10 mL)	Sarstedt	86.1254.001