수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

요약

여기에 제시된 것은 높은 정밀도와 분류학적 분해능으로 수생 약탈 진핵생물의 방목 속도를 정량화하는 단일 세포, epifluorescence 현미경 기반 기술에 대한 프로토콜입니다.

초록

포식과 그 효과와 같은 영양 상호 작용을 해명하는 것은 생태학에 있는 많은 연구원을 위한 빈번한 작업입니다. 미생물 공동체의 연구는 많은 한계를 가지고 있으며, 육식 동물, 먹이 및 약탈 비율을 결정하는 것은 종종 어렵습니다. 여기에 제시된 것은 형광으로 표지된 먹이를 트레이서로 추가하여 수생 육식 진핵생물의 방목 속도의 안정적인 정량화와 더 높은 영양 수준으로의 영양 전달 추정을 가능하게 하는 최적화된 방법입니다.

서문

이종 영양 성 원생 체는 수생 시스템의 주요 생물학적 구성 요소이며 플랑크톤 바이오 매스^1,2,3의상당한 부분을 차지합니다. 그들의 풍부, 다양성 및 활동을 통제하는 요인은 생물 지구 화학 사이클링에 있는 그들의 역할을 이해하는 위해 중요합니다 (즉, 유기 탄소 및 그밖 양분의 운명 및 원핵생물에서 더 높은 영양 수준에 에너지의 교류). 원생 동물 방목은 이러한 중요한 요소 중 하나입니다. 이종 영양 나노 깃 형성 및 섬모의 박취는 원핵 생물 풍부, 지역 사회 기능, 구조, 다양성, 심지어 세포 형태와 특정 세균 그룹의 성장 속도에 대한 강력한 하향식 제어를 부과^{4, 5,6}. 일부 시스템에서는, protists세균 사망의 주요 원인으로 봉사^6,7.

지금 얼마 동안 이용된 원생 동물 세균을 평가하기 위하여 이용된 표준 접근은, 먹이 유사체 및 epifluorescence 현미경 검사법으로 형광으로 표지된 박테리아 (FLB)의 사용을 관련시킵니다. 세포 특이적 관세포 비율은 선택된 시간 과정^8에걸쳐 프로티스탄 식품 액구에서 표지된 먹이 입자의 수를 정량화함으로써 결정될 수 있다. 이 접근 방식에는 몇 가지 장점이 있습니다. 트레이서자연 육식 동물과 먹이 조립과 자연 샘플에 추가됩니다. 인큐베이션 전에 최소 샘플 조작, 추가된 FLB 추적에 의한 최소 샘플 변경, 인큐베이션 시간이 짧아 상태 조건에서 가까운 조건에서 얻은 음량 결과를 보장합니다. 또는, 세균성 프로티스트 또는 동물플랑크톤(예: 해양 해양 시스템)이 적은 환경에서는 소량(2%-3% 추적자)으로 시료에 첨가된 FLB의 소실률이 장기간 유세포측정을 통해 검출할 수 있습니다(12-24시간). 인큐베이션 실험. 그런 다음 시작 점과 끝점의 FLB 수(모든 세균의 영향을 통합)는 유세포 측정에 의해 정량화됩니다(자세한 내용은 이전 간행물⁹참조). 그러나, 이러한 파라미터는 특정 프로티스탄 및 동물플랑크톤 방목기 그룹 또는 종에 직접적으로 기인할 수 없는 총 집계 된 세균 비율을 나타냅니다.

전반적으로, 수생 환경에서 프로티스탄 종- 또는 형태형 특이적 세균 사망률을 정확하고 생태학적 의미로 정량화하는 것은 어려울 수 있다. 일부 프로티스트는 선택적 방목자이며, 추가된 FLB 트레이서의 크기 및 세포 형상은 먹이 섭취의 자연적인 비율을 왜곡할 수 있다^10,11. 더욱이, 프로티스탄 활동 및 물질 대사는 매우 온도에 민감한^12; 따라서 추가된 FLB 추적자의 양은 각 개별 샘플 유형에 대해 신중하게 조작되어야 합니다(박테리아의 자연적인 풍부성, 크기 및 형태와 세균의 일반적인 유형뿐만 아니라 온도에도 따라). 대부분의 연구는 대량 프로 티 스탄 방목 활동에 초점; 그러나, 특정 프로티스탄 종의 세균은 종종 훨씬 더 높은 정보 값을 보유하고 바람직 할 수있다. 이 경우 샘플에 존재하는 프로티스트 종에 대한 분류학적 지식과 행동에 대한 이해가 필요합니다. 따라서, 시간과 노동의 상당한 금액은 특정 프로티스탄 그룹 또는 종에 기인 하는 세균의 종 특정 비율에 대 한 사운드 결과 얻을 필요.

이러한 어려움에도 불구하고,이 방법은 자연 설정에서 프로티스탄 세균을 평가하기 위해 현재 사용할 수있는 가장 적합한 도구 남아있다. 여기에 제시된 수생 미생물 생태 학 연구에서 FLB를 추적자로 사용하기위한 포괄적이고 따르기 쉬운 방법입니다. 접근법의 모든 문제적 측면을 설명하고 개선 된 워크플로우를 설명하며, 대조적인 환경에서 두 가지 실험과 함께 섬모 종을 대조적으로 예로 설명합니다.

첫 번째 사례 연구는 체코의 중불위성 의 르지모프(Římov) 저수지에서 에필림네틱 환경에서 수행되었으며, 이는 대부분의 수면담수 체에 필적하는 방목지와 세균풍부를 보여줍니다(5,⁷참조). 두 번째 사례 연구는 수생 육식 식물 Utricularia 반사의트랩 내부 매우 특정 환경에서 실시되었다, 이는 모두 방목 mixotrophic 섬모의 매우 높은 숫자를 호스팅(테트라 히메나 utriculariae) 및 세균 성 세포. 두 샘플 유형 모두에서 세포 별 방목 속도 및 세균 서 주식의 계산이 표시됩니다. 결과의 생태 해석의 범위는 그 때 토론되고, 가능한 후속 연구 결과의 보기는 마침내 건의됩니다.

프로토콜

1. 샘플 수집

1. 저수지 물 샘플 의 수집: 첫 번째 사례 연구 (Exp I; 체질 육식 동물과 먹이 풍부 시스템에서 낮은 자연)
   1. 적절한 깊이에서 원하는 위치에서 물 샘플을 수집합니다. 실험실로 운반하는 동안 시료를 온도 조절 식 쿨러에 체재하여 (온도 충격을 피하며, 프로티스트의 섭취 율은 온도에 따라 달라지도록 주의해야 합니다).
      참고 : 우리의 샘플링은 메소 - 영양 성 협곡 모양의 르지 모프 저수지 (사우스 보헤미아, 볼륨 34.5 x 10^{6m 3,}최대 깊이 43 m, 평균 체류 시간 100 일, dimictic)에서 수행되었습니다. 샘플링 사이트는 댐에 가까운 30m 깊이에 위치했다. 0.5 m 깊이에서 혼합 된 샘플을 2 l 프리딩거 샘플러에 의해 수집하였다.
   2. 가능한 한 빨리 섹션 1.2를 계속합니다.
2. 육식 성 Utricularia 반사 요법 식물의 함정에서 유체의 컬렉션 : 두 번째 사례 연구 (Exp II; 높은 육식 동물과 먹이 풍부 시스템, 매우 작은 샘플 볼륨)
   1. 식물을 수중으로 부드럽게 흔들어 재배 용기에서 제거하고 흡수성 물질에 배치하여 여분의 물을 흡수하십시오. 식물의 견고성과 트랩의 크기에 따라 8-10 개의 식물 개인을 선택하십시오.
   2. 트래핑 기관을 베어링 잎 노드를 계산하여 대략 동등한 부분으로 각 촬영을 분할합니다. 각 촬영 세그먼트는 젊은, 중년, 오래된 함정을 나타내는 혼합 샘플을 수집하는 역할을합니다.
   3. 연동 펌프에 샘플 수집을 위해 얇은 유리 모세관과 Eppendorf 바이알을 부착합니다. 트랩 개구부에 모세관 팁을 삽입합니다. 진공 펌프를 사용하여 각 트랩에서 900 ±100 μL까지 각 트랩에서 모든 유체를 빨아들이고 각 트랩 연령 범주에 대해 수집됩니다.
   4. 프로티스탄 방목 실험을 위해 풀링된 트랩 유체의 200 μL의 삼중 하위 샘플을 사용하십시오. 섹션 3에 자세히 설명된 대로 즉시 처리합니다. 아래에 자세히 설명된 바와 같이 유체에 서식하는 미생물 성분의 다른 모든 분석을 위해 샘플의 나머지 ±300 μL을 보존하십시오.
   5. 섹션 2로 즉시 진행합니다.

2. 수집된 샘플의 고정

1. Exp I 및 II: 각 샘플에서 2% 최종 부피:부피 농도를 얻기 위해 적어도 1시간 동안 포름알데히드와 함께 세균 열거용 물/트랩 유체 하위 샘플을 수정합니다(섹션 4; 약 20 mL 및 0.3 mL).
   참고: 포름알데히드를 연기 후드에서만 다루고 샘플을 조작하는 동안 항상 장갑을 착용하십시오.

3. 샘플 여과

1. 시료 희석(Exp I): 저수지 물 샘플에 희석이 필요하지 않습니다. (Exp II): 에피소레센스 현미경 을 통해 계산하기 전에 필터 표면에 대상 미생물의 적절한 분포를 달성하기 위해 입자가없는 MQ 물로 트랩 유체 샘플 10x-100x를 희석하십시오.
2. 여과 깔때기(직경 25 mm)를 사용하여, 검은 0.2 μm 기공 크기 필터에 세균 계수용 트랩 유체의 서브샘플의 저수지 물 또는 10-30 μL(Exp II)의 1-2 mL(Exp I)을 여과한다.
3. DAPI (4', 6-diamidino-2'-페닐린돌 디하이드로 클로라이드, 0.2 % 최종 농도)로 필터를 4 분 동안 얼룩.
   참고: 피부와 작업 표면 오염을 피하고 장갑을 착용하십시오.
4. 농축 된 미생물이있는 필터를 현미경 슬라이드에 침지 오일 한 방울 (형광 현미경용)에 놓습니다. 다른 오일 드롭을 필터 중앙에 놓고 커버슬립으로 덮어 오일이 고르게 분포되도록 합니다.
5. 이 시점에서, 바람직하게는 시료를 즉시 처리하거나, 대안적으로, 추가 분석이 될 때까지 몇 주에서 몇 달 동안 냉동고(-20°C)에 저장한다.

4. 필터에 세균 번호의 열거

1. 슬라이드를 에피오레시크 현미경 아래에 놓습니다(불소DAPI에 해당하는 필터 세트 포함). 10 x 10 카운트 그리드를 안구 중 하나에 놓습니다. 슬라이드를 임의의 위치로 이동합니다.
2. 계수 그리드 의 영역에서 세균 세포 (청색 형광)를 정량화합니다 (배율 1000x 아래). 카운트에서 계수 그리드의 왼쪽 및 위쪽 가장자리를 가로지르는 셀을 포함하면서 오른쪽 및 아래쪽 가장자리에 있는 셀을 제외합니다.
3. 다른 임의 위치로 이동하고 총 계산 500 셀에 달하는 적어도 10-15 카운트 그리드에서 열거를 반복합니다.
4. 필터의 총 유효 여과 영역에 대한 한 그리드 면적의 비율에 대한 지식을 바탕으로 주어진 현미경 및 배율에 대한 변환 계수를 설정합니다. 그런 다음 계산된 그리드 수로 계산된 총 셀 수를 나누어 그리드당 평균 박테리아 수를 산출합니다.
5. 후자의 매개 변수에 설정된 변환 계수에 곱하고 샘플의 mL당 결과 수를 정규화하여(여과된 샘플의 부피에 따라 다름) mL당 총 세균 풍부도를 얻습니다.

5. 프로티스탄의 풍요로움을 결정하다

1. 글루타랄데히드(1% 최종 농도, 고정 후 며칠에서 몇 주까지 처리되는 엽록소 함유 입자가 있는 샘플에 더 적합) 또는 사용 시료(Exp I) 또는 트랩 유체(Exp II) 하위 샘플을 수정하거나 formol-thiosulfate 탈색 기법 아래에 명시된.
   참고 : 두 보존 기술은 프로티스트 8의 식품 액구에서 섭취된 물질의 예를 들어 방지합니다.
2. formol-thiosulfate 탈색 기술에 관해서는, 물/트랩 유체 하위 샘플의 20 mL/200 μL에 Lugol 용액의 100 μL/1 μL을 각각 추가합니다.
3. 붕산 완충 포르말린0.5 mL/50 μL을 첨가한 다음, 3% 티오설페이트 나트륨(익스펙 I/Exp II)의 20 μL/2 μL을 첨가한 후 즉시 사용하십시오.
   참고 : 나트륨 티오설페이트는 루골의 황색을 탈색하여 상피 현미경^8하에서세포를 관찰 할 수 있게합니다.
4. 1 μm 모공 크기의 검은 폴리 카보네이트 필터에 (대상 protists의 수에 따라) 샘플의 알려진 볼륨을 필터링합니다.
5. 프로티스트 종의 수를 추정하는 것은 계수 그리드를 사용하여 배율 600x 하에서 적어도 200개의 세포를 계수함으로써 이다(위 참조).
6. 여과 깔때기의 진공 하에서 낮은 진공으로 약 2 mL로 시료의 부피를 줄입니다. 이어서, 저압을 방출하고 DAPI 플루오로크롬(4',6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드^13,0.2% 최종 농도)을 2분 동안 첨가한다.

6. 플랑크톤 샘플에서 섬모의 커뮤니티 구조 결정

참고 : 담수 서식지의 섬모 지역 사회는 매우^{다양14,15,16,18,}그리고 그들의 현미경 결정은 도전이다. 섬모 군을 기능성 길드^{10,14,16,17로} 분류하면 원골균으로 다른 섬모 그룹을 보다 자세하게 분석할 수 있습니다.

1. 다음을 결합하여 섬모 커뮤니티 구조를 평가합니다.
   1. Epifluorescence 현미경 검사법에 있는 DAPI 염색한 견본 (다양한 크기 및 형태학의 거시및 마이크로 핵의 밝은 형광으로 섬모 세포를 현지화하기 위하여) 형광표지박테리아의 섭취와 결합 (FLB^8;세부 사항, 아래 참조), 박테리아에 먹이 섬모의 능력을 추적.
   2. 선택한 경우^17,19에서라이브 샘플 관찰 . 섬모를 다른 분류학적 범주로 그룹화하는 데 사용되는 위의 접근 방식과 기준에 대한 자세한 내용은 이전 간행물^16,17을참조하십시오.
      참고: 인용된 연구에 따르면 섬섬 중에서 잡식성 종인 스티토트리히아(제네라 할테리아 및 펠라고할테리아)와올리고트리히아(즉, 리모스트롬비디움 종)가 가장 중요한 원양 소비자라고 합니다. 담수 서식지의 대부분에서 박테리오 플랑크톤^10,17,18.

7. 섬모 방목 율 추정

1. 평균 트레이서 수의 변화에 기초하여 박테리아에 대한 섬모의 섭취 율을 계산[즉, 인큐베이션 시간(5-15분)]과 관련된 섬모 당 FLB^8과 FLB의 트레이서 양이 추가되어 총 박테리아의 5%-15%를 차지합니다.
2. 다른 protistan 종 중 의 관양 비율을 비교하기 위하여는, 실제 인큐베이션 시간 및 추적자 FLB의 비율에 근거한 계산을 가진 시간당 박테리아의 수로, 처리 비율을 정규화합니다 FLB 추가했습니다.
   참고: FLB 방법 적용의 일반적인 방식은 천연 샘플에서 세포 또는 종별 및 벌크 박터리 비율을 모두 추정하는 도 1에도시되어 있다.
3. 민물 환경에 토착 세균 균주에서 FLB의 제조⁸
   1. 적절한 크기(평균 세포 부피 = MCV)와 박테리아의 형태를 선택하여 조사중인 수중 시스템에서 박테리오 플랑크톤 / 박테리아 세포의 전형적인 크기를 효과적으로 모방하십시오.
      참고: Exp I의 경우, 림노바산과 폴리뉴클레오박터 속의 연구 위치에서 분리된 균주의 혼합물을 사용하였다(즉, 호수와 연못에서 전형적인, 매우 풍부한 박테리오플랑크톤)20. 균주의 형태와 크기에 대한 자세한 내용은 이전 간행물^{3,17,18,21을}참조하십시오.
   2. 초기 고정단계에서 15분 동안 원심분리(5,000 x g)에의해 배양으로부터 세균 세포를 수확하고 선택한 위치에서 박테리아의 전형적인 MCV에 대응하는 혼합물에서 세포의 MCV±SD를 산출하는 수치 비율로 혼합한다.
   3. 인산완식염수의 10 mL에서 펠릿을 일시 중단합니다(PBS; pH = 9).
   4. 인산염염수 완충액내의 세포 현탁액에 노랑-녹색 형광 염료 5-(4,6-디클로로트리아진-2-yl) 아미노플루오레세인(DTAF, 단백질에 결합)을 첨가하고, 2시간 동안 60°C 수조에서 배양한다.
   5. 인큐베이션 후, 세포를 아래로 원심분리하고, DTAF 용액을 분해하고, PBS로 3x를 세척 및 원심분리기를 한다.
   6. 최종 세척 후, PP i-식염수 완충제의 20 mL에서 세포를 다시 중단한다.
   7. FLB 현탁액 및 파이펫 1.5 mL aliquots를 2 mL 저온 바이알로 소용돌이한 다음, 사용 될 때까지 PP_i-식염수 완충액에서 냉동 (-20 °C에서)을 유지합니다.
   8. 다음 단계에서사용하기 위해 0.2 μm 폴리카보네이트 필터를 통해 PP i-식염수 버퍼를 사전 필터한다.
   9. FLB 농도를 결정하려면 입자가없는 PP_i-식염수 버퍼의 2 mL에 작은 aliquot (일반적으로 20-40 μL)를 전송하고, 몇 번의 2 s 버스트에 대해 30W에서 초음파 처리한 다음 epifluorescence를 통해 열거하기 위해 0.2 μm 폴리 카보네이트 블랙 필터에 필터링하십시오. DTAF(448 nm/520-540 nm)에 대한 광학 필터 설정에서 현미경 검사법(1,000X 배율)을 제공합니다.
4. 섬모 박테리아의 추정을 위한 트레이서 기술
   1. 자연 플랑크토닉 서식지에서 방목 실험을 위해 300 mL 샘플을 잘 헹구고 1L 플라스크에 넣고 15 분 동안 현장에서 배양하십시오 (프로티스트가 취급 충격에서 회복 할 수 있도록).
   2. FLB 추적기를 추가하여 총 박테리아의 5%-15%를 구성하고 계절과 수온에 따라 양을 추가합니다.
      참고 : 매우 광범위하고 계절에 따라 달라지는 스펙트럼이 있으며, 여러 계급의 크기에 걸친 종별 섭취량 (즉, 시간당 10^-10-1 박테리아 섬모^{-1)에서 10,16, 17,18,22,23,24}.
   3. 높은 섭취 율 (일반적으로 여름 동안)와 섬모의 향상된 발생의 기간에, 또한 매우 낮은 FLB 추가와 병렬 배양을 실행, 만 구성 2%-4% 추적자 FLB에 의해 섬모 액포의 과도 하 중 하 중 을 피하기 위해 총 박테리아의 (참조) 그림 2)의예입니다.
   4. 5-15 분 동안 FLB와 섬모 / 플랑크톤 샘플을 인큐베이션.
   5. 프로티스트^8의식품 액구에서 섭취 된 물질의 예를 들어 방지하기 위해 샘플 고정을위한 두 가지 가능성이 있습니다. 1% 글루타랄데히드(조류와 같은 엽록소 함유 입자가 있는 시료에 더 적합한 최종 농도)를 첨가하여 배양을 종료합니다. 또는, 루골 용액의 100 μL/10 μL을 20 mL/200 μL의 물/트랩 유체 하위 샘플에 사용하고, 바로 그 다음에 붕산성 완충포르민의 0.5 mL/10 μL을 추가한 다음 3% 나트륨 티오술페이트(Exp I/Exp II)의 200 μL/2 μL을 첨가합니다.
5. 고정식을 첨가한 후, 섬모 세포의 철저한 보존을 보장하기 위해 4°C에서 암흑 속에서 적어도 1시간 동안 시료를 쉬게 한다.
6. 4-30 mL/10-30 μL (Exp I / Exp II, 각각; 부피는 섬모 풍부에 따라 다름) 및 DAPI (최종 농도 0.2 % wt / vol; 자세한 내용은 위의 단계 3.2 참조)에서 자연 플랑크톤 하위 샘플을 가져 가라.
7. 1 μm 블랙 필터를 통과하고 epifluoresccccins현미경을 통해 검사하여 섬모 (600x 배율)를 계산하고 이전 간행물^2,17에 자세히 설명된 대로 섭취 된 FLB 추적기의 수를 열거하십시오 (대부분 1000x^배율). . 보존 후 7일 이내에 시료를 검사하십시오.
8. 총 원생 동물 / 종 별 방목을 추정하기 위해, 모든 섬모의 평균 섭취량을 곱하거나 현장에서 검출 된 섬모 종만 곱합니다.
9. Římov 물 저수지에서 의 한 체 데이터에서 셀 당 통풍구 비율의 계산의 예는 다음과 같이 설명된다:
   1. 세균 농도가 3.55 x 10⁶ 박테리아 /mL이고 트레이서 FLB가 추가 된 추적자가 0.25 x 10⁶ FLB / mL이라고 가정하면 총 세균 입자의 합계가 3.8 x 10⁶ 박테리아 / mL (천연 박테리아 + FLB = 먹이 입자의 100 %)을 산출합니다. 자연 샘플에서 식어 영양 프로티스트에게 사용할 수 있습니다.
      참고: 이렇게 추가된 FLB 추적자는 총 세균 입자의 6.58%(0.25/0.038의 프로젝트)를 나타냅니다. 할테리아 스p. 당 FLB의 평균 수는 5 분 배양에서 6.2 FLB이다.
   2. 시간당 섭취량을 정상화하려면 다음 계산을 사용하십시오: (6.2 x 12)/(6.58/100) = Halteria 세포/h당 1131개의 박테리아.
      참고: 할테리아 sp. 가변 수온하에서 검출된 Halteria sp. 및 트레이서 FLB의 양(백분율)이 추가된 분포의 분포에 대한 자세한 예는 그림 3을참조하십시오.

결과

실시예 실험은 지모프 저수지(South Bohemia, CZ)에서 실행되었는데, 이는 현장 포식자와 먹이 풍부도에서 자연이 낮은 자연지대이다. 대표적인 데이터는 피코플랑크톤(&2 μm) 입자^10,16,17,18의 풍부하고 효율적인 방목인 잡식성 섬모 종 할테리아 그란디넬라에대해 보고되고 있다. ^,

토론

수생 시스템에서 영양 상호 작용을 해독하는 것은 항상 도전^28,특히 protists와 그들의 먹이, 박테리아를 포함하는 나노 플랑크톤 규모에서. 영양 섭취 경로 및 정량화에 관해서, 성공적으로 높은 영양 수준에서 사용 하는 방법의 응용 프로그램은 덜 가능, 생물 학적 상호 작용의 높은 복잡성으로 인해. 여기에는 예를 들어 안정적인 동위원소 라벨링 접근법이 포함됩니다. 이 프로토...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-µm pore-size filters	SPI supplies, https://www.2spi.com/	B0225-MB	Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
Automatic pipettes with adjustable volumes	Any brand, various sizes
Centrifuge	22 000 x g
Cryovials	Any brand, 2 mL size
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	Any brand		1 mg ml-1
Epiflorescence microscope	Magnification from 400 x up to 1000 x
	Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range
	Counting grid in one of the oculars
Filtering apparatus	Usually with a diameter of 25 mm
Formaldehyde	A brand for microscopy
Glutaraldehyde	A brand for microscopy
Immersion oil for microscopy	Specific oil with low fluorescence
Lugol´s solution	Any brand or see comment		Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve  10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate  to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix
Methanol stabilized formalin	Any brand available for microscopy purposes
Microscope slides and cover slips	Any brand produced for microscopy purposes
MQ water for diluting samples	Any brand
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9)	Any brand		0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9
PPi-saline buffer	Any brand		0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl
Sampling device	Appropriate for obtaining representative sample		e.g. Friedinger sampler for lake plankton
Sodium thiosulfate solution	Any brand		3% solution is used in the protocol
Sonicator	Any brand		30 W
Vortex	Any brand allowing  thorough mixing of the solutes and samples
Water bath	Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C