Messung des biophysikalischen und psychologischen Stressniveaus nach der Visitation an drei Orten mit unterschiedlichen Naturniveaus

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Papiers ist es, Veränderungen des Stressniveaus nach der Visitation in drei verschiedenen Einstellungen zu identifizieren und die Methoden zu beschreiben, die bei der Identifizierung von Stressniveaus auf der Grundlage von Messungen von Speicheldrüsenkortisol, Amylase und einem psychologischen Selbstbericht verwendet werden. instrument.

Zusammenfassung

Der Besuch in der natürlichen Umgebung wurde mit der Verringerung des psychischen Stresses in Verbindung gebracht. Obwohl sich die meisten stressbezogenen Forschungsarbeiten auf Selbstberichtsformate stützten, werden in einer wachsenden Zahl von Studien inzwischen biologische stressbedingte Hormone und Katalysatoren, wie Cortisol und A-Amylase, zur Messung von Stressniveaus eingesetzt. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um die Auswirkungen auf biophysikalische und psychische Belastungen nach einer Visitation an drei verschiedenen Orten mit unterschiedlichen Naturniveaus zu untersuchen. Biophysikalische und selbst gemeldete psychische Belastungen werden unmittelbar beim Betreten der ausgewählten Orte und kurz vor dem Verlassen der Website gemessen. Mit Hilfe einer "Drool"-Methode besteht die biophysikalische Maßnahme aus 1-2 ml Speichelproben, die von Studienpersonen bei Eintritt in einen von drei Studienorten zur Verfügung gestellt werden. Wie in der vorhandenen Literatur vorgeschrieben, wird der Speichel innerhalb von 45 Minuten nach dem Ende des Engagements des Besuchers am Ort gesammelt. Nach der Speichelentnahme werden die Proben beschriftet und in ein biologisches Labor transportiert. Cortisol ist die biophysikalische Variable, die für diese Studie von Interesse ist und mit einem ELISA-Verfahren mit einem TECAN-Plattenleser gemessen wird. Um selbst gemeldeten Stress zu messen, gibt es den Perceived Stress Questionnaire (PSQ), der Sorgen, Spannung, Freude und wahrgenommene Anforderungen meldet. Die Daten werden am späten Nachmittag bis zum frühen Abend an allen drei Standorten erhoben. Im Vergleich zu allen drei Einstellungen sind die Spannungsniveaus, gemessen sowohl an den biologischen Markern als auch an den Selbstanzeigen, nach der Visitation in der natürlichsten Umgebung deutlich niedriger.

Einleitung

Erhöhte Stressniveaus sind seit langem mit vielen schweren gesundheitlichen Bedingungen wie Herzerkrankungen, Fettleibigkeit, und psychische Störungen^1,2,3verbunden. Eine wachsende Zahl von Forschungsergebnissen legt nahe, dass die Nähe oder Die Besichtigung von natürlichen Umgebungen wie Park und nicht entwickelten Landschaften einen bemerkenswerten Einfluss auf das psychische Wohlbefinden und den verringerten Stresspegel haben kann^{1,4, 5,6,7,8,9,10}. Erläuterungen zu den Auswirkungen natürlicher Einstellungen und Stressniveaus sind folgende: (1) natürliche Umgebungen bieten Orte für körperliche Aktivität^8,11 und (2) Besucher in natürlichen Umgebungen haben die Fähigkeit, sich zu konzentrieren auf mehr nicht-task-Denkprozesse, was zu einer Verringerung der Aufmerksamkeitermüdung¹²führt. Um die Auswirkungen der Natur auf die Stressreduktion zu bestimmen, nutzt diese Studie eine Selbstanzeige von psychischem Stress (PSQ) und zwei Speichel-basierten Biomarkern, Cortisol und Amylase, nach der Visitation an drei verschiedenen Erholungsstätten. Diese Orte variieren je nach "Natürlichkeit" und umfassen eine Wildniskulisse, einen Stadtpark und eine lokale Fitness- und Erholungseinrichtung.

Diese Studie zielt darauf ab, die folgenden Forschungsfragen zu behandeln: (RQ₁) Gibt es Unterschiede in den Ebenen des biophysikalischen Stresses, gemessen durch Speicheldrüsenkortisol und Amylase im Vergleich zu allen drei Standorten (d. h. natürlich, halbnatürlich, gebaut)? (RQ₂) Gibt es Unterschiede in den Niveaus der psychischen Belastung, die durch den PSQ gemessen werden (manifestiert durch vier Konstrukte: Forderungen, Sorgen, Spannung und Freude), wenn man sie an allen drei Standorten vergleicht (d.h. natürlich, halbnatürlich, gebaut)?

Protokoll

Diese Studie folgt den Richtlinien und Richtlinien des Human Research Protection Program des Indiana University Institutional Review Board.

1. Standortauswahl

1. Wählen Sie die Anzahl der Standorte (n) basierend auf verschiedenen Naturebenen aus.
   HINWEIS: Wir haben drei Standorte für unsere Arbeit ausgewählt. Mit einem Kontinuum, das auf dem Niveau der "Natürlichkeit" basiert, wurde Site A als das natürlichste angesehen und besteht aus etwa 1.200 Hektar bewaldeten Bergrücken, die an einen See grenzen und in einem Laubwald liegen. Zu den häufigsten Aktivitäten gehören Wandern und Wildtierbeobachtung. Der Standort B war ein 33 Hektar großer Stadtpark mit Wanderwegen, Versammlungsmöglichkeiten, Spielplätzen und Freiflächen für kausale Freizeitaktivitäten. Standort C war eine städtische Indoor-Übungsanlage mit dem niedrigsten Grad an Natürlichkeit. Alle drei Standorte befinden sich in relativ unmittelbarer Nähe zu einer mittelgroßen Stadt (schätzungsweise 46.000 Einwohner) im mittleren Westen der Vereinigten Staaten.

2. Teilnehmer-Screening und Vorbereitung

1. Komplette Rekrutierung von Teilnehmern, bevor die Probanden Freizeiterlebnisse machen.
   HINWEIS: Für die Standorte A und B wurden die Probanden vom Forscher auf dem Parkplatz des Parkeingangs angesprochen. Für Standort C wurden die Probanden an der Rezeption der Indoor-Übungsanlage angesprochen. Um Unterschiede in der Aktivitätsart zu kontrollieren, wanderten die für die beiden Standorte A und B rekrutierten Probanden überwiegend, während für Standort C die Hauptaktivität das Laufen oder Gehen auf der Indoor-Strecke war.
2. Erinnern Sie die Probanden bei der Rekrutierung daran, die Richtlinien für das Sammeln von Speicheldrüsenkortisolproben einzuhalten. Sie dürfen vor der Bereitstellung von Speichelproben nicht 10 min essen oder trinken.
   ANMERKUNG: Es sei darauf hingewiesen, dass in diesem Fall die Speichelproben nicht für Volumen oder Verdünnung (Konzentration) normalisiert wurden , d. h. ob die Teilnehmer ausreichend hydratisiert waren und/oder sich zwischen den Probensammlungen veränderten.
3. Geben Sie jedem Teilnehmer rote Armbänder (oder entsprechend auffällige Kleidung), um eine einfache Identifizierung zu ermöglichen, wenn sie am Ende ihrer Verlobungen auftauchen.
4. Weisen Sie eine 30-40 min Zeitzuteilung zu, sodass alle Probanden an den drei Standorten eine ähnliche Zeit an jedem Standort verbringen. Ausschließen von Probanden, die wesentlich mehr oder weniger Zeit als der Rest der Stichprobe aufwenden.
5. Halten Sie die Art der Aktivität konsistent.
   HINWEIS: In diesem Fall war die "mittlere" Aktivität Wandern oder Wandern. Personen, die sich wesentlich von Wander- oder Wanderaktivitäten unterscheiden, wurden von der Stichprobe ausgeschlossen. Zum Beispiel wurden Probanden, die fischen, picknickten oder Gewichtheben waren, nicht in den jeweiligen Proben enthalten.

3. Bedingungen und experimentelles Design

1. Verwenden Sie ein quasi-experimentelles Pre-Test/Post-Test-Design.
2. Nach der Identifizierung der Probanden und nach ihrer Zustimmung zur Teilnahme bitten Sie jeden Probanden, ein IRB-Formular zu lesen und zu unterzeichnen, in dem die Freiwilligkeit, der Zweck und die Verfahren der Studie erläutert werden.
3. Geben Sie den Probanden im Anschluss an diesen Prozess ein Kleidungsstück (z. B. rote Armbinde) zur zukünftigen Identifizierung und erhalten Sie physiologische und psychologische Messungen des Stressniveaus (z. B. PSQ, 1-2 ml Speichel, der in ein Reagenzglas gespuckt oder in ein Reagenzglas gegleitet wird). Sammeln Sie Proben vom späten Nachmittag bis zum frühen Abend.
   HINWEIS: Diese Daten wurden von den Forschern sowohl 1) kurz vor dem Betreten der Website und 2) unmittelbar nach Beendigung der Visitation auf der Website gesammelt.

4. Speichelproben

1. Um eine Verdünnung der Probe zu vermeiden, bitten Sie die Probanden, die Münder 10 min nicht zu essen, zu trinken oder zu spülen, bevor Sie Speichelproben abgeben.
2. Bitten Sie die Probanden, 1-2 ml Speichelproben (ohne Schaum) kurz vor dem Freizeiterlebnis und unmittelbar nach Abschluss der Erfahrung zur Verfügung zu stellen.
3. Sammeln Sie Speichelproben mit einer passiven Drool-Methode:
   1. Geben Sie Probanden mit einem 2 in Kunststoff Trinkhalm, um in einem 2 ml Kryovial drool (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Weisen Sie die Probanden an, Speichel in ihren Mündern zu bündeln, dann den Strohhalm hinunter und in den Kryovial zu drool. Gemäß der Saliva Collection and Handling Advice (2011) sind 1 ml (ohne Schaumstoff) für die meisten Tests geeignet.
   3. Etikettenproben mit einer zugewiesenen 3-stelligen ID-Nummer (d. h. 001) und einem Buchstaben zur Angabe des Zeitpunkts der Datenerfassung (d. h. A steht für Vorprüfung, B für Nachprüfung; wobei 001A die Speichelprobe darstellt, die von Teilnehmer 001 vor der Durchführung der Freizeiterlebnis).
   4. Nachdem die Probe gesammelt und gekennzeichnet ist, sollte es dann vorübergehend gefroren in einer Steroid-Schaum-Box voller Trockeneis für nicht mehr als 2 h gelagert werden.
   5. Transportieren Sie die markierten Proben in ein Labor und lagern Sie sie bei -80 °C, bis sie analysiert werden.

5. Quantifizierung der Amylase

ANMERKUNG: In diesem Test hydrolysiert die Amylase 2-Chlor-p-Nitrophenyl--D-Maltotriosid zu 2-Chlor-Nitrophenol und bildet Glukose, 2-Chlor-p-Nitrophenyl--D-Maltoside, Maltotriose und Glukose. Die Reaktion wird mit einer Absorption von 405 nm überwacht, was der Aktivität von '-Amylase in der Probe entspricht. Dieser Test zeigt Dielinearität zwischen 0 und 2000 U/L.

1. Materialien
   1. Verwendet ein flüssiges Amylase-Reagenz-Set (siehe Materialtabelle), um die Amylase in Speichelproben zu quantifizieren. Alle Reagenzien werden als gebrauchsfertige Flüssigkeiten zur Verfügung gestellt und bei 0-4 °C gelagert.
   2. Verwenden Sie einen Multimode-Reader (siehe Materialtabelle), der eine optische Dichte bei 405 nm mit einer Temperatur von 37 °C während des Asses ablesen kann.
2. analyse
   1. Die Proben vor der Analyse auf Eis auftauen.
   2. Proben 1:10 mit 1x PBS verdünnen (10 l Speichel + 90 l PBS).
   3. Analysieren Sie jedes Beispiel in doppelter Ausführung.
   4. Das Amylase-Reagenz mindestens 30 min auf 20-25 °C ausdemieren.
   5. Fügen Sie 0,1 ml Amylase-Reagenz zu einer 96-Well-Mikroplatte für jede Probe hinzu.
   6. Die Mikroplatte bei 37 °C für mindestens 5 min vorinkubieren.
   7. Fügen Sie dem Amylase-Reagenz 2,5 l der Probe hinzu.
   8. Nehmen Sie eine erste Lesung nach 60 s.
   9. Fahren Sie alle 60 s für weitere 2 min. fort.
   10. Berechnen Sie die mittlere Absorptionsdifferenz pro Minute (Abs/min).
3. berechnung
   1. Um die Amylaseaktivität zu berechnen, verwenden Sie die folgende Formel:
      
      Wobei Abs/min = Veränderungen der Absorptionsdifferenz pro Minute; TV = Gesamttestvolumen (0,1025 ml); *1000 = Umwandlung von U/ml in U/L; MMA = millimolare Absorptivität von 2-Chlor-p-Nitrophenol = 12,9; SV = Probenvolumen (0,0025 ml); und LP = Lichtweg (1 cm). Die Substitution ergibt:
      
      Multiplizieren Sie daher die Abs/min mit dem Verdünnungsfaktor (10) mit 3178x, um Amylase in U/L zu erhalten.
   2. Bei Proben über 2000 U/L (Assay-Linearität) weiter verdünnen (mindestens 2x mit PBS) und Re-Assay, dann multiplizieren Sie das Ergebnis von '-Amylase mit dem zusätzlichen Verdünnungsfaktor.

6. Quantifizierung von Cortisol

HINWEIS: Bei diesem Test wird freies Cortisol im Speichel mit einer Cortisol-Standardkurve quantifiziert. Normen und verdünnte Proben werden einer Mikrotiterplatte zugesetzt, die mit einem Antikörper vorbeschichtet ist. Den Brunnen wird ein Cortisol-Peroxidase-Konjugat zugesetzt, gefolgt von der Zugabe eines monoklonalen Antikörpers zu Cortisol. Die Menge an Cortisol/Peroxidase-Konjugatbindung nimmt mit zunehmender Cortisolkonzentration in der Probe ab.

1. Materialien
   1. Verwenden Sie ein Cortisol-Enzym-Immunoassay-Kit (siehe Materialtabelle), um Cortisol in Speichelproben zu quantifizieren. Alle Reagenzien, die für diesen Test benötigt werden, sind im Kit enthalten. Alle Komponenten des Kits werden bei 0-4 °C vor Erreichen des Ablaufdatums gelagert.
   2. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, das eine optische Dichte (OD) bei 450 nm (siehe Materialtabelle)ablesen kann, sowie Software, die OD-Aufnahmen vom Plattenleser verwenden kann, um eine Vier-Parameter-Logistikkurve (4 PLC) durchzuführen.
2. Reagenz-Präparation
   1. Lassen Sie alle Reagenzien mindestens 30 min auf 20-25 °C aussetzen.
   2. Den Cortisol-Assaypuffer 1:5 mit entionisiertem Wasser verdünnen.
   3. Den Waschpuffer 1:20 mit entionisiertem Wasser verdünnen.
      HINWEIS: Assay- und Waschpuffer sind bei Lagerung bei 0-4 °C 3 Monate lang stabil.
3. Probenvorbereitung
   1. Die Proben vor der Analyse auf Eis auftauen.
   2. Proben 1:10 mit Cortisol-Assay-Puffer (20 l Speichel + 180 l Puffer) verdünnen und innerhalb von 2 h nach der Zubereitung verwenden.
4. Vorbereitung von Normen
   1. Etikettglas-Reagenzgläser #1-#7.
   2. Pipetten Sie 225 l Assaypuffer in Rohr#1 und 125 l Puffer in Rohre #2-#7.
   3. Fügen Sie 25 l der Cortisol-Stammlösung zu #1 und Wirbel hinzu.
   4. Entfernen Sie 125 L Puffer aus der #1 und fügen Sie sie dem #2 und dann dem Wirbel hinzu.
   5. Wiederholen Sie die seriellen Verdünnungen für Rohre #3-#7.
      ANMERKUNG: Die endgültigen Cortisolkonzentrationen jedes Standards sind in Tabelle 1dargestellt.
   6. Normen müssen innerhalb von 2 h der Zubereitung verwendet werden.

norm	#1	#2	#3	#4	#5	#6	#7
Assay-Puffervolumen (L)	225	125	125	125	125	125	125
addieren	Stock Std	#1	#2	#3	#4	#5	#6
Volumen der Addition (L)	25	125	125	125	125	125	125
Endkonzentration (pg/ml)	3200	1600	800	400	200	100	50

Tabelle 1: Standard-Kurvenvorbereitungstabelle.

5. analyse
   1. Verwenden Sie das Plattenlayout unten in Abbildung 1 als Leitfaden, um die Mikroplatte einzurichten.
   2. Es wird empfohlen, eine Mehrkanalpipette zur Zugabe von Reagenzien zu verwenden.
   3. Fügen Sie 50 l Proben oder Standards in die entsprechende Anzahl von Bohrungen in der Platte. Beispiele und Standards sollten in doppelter Ausführung ausgeführt werden.
   4. Fügen Sie den Assaypuffer (75 l) in die unspezifischen Bindungsbrunnen (NSB) ein.
   5. Fügen Sie den Assaypuffer (50 l) in die maximalen Bindungsbrunnen (B0) und die Null-Standard-Bohrungen (leer) ein.
   6. Fügen Sie jedem Brunnen 25 L des Cortisolkonjugats hinzu.
   7. Fügen Sie 25 L des Cortisol-Antikörpers zu jedem Brunnen hinzu, mit Ausnahme der NSB-Bohrungen.
   8. Tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte, um die Reagenzien zu mischen.
   9. Mit dem Plattenversiegeler abdecken und bei Raumtemperatur (RT) bei 20-25 °C für 1 h schütteln.
   10. Entfernen Sie den Brunneninhalt und spülen Sie jeden Brunnen 4x mit Waschpuffer (300 l). Tippen Sie auf die Platte, um auf saugfähigen Handtüchern zwischen den Wäschen zu trocknen.
   11. Fügen Sie das TMB-Substrat zu jedem Brunnen hinzu (100 l).
   12. Die Platte bei 20-25 °C 30 min ohne Schütteln bebrüten.
   13. Fügen Sie jedem Bohrwert eine Stop-Lösung hinzu (50 l).
   14. Lesen Sie die optische Dichte in jeder Bohrung der Mikroplatte bei 450 nm.
   15. Durchschnittlich die optischen Dichten für jeden Standard, dann Probe und subtrahieren Sie die mittlere optische Dichte für die NSB-Bohrungen.
   16. Berechnen Sie die % -Grenze (B/B0) für alle Stichproben mithilfe von Steuerelementen für maximale Bindung (B0).
   17. Erstellen Sie eine Standardkurve mit einer Software, die eine logistische Regressionskurvenanpassung mit vier Parametern aus der %B/B0-Kurve berechnet.
   18. Multiplizieren Sie das Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor (10), um Cortisolwerte in pg/ml zu erhalten.
   19. Proben mit optischen Dichten, die über den höchsten Standard fallen, sollten mit einem Testpuffer weiter verdünnt und erneut untersucht werden, dann sollte das Ergebnis mit dem zusätzlichen Verdünnungsfaktor multipliziert werden.

Abbildung 1 : Beispielplattenlayout. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Psychologische Messung (Perceived Stress Questionnaire)

1. Messen Sie psychologische Ebenen von Probanden mit dem PSQ veröffentlicht von Fliege et al.¹³, die vier Faktoren (Sorgen, Spannung, Spannung, Freude) umfasst und nutzt 20 Elemente.
2. Bitten Sie das Subjekt, den PSQ kurz vor dem Freizeiterlebnis und unmittelbar nach Abschluss der Erfahrung auszufüllen.
3. Tag-Fragebögen mit einer 3-stelligen ID-Nummer, die mit dem biophysiologischen Stressniveau jedes Fachs identisch ist.

Ergebnisse

Beispielbeschreibung
Mit Hilfe einer Quoten-Sampling-Technik rekrutierte diese Studie 35 Besucher von jedem der drei Standorte. Insgesamt wurden in dieser Studie 105 Probanden rekrutiert, darunter 63 Männer und 42 Frauen. Das Durchschnittsalter der besucherrekrutierten Besucher aus drei verschiedenen Standorten betrug 25,9 Jahre (Site A), 37,2 Jahre (Standort B) und 28,8 Jahre (Standort C). Die Häufigkeiten der Besuche der Probanden an den ausgewählten drei Standorten wurden ebenfalls aufgezeichnet...

Diskussion

Ziel dieser Studie ist es, mögliche Stressveränderungen mit hilfe biophysikalischer und psychologischer Instrumente nach der Erholungsvisitation in drei verschiedenen Umgebungen mit unterschiedlichen Naturebenen zu identifizieren. Sowohl Cortisol als auch Amylase haben sich als zuverlässige Indikatoren für psychische Belastungen erwiesen. Das in dieser Studie beschriebene Amylase-Assay-Verfahren wurde an ein 96-Well-Format angepasst. Wenn die Amylasespiegel im Speichel hoch sind, treten Schnell Absorptionsänderungen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	DetectX	K003-H1	The Cortisol Enzyme Immunoassay kit is designed to quantitatively measure cortisol present in dried fecal extracts, saliva, urine, serum, plasma and culture media samples.
Cryogenic Labels for Cryogenic Storage	Fisherbrand	5-910-A	Unique adhesive withstands extreme temperature
Liquid Amylase (CNPG3) Reagent Set	Pointe Scientific	A7564	For the quantitative kinetic determination of α-amylase activity in human serum.
Round Bottom 2mL Polypropylene Tubes with External Thread Cap	Greiner Bio-One	07-000-257	2.0 ml U-BTM Cryo.s self standing polypropylene sterilized
Synergy Multi-Mode Microplate Reader	BioTek		It is a single-channel absorbance, fluorescence, and luminescence microplate reader that uses a dual-optics design to perform measurements of samples in a microplate format.