Construcción de Plásmidos CRISPR y Detección de Eficiencia Knockout en Células de Mamíferos a través de un Sistema Dual de Reporteros Luciferase

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe un método simplificado para la generación eficiente de plásmidos que expresa tanto la enzima CRISPR como el ARN guía único asociado (sgRNAs). La coexistencia de células de mamíferos con este vector sgRNA/CRISPR y un vector reportero de luciferasa doble que examina la reparación de rotura de doble hebra permite evaluar la eficiencia de la eliminatoria.

Resumen

Aunque es altamente eficiente, la modificación de un sitio genómico por la enzima CRISPR requiere la generación de un sgRNA único para el sitio o sitios objetivo de antemano. Este trabajo describe los pasos clave que conducen a la construcción de vectores de sgRNA eficientes utilizando una estrategia que permite la detección eficiente de las colonias positivas por PCR antes de la secuenciación del ADN. Dado que la edición eficiente del genoma mediante el sistema CRISPR requiere un sgRNA altamente eficiente, es necesaria una preselección de los objetivos candidatos de sgRNA para ahorrar tiempo y esfuerzo. Se ha desarrollado un sistema de reportero de doble luciferasa para evaluar la eficiencia de los golpes examinando la reparación de roturas de doble cadena mediante recocido de una sola cadena. Aquí, utilizamos este sistema de reporteros para recoger el objetivo preferido de xCas9/sgRNA de los vectores sgRNA candidatos para la edición de genes específicos. El protocolo descrito proporcionará un vector enzimático sgRNA/CRISPR preferido en 10 días (comenzando con oligonucleótidos adecuadamente diseñados).

Introducción

Los sgRNAs CRISPR comprenden una secuencia de 20 nucleótidos (el protoespacial), que es complementaria a la secuencia de objetivos genómicos^1,2. Aunque es altamente eficiente, la capacidad del sistema CRISPR/Cas para modificar un sitio genómico determinado requiere la generación de un vector que lleve un sgRNA eficiente único en el sitio o sitios de destino^2. Este documento describe los pasos clave en la generación de ese vector sgRNA.

Para una edición exitosa del genoma utilizando el sistema CRISPR/Cas, el uso de sgRNAs altamente eficientes es un requisito previo crucial^3,4,5. Dado que las nuclelas diseñadas utilizadas en la edición del genoma manifiestan diversas eficiencias en diferentes loci^1,es necesaria una preselección de los objetivos de sgRNA candidatos para ahorrar tiempo y esfuerzo^6,7,8,9. Se ha desarrollado un sistema de reportero de luciferasa dual para evaluar la eficiencia de los golpes examinando la reparación de roturas de doble hebra a través de recocido de una sola hebra^3,10. Aquí utilizamos este sistema de reporteros para elegir un objetivo preferido de SGRNA CRISPR entre diferentes vectores sgRNA candidatos diseñados para la edición de genes específicos. El protocolo aquí establecido se ha implementado en nuestro grupo y laboratorios colaboradores durante los últimos años para generar y evaluar los sgRNAs CRISPR.

El siguiente protocolo resume cómo diseñar sgRNA adecuado a través de software de red. Una vez seleccionados los sgRNAs adecuados, describimos los diferentes pasos para obtener los oligonucleótidos necesarios, así como el enfoque para insertar los oligonucleótidos emparejados en el vector de expresión pX330-xCas9. También presentamos un método para ensamblar vectores de reporteros de srna-expresión y luciferasa dual basados en la ligación de estas secuencias en un vector de expresión predigerido (pasos 2-10, Figura 1A). Finalmente describimos cómo analizar la eficiencia de corte de ADN para cada uno de los sgRNAs (pasos 11-12).

Protocolo

1. diseño de oligonucleótidos sgRNA

1. Diseñe sgRNAs utilizando herramientas en línea como la herramienta en línea (http://www.rgenome.net/cas-designer/ de Cas-Designer). La secuencia PAM es importante en función del Cas9 que se está utilizando. Para xCas9, las secuencias PAM relevantes son NG y la antigua herramienta en línea Cas-Designer referida puede generar xCas9 sgRNAs relevantes.
   1. Utilice herramientas de diseño sgRNA que abarquen algoritmos para la predicción dentro y fuera del objetivo (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Se prefiere una puntuación de 0,2 o superior.
2. Seleccione hasta 3 objetivos de edición de genes para un cribado óptimo (por ejemplo, T1, T2 y T3 fueron diseñados para ovejas DKK2 exón 1 dirigidas al gen [Tabla 1]).

2. Modificación de oligonucleótidos

1. Para modificar el oligonucleótido sgRNA, elimine el motivo adyacente del protoespacialista de 3'-NG (PAM), manteniendo la secuencia del protoespacial (por ejemplo, secuencia inicial para T1: TGCCTGCTCCTCTACTGGCCGC [20 nt]).
2. Agregue el PENTAnucleótido CACCG al extremo 5'del oligo.
   NOTA: Tras la ligadura al esqueleto pX330-xCas9, esta secuencia contendrá el extremo 3'-end del promotor U6 motivando la transcripción de sgRNA. La matriz "CACC" garantiza que el oligo está coincidiendo con los voladizos del plásmido pX330-xCas9 digerido por BbsI. La base "G" es un requisito previo de los promotores de ARN Polimerasa III y garantiza el inicio efectivo de la transcripción de sgRNA (por ejemplo, añadiendo la matriz 5'-CACCG al protoespacialista de T1, logrando T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTCTACTGGCCGC [25 nt]). La eficiencia de escote de 21 nt gRNA es significativamente diferente de la de 20 nt gRNA^1,12,13,14. Generalmente se recomienda utilizar 20 nt con 5'-G mediante la generación de un protoespacial más corto, si esto no es posible entonces 21 nt con 5'-G extra se puede utilizar.
3. Cree un complemento inverso (rc) de la secuencia del protoespacial.
   NOTA: Por ejemplo, el rc del protoespacial T1 es GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
4. Anexe AAAC al extremo 5' de la secuencia del protoespacialador rc. Añada una C adicional al extremo 3'-del protoespacialista rc.
   NOTA: La secuencia "AAAC" garantiza que el oligonucleótido sea adecuado para clonar en el plásmido pX330-xCas9 digerido por BbsI. La "C" adicional en el extremo 3'-end es esencial para recocido con el iniciado "G" para la transcripción sgRNA descrita anteriormente (por ejemplo, AAACGCGGCCAGTAGGAGCGCGCAC [25 nt] es la secuencia final de oligonucleótidos para el protoespacial T1 rc.
5. Ordene los oligonucleótidos.

3. Recocido de oligonucleótidos

1. Diluir los oligonucleótidos liofilizados a una concentración final de 10 oM en agua destilada doble (ddH₂O).
2. Mezclar oligonucleótidos hacia delante y hacia atrás en un tubo PCR de pared delgada que tiene una relación de 1:1 (por ejemplo, 20 ml cada uno) sin añadir ningún búfer adicional.
3. Incubar la mezcla a 95oC durante 5 min y luego bajar la temperatura a 72oC durante 10 min. Siga con un período de enfriamiento a temperatura ambiente (RT) que consiste simplemente en extraer la muestra de la máquina PCR y colocarla en RT.
   NOTA: No es necesario fosforilar las mezclas de oligonucleótidos para facilitar la ligadura.

4. digestión vectorial sgRNA/CRISPR

1. Digerir 1 g del vector pX330-xCas9 seleccionado con BbsI (10 unidades de enzima por 1 g de plásmido) durante 2 h a 37oC(Figura 2). Llevar a cabo la digestión del vector de expresión de pX330-xCas9 sgRNA en un volumen total de 50 l, que contiene 5 l de tampón de digestión 10x y agua destilada para alcanzar el volumen final.
2. Purificar el vector digerido mediante la extracción de banda de un gel de agarosa al 2% bajo 10 V/cm y posteriormente purificar utilizando una columna de sílice utilizando un kit de extracción de gel comercial.

5. Ligadura de los oligonucleótidos sgRNA recocidos al vector de expresión

1. Mezclar los oligonucleótidos sgRNA recocidos (5 l de la mezcla del paso 4) con el vector pX330-xCas9 digerido por BbsI (purificado, 100 ng).
2. Agregue 1 l de ligasa y 1 l de tampón de ligasa 10x.
3. Añadir agua destilada con el volumen adecuado, hasta 10 l.
4. Incubar durante la noche a 4oC.

6. Transformación celular competente

1. Sacar las células competentes de E. coli DH5 del almacenamiento a -80 oC y descongelarlas sobre hielo.
2. Añadir 5 l de la mezcla de ligadura a 50 l de E. coli DH5 competente y mantener la mezcla sobre hielo durante 30 min.
3. Choque térmico de la mezcla a 42oC durante 90 s.
4. Descanse sobre hielo durante 2 min.
5. Recuperar el cultivo en una coctelera giratoria en 500 s de soportes LB durante 1 h a 37 oC.
6. Placa 200 l del cultivo sobre una placa de agarosa LB resistente a la ampicilina y la incubar durante la noche a 37oC.

7. Identificación de los plásmidos recombinantes correctos por PCR

1. Elija de 5 a 10 colonias bacterianas de la placa LB y utilice cada una de ellas para inocular un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de medios LB con 60 mg/ml de ampicilina.
2. Incubar los tubos en una coctelera giratoria durante 2-3 h.
3. Llevar a cabo la detección de plásmidos recombinantes correctos mediante el uso de pares de imprimación específicos para los oligonucleótidos sgRNA [por ejemplo, imprimación directa para la construcción de vectores de expresión T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTCTACTGGCCGC, imprimación inversa (BbsI-R): AAACCCTATTGGCGTTAC produciendo, un amplicon de 287 bp(Figura 3)].
   1. Preparar la mezcla de PCR(Tabla 2).
   2. Utilice las siguientes condiciones de ciclo de PCR: 95 oC durante 5 minutos para la pre-desnaturalización; 30 ciclos de 95oC para 30 s para desnaturalización, 60oC para 30 s para recocido, y 72oC para 30 s para extensión. Una vez completados los 30 ciclos, realice un paso de extensión final calentando durante 5 min a 72 oC.
   3. Ejecute el producto PCR con un gel de agarosa del 2% bajo 10 V/cm. Una banda del tamaño correcto [por ejemplo, 287 bp] se considera positiva.

8. Validar la secuencia del plásmido de expresión sgRNA

1. Verifique la secuencia de colonias positivas de PCR mediante la secuenciación de Sanger¹⁵ utilizando la imprimación inversa BbsI-R (véase el paso 7.3). Esta imprimación recocidos en el sitio aguas abajo de la inserción de oligo de sgRNA. Se construyó el pX330-xCas9-T1 que expresa la secuencia sgRNA que contiene el protoespacialista TGCCTCTCTCTCTGGCCGCGG y xCas9.
2. Utilice la imprimación delantera T1-F para secuenciar las colonias positivas. El delantero no podía dar información completa de la secuencia para el sitio que rodeaba el sitio de inserción del oligo sgRNA, porque el fragmento de 30-50 bp después de la imprimación de secuenciación no se podía leer exactamente.

9. Construcción de vector reportero de luciferasa dual

1. Sintetizar fragmentos de ADN de 300-500 bp que contengan los objetivos de sgRNA y subclone en un vector de reportero de luciferasa dual a través de la doble digestión [por ejemplo, fragmento de subclone 440 bp ovino DKK2 exon1 en plásmido pSSA-Dual^16,17 mediante el uso de doble digestión con AscI y SalI, resultando pSSA-Dual-DKK2].
2. Sintetice fragmentos de ADN de 300-500 bp que contengan los objetivos de SGRNA. Tenga en cuenta que las secuencias de los fragmentos de ADN deben ser partes de las secuencias genómicas, que podrían obtenerse del sitio web de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o referencias relacionadas.
3. Seleccione un vector de reportero de luciferasa dual adecuado como pSSA-Dual^16,17 (o dos vectores que expresen la luciasa de la luciérntica y la renilla luciferase respectivamente) y luego digiere este vector y los fragmentos de ADN mencionados anteriormente con dos endonucleasas como AscI y SalI.
4. Finalmente ligar estos dos fragmentos con T4 DNA Ligase, resultando en pSSA-Dual-Target. Los detalles de la doble digestión y la ligadura se muestran en la Tabla 3 y la Tabla 4,respectivamente. Vale la pena mencionar que el vector reportero debe amplificarse en cepas de bacterias estables (como Top10), que se recomiendan para ser cultivados con menor velocidad de rotación (normalmente no más de 200 rpm), con el fin de evitar la recombinación del ADN.

10. Transfección celular

1. Extraiga plásmidos libres de endotoxinas para los vectores indicados anteriormente. Evaluar la pureza y concentración de los plásmidos utilizando instrumentos adecuados. Para estos plásmidos se recomienda una concentración final de no menos de 500 ng/L y una relación de pureza de 1,7-1,9 a una absorbancia de 260/280 nm (A260/A280).
2. Co-transfectar una línea celular apropiada como PIEC¹⁸ con los plásmidos en igual proporción (por ejemplo, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2-1:1, 0.5 g plásmido para cada duplicación cuando se utiliza 24 placas de pozo). Utilice un vector vacío como pX330-xCas9 como control negativo.
   1. Un día antes de la transfección, células de placa en una placa de cultivo de 24 pocillos a una densidad de 2 x 10⁵ células / pozo. Las células estarán listas para la transfección cuando logren una confluencia de 60-80%.
   2. Antes del punto de tiempo de transfección, retire el sobrenadante tanto como sea posible y agregue suavemente 0,5 ml de medios frescos para cada pocól.
   3. Diluir el reactivo de transfección en medios DMEM en la proporción de 1:25 y mezclar bien.
   4. Preparar la mezcla maestra de ADN diluyendo 0,5 g de ADN en 25 ml de medios DMEM, y luego añadir 1 l de reactivo P3000.
   5. Añadir ADN diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido (relación 1:1).
   6. Incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente.
   7. Añadir 50 l de complejo de lípidos de ADN a las células.
   8. Incubar células durante 24 h a 37oC. Luego, analice las células trans infectadas como en el paso 11.

11. Detección de doble lucifera

1. Preparar una cantidad suficiente del tampón de lisis pasiva 1x (PLB) añadiendo 1 volumen de 5x PLB a 4 volúmenes de agua destilada y mezclar bien.
2. Lysis pasiva de células cultivadas en placas de cultivo de 24 pozos.
   1. Retire el medio de crecimiento de las células cultivadas y aplique suavemente un volumen suficiente de solución salina tamponada de fosfato (PBS) para lavar la superficie del recipiente de cultivo. Gire brevemente el recipiente para eliminar las células separadas y el medio de crecimiento residual. Retire completamente la solución de enjuague antes de aplicar el reactivo PLB.
   2. Dispensar 100 l de 1x PLB en cada pozo de cultivo para cubrir completamente la monocapa celular. Deje que las placas de cultivo se de pie durante 20 minutos.
   3. Transfiera el izado a un tubo o vial para su posterior manipulación o almacenamiento.
3. Preparar el reactivo de ensayo de luciferasa (LAR) resuspendiendo el sustrato de ensayo de luciferasa liofilizado proporcionado en 10 ml del tampón de ensayo de luciferasa suministrado.
4. Preparar un volumen adecuado para realizar el número deseado de ensayos de reporteros de doble luciferasa (reactivo de 100 l por ensayo). Agregue 1 volumen de sustrato de tope 50x a 50 volúmenes de tampón de tope en un tubo de vidrio o polipropileno siliconizado.
5. Ensayo de reportero de doble luciferasa (DLR)
   1. Programe luminómetros para proporcionar un retardo de pre-lectura de 2 segundos, seguido de un período de medición de 10 segundos.
   2. Predispense 100 l de reactivo de ensayo de luciferasa en el número adecuado de tubos luminómetros para completar el número deseado de ensayos DLR.
   3. Transfiera con cuidado hasta 20 ml de lito de celda al tubo luminómetro que contiene LAR; mezclar por pipeteo 2 o 3 veces. Coloque el tubo en el luminómetro e inicie la lectura.
   4. Retire el tubo de muestra del luminómetro, añada 100 l de reactivo de tope y vórtice brevemente para mezclar. Sustituya la muestra en el luminómetro e inicie la lectura.
   5. Registre la actividad de renilla luciferase normalizada a la actividad luciferasa de la luciérntica, es decir, la recíproca de la relación mostrada en la pantalla.
   6. Deseche el tubo de reacción y proceda al siguiente ensayo.

Resultados

Los métodos descritos en este protocolo son para la construcción de vectores de expresión sgRNA y xCas9 y luego para la optimización de los oligos de SGRNA con eficiencias de focalización genética relativamente más altas. Aquí mostramos un ejemplo representativo de 3 objetivos sgRNA a ovinos DKK2 exón 1. Los vectores que expresan SgRNA y xCas9 se pueden construir predigeriendo la columna vertebral del vector (Figura 2) seguida de ligarla en una serie de fragmentos cortos de...

Discusión

Los procedimientos de clonación vectorial de sgRNA que hemos descrito aquí facilitan la producción eficiente de sgRNAs, con la mayoría de los costos derivados del orden de oligonucleótidos y la secuenciación vectorial. Mientras que el método descrito está diseñado para permitir a los usuarios generar sgRNAs para su uso con CRISPR/Cas9, el protocolo se puede adaptar fácilmente para su uso con ortologues Cas9 u otras endonucleasas guiadas por ARN como Cpf1, introduciendo modificaciones menores en la columna verte...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.