インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

要約

ここでは、一次線維芽細胞を用いてインビトロスクラッチアッセイを行い、マウスにおける生体内皮膚創傷治癒アッセイに関するプロトコルを提示する。両方のアッセイは、インビトロおよびインビボ創傷治癒を評価するための簡単な方法です。

要約

生体創傷治癒障害は、糖尿病患者や高齢者にとって大きな関心事であり、効果的な治療が必要である。適切なインビトロおよびインビボアプローチは、皮膚創傷治癒プロセスを改善するために薬物治療のための新しい標的分子の同定に不可欠である。電圧ゲートカルシウムチャネル(Cavβ3)のβ3サブユニットを、2つの独立したアッセイにおいて創傷治癒に影響を与える潜在的な標的分子として同定した、 すなわち、インビトロスクラッチ移行アッセイおよびインビボ背面皮膚折室内モデル。野生型(WT)およびCavβ3欠損マウス(Cavβ3 KO)または線維芽細胞から急性単離された一次マウス胚性線維芽細胞(MEF)またはsiRNAで処理したWTマウスから急性単離した線維芽細胞は、Cacnb3遺伝子の発現をダウンカトリートする、Cavβ3を符号化し、使用した。コンフルエント細胞単層にスクラッチを適用し、ギャップ閉鎖に続いて、移行細胞によるギャップの完全な再集積まで、定義された時点で顕微鏡画像を撮影した。これらの画像を分析し,各条件について細胞移動速度を決定した.インビボアッセイでは、WTおよびCavβ3 KOマウスに背中の皮膚折室内を移植し、直径2mmの定義された円形創傷を適用し、ガラスカバースリップで創傷を覆い、感染症や乾燥から保護し、マクロスコピック創傷閉鎖を監視した。時間が経つにつれて。創傷閉鎖はCacnb3-遺伝子欠損マウスにおいて有意に速かった。インビボとインビトロアッセイの結果は相関性がよくあるため、インビトロアッセイは、インビボ創傷治癒モデルによるインビトロヒットを検証する前のハイスループットスクリーニングに有用でありよい。野生型およびCavβ3欠損マウスまたは細胞についてここで示したものは、Cavβ3以外の特定の分子にも適用可能である可能性があります。

概要

皮膚創傷治癒は、皮膚の完全性を回復し、感染から生物を保護するために、皮膚損傷の直後に始まる。創傷治癒プロセスは、4つの重なり合う段階を経る;凝固、炎症、新しい組織形成、および組織リモデリング¹.細胞の移行は、これらの段階で非常に重要です。炎症細胞は、免疫細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および線維芽細胞が異なる時点で活性化され、創傷^領域2に侵入する。インビトロおよびインビボで創傷治癒を調査する方法は、根本的なメカニズムを理解するだけでなく、新薬をテストし、皮膚創傷治癒を改善し、加速することを目的とした新しい戦略を開発することに大きな関心を持っています。

セルの移行を監視および分析するには、スクラッチマイグレーションアッセイを使用できます。多くの場合、インビトロ創傷治癒アッセイと呼ばれます。この方法では、細胞培養^施設3が必要です。それは簡単なプロシージャであり、ハイエンドの装置の必要性がなく、アッセイはほとんどの細胞生物学の実験室で行うことができる。このアッセイでは、細胞不自由領域は、コンフルエント細胞単層の機械的破壊によって作成され、好ましくは上皮または内皮様細胞または線維芽細胞である。スクラッチの端にあるセルは、作成されたギャップを再設定するために移行します。時間の経過に合った細胞のない領域の定量化は、移動速度に似ており、細胞がギャップを閉じる必要がある時間を示します。この目的のために、研究者は、WTマウスから急性単離された細胞または目的の^遺伝子4を欠いているマウス、または信頼性の高い細胞リポジトリから入手可能な不死化細胞のいずれかを使用することができる。スクラッチアッセイは、薬理学的に活性な化合物の影響または細胞移動に対するトランスフェクトされたcDNまたはsiRNAの影響を研究することを可能にする。

生体内では、創傷治癒は複雑な生理学的プロセスであり、皮膚の身体的完全性を可能な限り早く回復させるために、ケラチノサイト、炎症細胞、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞を含む異なる細胞タイプを必要^とする1.生体内創傷治癒における研究の異なる方法は、^{過去5、6、7、8}で開発^され、使用されている。この記事に記載されている背中の皮膚折室は、以前に創傷治癒アッ^セイ9に使用された。マウスに対する修飾後部皮膚折室内製剤として使用される。変更されたスキンフォールドチャンバーモデルにはいくつかの利点がある。1)皮膚収縮を最小限に抑え、創傷治癒過程を観察するのを妨げ、マウスの創傷修復に影響を与える可能性がある。2)この部屋は、ガラスカバースリップで創傷をカバーし、組織感染や乾燥を減らし、治癒プロセスを遅らせる可能性があります。3)血流および血管を直接監視することができる。4)創傷を治療し、治癒を加速するために薬理学的に活性な化合物および試薬の反復的な局所適用を可能^{にする9、10。}

高電圧ゲートカルシウムチャネル(Cavβ3)のβ3サブユニットを、2つの独立したプロトコルを用いて皮膚創傷治癒に影響を与える潜在的な標的分子として同定した。インビトロアッセイでは、一次線維芽細胞を用いて、これらの細胞はCavβ3タンパク質をコードするCacnb3遺伝子を発現するが、脱分極^誘発Ca2+流入または電圧依存^性Ca2+電流を欠いている。これらの線維芽細胞におけるCavβ3の新規機能を説明した:Cavβ3はイノシトール1,4,5-トリスリン酸受容体(IP3R)に結合し、小平血小石体からのカルシウム放出を制約する。マウスにおけるCacnb3遺伝子の欠失は、IP3に対するIP3Rの感受性の増加、細胞移動の増強および皮膚創傷修復^{の増加につながる4.}

プロトコル

すべての実験手順は、ザールランドとザールランド大学の倫理規則と動物福祉委員会に従って承認され、実行されました.

1 一次細胞培養とsiRNAトランスフェクション

注:記載の方法では、一次線維芽細胞が使用される。これらの細胞は、創傷治癒および組織リ^{モデリング11}において重要な役割を果たす。この実験では、Cacnb3遺伝子は、高電圧ゲートカルシウム^{チャネル12}のCavβ3サブユニットを符号化し、ダウンレギュレートし、生体内および皮膚創傷修復における細胞移動におけるその役割を示^した。

1. siRNAの調製:siRNAを再構成する前に、チューブを簡単に遠心分離して、内容物が底部にあることを確認します。メーカーが提供する100μL RNaseフリーバッファー(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES、pH 7.5)でsiRNAを再構成し、20 μMの濃度で提供します。これはsiRNAのストックソリューションです。
2. このストック溶液をチューブ当たり10μL(20μM濃度)でアリコートし、使用するまで-20°Cで保存します。
3. 超微細パーマネントマーカーを使用して、各井戸の下部に水平線を持つ6ウェルプレートをマークし、常に同じ傷の領域を識別し、その閉鎖に従うことができるようになります。
   注:6ウェル培養プレートは、セル単層全体に200 μLピペットチップを使用して一貫した、再現可能で垂直なスクラッチを適用するのに十分なスペースと柔軟性を提供するために、このアッセイで使用されました。限られた数の細胞が利用可能な場合、代替的でおそらくコスト効率の高い方法は、12ウェルまたは24ウェル培養プレートを使用することです。
4. プレート一次線維芽細胞は、野生型およびβ3欠損^マウス4から単離し、5 x 10⁵細胞/ウェルの密度で6ウェルプレート内で、2mLダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を10%の胎児ウシ血清(FCS)を補充した。
   注:ウェル当たり5 x 10^5細胞は、6ウェル培養プレートおよび一次マウス線維芽細胞用に確立されている。12-または24ウェル細胞培養プレートまたは他の細胞タイプを使用する場合、サイズが異なる可能性がある場合は、テストが必要な場合があります。細胞は、生物学的安全キャビネットクラスIIのような無菌環境で取り扱われるべきである。
5. 6ウェルプレートにセルタイプ、遺伝子型、日付にラベルを付けます。
6. 6ウェルプレートを細胞培養インキュベーターに移動し、37°Cおよび5%CO2で24時間細胞を維持します。
7. 翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、ウェルから細胞培養培地を吸引し、それを捨て、井戸の壁に慎重に加えて2.25mLの新鮮培地に置き換える。
8. siRNAで線維芽細胞をトランスフェクトするには、メーカーの推奨通り脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用してください。
9. トランスフェクションごとに、2 本のマイクロ遠心管にラベルを付けます。最初の1つでは、トランスフェクション試薬の9 μLを追加し、150 μLの還元血清培地で希釈します。第2管に、1.5μLsiRNA(Cacnb3 siRNA-1、Cacnb3 siRNA-2またはスクランブルsiRNAを陰性対照として添加)を加え、150μL還元血清培地で希釈する。
10. 希釈されたsiRNAを希釈したトランスフェクション試薬と渦を含むチューブに2s.21°Cで5分間インキュベートする。
11. Cacnb3 siRNA-1、Cacnb3 siRNA-2またはスクランブルsiRNAのいずれかでウェルを標識する。siRNA-トランスフェクション試薬混合物の250 μLを細胞に滴下して添加する。
12. 6ウェル培養プレートをインキュベーターに戻し、細胞を37°C、CO2を72時間保持します。
13. Cacnb3遺伝子サイレンシングの効率をチェックするために、トランスフェクト細胞を収集し、前述^の4のように免疫ブロト分析を行う。

2. インビトロ創傷治癒アッセイ(スクラッチマイグレーションアッセイ)

1. 細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、10倍の目的を使用して顕微鏡下の細胞を調べます。スクラッチアッセイは、100%の合流率に達した場合にのみ開始します。
   注: 精度と再現性のために、100% コンフルエンスは、スクラッチマイグレーションアッセイを開始するための必須要素です。したがって、同じ数の細胞を培養井戸に播種し、各ウェルを調べて合流を調べ、同時に時点(0日目)にスクラッチを適用することが重要である。細胞が100%合流に達した後に長く待つことは、異なる応答を呼び起こす可能性があります。
2. 細胞が100%合流に達したら、培養培地を井戸から吸い出し、捨てます。
3. ピペットチップ(200 μL)を使用して、ウェルの中央にあるコンフルエントセル単層を横切って、ウェルの下部にマークされた水平線に垂直にスクラッチを手動で作成します。
4. 2 mLリン酸緩衝生理食生(PBS)(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH₂PO 4、8.1 mM Na₂HPO_4、pH7.4)で各ウェルを2回すすり、損傷した細胞、緩い細胞、および破片から放出された因子を除去します。細胞培養物から細胞を切り離さないように、ウェルの壁に対して2mLのPBSを慎重に追加します。
5. 各ウェルに10%の血清または1%の血清を含む細胞培養培地の2 mLを慎重に追加する。
   注:10%の血清の下で、1%以下の血清の下でスクラッチアッセイを行うことをお勧めします。
6. プレートを顕微鏡ステージに移動し、光顕微鏡を使用して10倍の倍率で傷(t=0h)を引っ掻いた直後に、無細胞領域(ウェルあたり2つの領域)の明るいフィールド画像をキャプチャします。常にスクラッチの同じ領域をイメージするには、ステップ (1.3) で用意された水平線を使用し、この行の上に 1 つのイメージと、この行の下に 1 つのイメージを取ります。画像を TIFF または JPEG として保存します。
7. 顕微鏡段階では細胞増殖状態が維持されないため、プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、細胞を37°Cおよび5%CO2に保ちます。
8. 6、10および30hの後、プレートを再び顕微鏡ステージに移動し、ステップ2.6で説明したのと同じ方法で画像をキャプチャする。
   注: これらの時間ポイントは、説明された手順および一次線維芽細胞に対して確立されています。最初のパイロット実験では、より多くの時間ポイントをテストして、線維芽細胞がギャップを再び取り戻す速度を確認しました。0、6、10、30 h は妥当な開始時間ポイントですが、調査者は各アプリケーションおよび各セルタイプに適したタイム ポイントを最適化して確立する必要があります。より正確な代替手段は、可能であれば、タイムラプス顕微鏡を使用することです。
9. ImageJ¹³を使用して、初期無細胞領域を定量化する (100%)6、10、30 hの後の残りの領域(図1)。セルの移動によって再設定されたスクラッチ領域のパーセンテージは、最初のスクラッチ領域に対して相対的に計算されます。

3. スクラッチ領域の解析

1. ImageJ ソフトウェア^{を開く 13}.
2. ImageJ メニュー バーにイメージをドロップして、最初の画像を JPEG (24 ビット RGB イメージ 1360x1024 など) としてアップロードします。
3. フリーハンド選択ボタンを選択し、セルフリー領域をマーク
4. [分析]をクリックし、[測定]を選択します。結果を含むウィンドウがエリア値を含んで表示されます。
5. この値を分析スプレッドシートに転送します。
6. タイムポイント 0 h から各イメージに対して手順 3.2 ~ 3.5 を繰り返し、次のタイム ポイント 6、10、30 h の場合に再度開始します。
7. 次の式を使用して、各スクラッチの 6、10、および 30 h の後にセルを移動して再設定されたスクラッチ領域のパーセンテージを計算します。
   
   a = 最初のスクラッチのセルフリー領域、b = 6 時間後のセル自由領域
8. 6 時間後にセルを移動して再設定したスクラッチ領域の割合の平均値と標準誤差 (S.E.M.) を計算します。

4. 生体内皮膚創傷治癒アッセイ

注:C57BL/6野生型オス(体重22~26gの生後8~12週齢)とCavβ3欠損マウスを対照として用いる。

1. 実験を開始する前日、スキンフォールドチャンバーの調製に使用されるすべての手術器具、ネジ、ナット、チタンフレームをオートクレーブします。
   注:チタンフレームは2つの対称的な相補的な半分で構成され、創傷が適用され、顕微鏡検査が続く円形の観察ウィンドウがあります(図2aを参照)。
2. ケタミン(体重75mg/kg)とキシラジン(体重25mg/kg)の混合物を含む0.1 mL生理食生理食生活/10gの体重の注射により、野生型またはβ3欠損マウス(体重22〜26g)を麻酔する。つま先のピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
   注:この注射は、約30分の外科麻酔を与え、麻酔の深さは、マウスの反射をチェックすることによって、外科的処置を介して制御されなければなりません。
3. 目の乾燥や損傷を避けるために、両眼に眼科のointmentを適用し、必要に応じて適用を繰り返します。
4. 慎重にマウスのドーサムを剃り、電気剃毛を使用して、残りの髪を除去するために剃毛領域に脱毛クリームを適用します。マウスの皮膚を傷つけないように注意してください。脱毛クリームを約10分間放置し、すべての髪を完全に取り除きます。
5. 対称チタンチャンバフレームの一部を取ることによってチタンチャンバを準備し、片側にナットで接続ネジを固定します。これらのナットは、皮膚の血管の圧縮を避けるために、チャンバーの2つの対称部分の間に400-500 μmを保つためのスペーサーとして機能します。
6. マウスの後ろからクリームを取り出し、暖かい(35-37°C)水道水で毛のない領域をきれいにします。
7. 手術を行う場所が清潔で暖かい(37°C)、加湿されていることを確認してください。
8. 皮膚消毒剤でマウスの毛のない領域を消毒する。光源の前にマウスの背中の皮膚の折り目を取り、チタン室が埋め込まれる皮膚の二重層の中央線を配置します。その後、ポリプロピレン縫合糸でスキンフォールドを頭蓋と口蓋で固定し、金属ラックの縫合糸の反対側を引き締めて、マウスの折り目のある皮膚を持ち上げます。ラックの高さを調整して、マウスが快適に座れるようにします。
9. チタンチャンバーをマウスの背面皮膚の折り目に埋め込み、チタンフレームの2つの対称的な半分の間に折りたたまれた背部皮膚層を挟む方法で。チタンフレームの前半を、背部の皮膚折りたたみの背面に、その優れたエッジにポリプロピレン縫合糸で取り付けます。
   注:チタンフレームには、優れたエッジ(図2a)に8つの穴があり、折りたたまれた皮膚は8つの穴のそれぞれにポリプロピレン縫合糸で十分に固定する必要があります。
10. 次の手順に進む前に、マウスの反射神経をチェックして、麻酔の深さが維持されていることを確認します。
11. スキンフォールドの基部に、チタンチャンバの前半に取り付けられた2本の接続ネジを通過させ、背面から前面にスキンフォールドを貫通させる。接続ネジの滑らかな浸透を助けるために(細かいはさみを使用して)皮膚に小さな切開を行います。
12. マウスをラックから取り外し、横の位置に置きます。3本の接続ネジの上にチタンチャンバーの2番目の補完的な半分を置き(図2aを参照)、チタンフレームの後半を通してこれらのネジを通過させるために指でわずかな圧力を加えます。次に、ステンレススチールナットで両方の対称部品を固定します。
13. ネジが緩すぎると剥離する可能性があるため、このステップではネジの締めに注意してください。対照的に、それがあまりにもタイトな場合、それは皮膚の折り目を圧迫し、血流を減少させ、組織障害や壊死につながることができます。
    注:ステップ4.5で調製されたナットは、チタンチャンバの2つの対称的な半分の間に400-500 μmの距離を保つためにスペーサーとして機能します。ナットは、わずかな抵抗が感じられるまで締める必要があります。
14. ペンチを使用してネジの残りの部分をカットします。
    注:この手順では、ネジが間違った方法で外れた場合に備えて、目の保護のために実験室の安全メガネを使用する必要があります。
15. 再現可能な創傷サイズを確保するために、皮膚の観察窓内の皮膚の中心(図2aを参照)で、標準化された生検パンチ(直径2mm)によって創傷領域をマークする。
16. 細かい鉗子とはさみを使用することにより、表皮と真皮で完全な皮膚を除去することにより、マークされた領域内に円形の傷を作成します。最終的な創傷領域は約 3.5-4.5 mm²になります,図 2b を参照してください。0.5 mLの滅菌生理生理生理(0.9%NaCl、37°C)で創傷をきれいにします。
17. ガラスカバースリップで傷口を覆い、チタンチャンバーのスナップリングペンチを使用してスナップリングでこのガラスカバースリップを固定します。
18. 手術を終えた直後に、カメラを搭載した立体顕微鏡のイメージングステージにマウスを置き、照明下で画像を撮ります(0日目)。40X倍率を使用し、将来のオフライン解析のために画像を保存します。
    注: 調査者は、キャプチャ直後に画像を調べて、将来のオフライン分析に十分な品質を確認する必要があります。皮膚折りたたみ室の調製および皮膚創傷の性能は約30分かかります。
19. 少なくとも2時間麻酔からの回復中に暖かい場所にマウスを保ちます。その後、個々のケージ内のマウスを動物施設(12時間光/暗いサイクル)に戻し、マウスが食物と水にアクセスしていることを確認します。
20. 3日後にマウスをマウス拘束器に入れ、イメージングステージの上に拘束器を固定する。
21. カメラを装備した立体顕微鏡の下にステージを配置します。40倍の倍率で照明の下で画像を撮る、すべての画像を記録し、将来のオフライン分析のためにそれらを保存
22. 6日目、10日目、14日目の創傷後に、4.20と4.21の手順をもう一度繰り返します。
23. ImageJ¹³のオフライン解析には、創傷画像を使用します。0日目の創傷領域は100%とみなされ、時間の経過とともに創傷閉鎖は初期創傷領域に対してプロットされる。代表的な結果を図 2c,dに示します。
24. パーセンテージ (%)次の式を使用して、各時点での創傷領域の。
    
    x: 時点 (日 0, 3, 10 または 14), a: 0 日目の創傷領域, b: 時時点での創傷領域x

結果

スクラッチアッセイは、野生型およびβ3欠損MEFのコンフルエント細胞単層に対して行った(図1c)。200 μLピペット先端を使用して「スクラッチ」を実行した後、両方のジェノタイプの細胞がスクラッチ領域に移行し、ギャップを閉じます。画像は6、10、30h(図1a)以降に撮影した。細胞の移行はパーセンテージ(%)スクラッチを実...

ディスカッション

この原稿では、インビトロおよびインビボ創傷治癒アッセイについて説明し、得られた結果を相関させる。インビトロアッセイでは、創傷治癒および組織リ^{モデリング11}において重要な役割を果たす一次マウス線維芽^{細胞4、14、15}を用いた。単層として増殖する他の付着細胞型(例えば、上皮細胞、内皮細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % NaCl
1 ml syringes	BD Plastipak	303172
6 well plate	Corning	3516
Biopsy punch	Kai Industries	48201	2 mm
Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)	Origene	SR415626
Depilation cream			any depilation cream
Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)	Bayer	3400935940179.00	(BEPANTHEN)
Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)	Bayer Health Care		Rompun 2%
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco by life technologies	41966-029
Fetal bovine serum	Gibco by life technologies	10270-106
Hexagon full nut
Ketamine hydrochloride	Zoetis		KETASET
Light microscope	Keyence, Osaka, Japan	BZ-8000	Similar microscopes might be used
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	13778075
Micro-forceps
Micro-Scissors
Mouse restrainer	Home-made
Normal scissors
Objective	Nikon	plan apo 10x/0.45
Opti-MEM	Gibco by life technologies	51985-026
Polypropylene sutures
Screwdriver
Skin disinfectant (octeniderm)	Schülke & Mayr GmbH	118212
Slotted cheese head screw
Snap ring
Snap ring plier
Surgical microscope with camera	Leica	Leica M651
Titanium frames for the skinfold chamber	IROLA	160001	Halteblech M
Wire piler