Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

Riepilogo

Vi presentiamo un piccolo protocollo di riparazione della libreria di RNA dettagliato con meno distorsione rispetto ai metodi standard e una maggiore sensibilità per 2'-O-metilRNA. Questo protocollo può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa per risparmiare sui costi o utilizzando kit per comodità.

Abstract

Lo studio dei piccoli RNA (sRNA) da parte del sequenziamento di nuova generazione (NGS) è messo in discussione da problemi di pregiudizio durante la preparazione della libreria. Diversi tipi di sRNA come i microRNA vegetali (miRNA) portano una modifica di 2'-O-metile (2'-OMe) al loro nucleotide terminale 3'. Questa modifica aggiunge un'altra difficoltà in quanto inibisce la legatura dell'adattatore da 3'. In precedenza abbiamo dimostrato che le versioni modificate del protocollo "TruSeq (TS)" hanno meno pregiudizi e un miglioramento del rilevamento di 2'OMe RNA. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo 'TS5', che ha mostrato le migliori prestazioni complessive. TS5 può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa o reagenti dal kit TS, con le stesse prestazioni.

Introduzione

I piccoli RNA (sRNA) sono coinvolti nel controllo di una diversità di processi biologici¹. Gli sRNA normativi eucarioti sono in genere di dimensioni comprese tra 20 e 30 nt; i tre tipi principali sono i microRNA (miRNA), gli RNA che interagiscono con il piwi (piRNA) e i piccoli RNA interferenti (siRNA). I livelli di espressione dell'aberrro miRNA sono stati implicati in una varietà di malattie². Ciò sottolinea l'importanza dei miRNA nella salute e nelle malattie e la necessità di strumenti di ricerca accurati e quantitativi per rilevare gli sRNA in generale.

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un metodo ampiamente utilizzato per studiare gli sRNA. I principali vantaggi di NGS rispetto ad altri approcci, come le tecniche quantitative PCR o microarray (qPCR), sono che non ha bisogno di una conoscenza a priori delle sequenze di sRNA e può quindi essere utilizzato per scoprire nuovi RNA, e in aggiunta soffre meno di effetti di segnale di fondo e saturazione. Inoltre, è in grado di rilevare differenze di singolo nucleotide e ha una velocità effettiva più elevata rispetto ai microarray. Tuttavia, NGS presenta anche alcuni inconvenienti; il costo di un'esecuzione della sequenza rimane relativamente elevato e il processo multifase necessario per convertire un campione in una libreria per la sequenza può introdurre distorsioni. In un tipico processo di preparazione della libreria sRNA, un adattatore da 3' viene prima legato allo sRNA (spesso purificato in gel dall'RNA totale) utilizzando una versione troncata di RNA ligase 2 (RNL2) e un adattatore predeterminato 3' (Figura 1) in assenza di ATP. Questo aumenta l'efficienza della legatura sRNA-adattatore e riduce la formazione di reazioni laterali come la circolarizzazione sRNA o la concatenazione. Successivamente, un adattatore da 5' è legato da RNA ligase 1 (RNL1), seguito dalla trascrizione inversa (RT) e dall'amplificazione PCR. Tutti questi passaggi possono introdurre bias^3,4. Di conseguenza, i numeri letti potrebbero non riflettere i livelli effettivi di espressione sRNA che portano a modelli di espressione artificiali dipendenti dal metodo. Gli sRNA specifici possono essere sovrarappresentati o sottorappresentati in una libreria e gli sRNA fortemente sottorappresentati possono sfuggire al rilevamento. La situazione è particolarmente complicata con miRNA vegetali, siRNA in insetti e piante e piRNA in insetti, nematodi e mammiferi, in cui il nucleotide terminale 3 ha una modifica 2'-O-metila (2'-OMe)¹. Questa modifica inibisce fortemente la legatura dell'adattatore^5,rendendo la preparazione della libreria per questi tipi di RNA un compito difficile.

Il lavoro precedente ha dimostrato che la legatura dell'adattatore introduce gravi distorsioni, a causa degli effetti di sequenza/struttura dell'RNA^{6,7,8,9,10,11}. I passaggi a valle della legatura dell'adattatore, ad esempio la trascrizione inversa e la PCR, non contribuiscono in modo significativo alla^{distorsione 6,11,12}. La distorsione della legatura è probabilmente dovuta al fatto che le molecole dell'adattatore con una data sequenza interagiranno con le molecole di sRNA nella miscela di reazione per formare co-fold, che possono portare a configurazioni favorevoli o sfavorevoli per la legatura (Figura 2). I dati di Sorefan et al⁷ suggeriscono che RNL1 preferisce un singolo contesto spiaggiato, mentre RNL2 preferisce un doppio filo per la legatura. Il fatto che le strutture di co-piegadelle adattatore/sRNA siano determinate dall'adattatore specifico e dalle sequenze sRNA spiega perché specifici sRNA sono sovrarappresentati o sottorappresentati con un determinato set di adattatori. È anche importante notare che all'interno di una serie di librerie di sRNA da confrontare, devono essere utilizzate le stesse sequenze di adattatori. In fatti, è stato osservato in precedenza che la modifica degli adattatori con l'introduzione di diverse sequenze di codici a barre altera i profili miRNA nelle librerie di sequenziamento^9,13.

La randomizzazione delle sequenze dell'adattatore vicino alla giunzione di legatura probabilmente riduce queste distorsioni. Sorefan e colleghi⁷ hanno usato adattatori con 4 nucleotidi casuali alle loro estremità, designati adattatori "High Definition" (HD), e hanno dimostrato che l'uso di questi adattatori porta a librerie che riflettono meglio i livelli di espressione di sRNA reali. Un lavoro più recente ha confermato queste osservazioni e ha rivelato che la regione randomizzata non ha bisogno di essere adiacente alla giunzione di ligazione¹¹. Questo nuovo tipo di adattatori è stato chiamato "MidRand" adattatori. Insieme, questi risultati dimostrano che una migliore progettazione dell'adattatore può ridurre la distorsione.

Invece di modificare gli adattatori, la distorsione può essere soppressa attraverso l'ottimizzazione delle condizioni di reazione. Il glicole in polietilene (PEG), un agente di crowding macromolecolare noto per aumentare l'efficienza della legatura¹⁴, ha dimostrato di ridurre significativamente la distorsione^15,16. Sulla base di questi risultati, diversi kit "low bias" sono apparsi sul mercato. Questi includono kit che utilizzano PEG nelle reazioni di legatura, sia in combinazione con adattatori classici o adattatori HD. Altri kit evitano del tutto la legatura e utilizzano la poliadenilazione 3' e la commutazione del modello per l'aggiunta dell'adattatore 3 e 5', rispettivamente¹². In un'altra strategia, la legatura dell'adattatore 3' è seguita da una fase di circolarizzazione, omettendo così la legatura dell'adattatore 5'¹⁷.

In uno studio precedente, abbiamo cercato un protocollo di preparazione della libreria sRNA con i più bassi livelli possibili di bias e la migliore rilevazione di 2'-OMe RNA¹². Abbiamo testato alcuni dei suddetti kit "low bias", che avevano una migliore rilevazione di 2'-OMe RNA rispetto al protocollo standard (TS). Sorprendentemente, tuttavia, al momento della modifica (l'uso di adattatori randomizzati, PEG nelle reazioni di legatura e rimozione dell'adattatore in eccesso 3' per purificazione) quest'ultimo ha sovraperformato gli altri protocolli per il rilevamento di 2'OMe RNA. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo basato sul protocollo TS, 'TS5', che ha avuto il miglior rilevamento complessivo di 2'-OMe RNA. Il protocollo può essere seguito utilizzando reagenti del kit TS e un reagente dal kit 'Nf' o, per risparmiare denaro, utilizzando reagenti fatti in casa, con le stesse prestazioni. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la purificazione dello sRNA dall'RNA totale e la preparazione di un adattatore pre-denunciato 3'.

Protocollo

1. Isolamento di piccoli RNA

1. Estrarre l'RNA totale usando reagenti a base di fenolo o qualsiasi altro metodo. Verificare se l'RNA è di buona qualità.
2. Pre-eseguire un 15% gel TBE-urea (vedi Tabella dei Materiali)per 15 min a 200 V.
3. Mentre il gel è in esecuzione, mescolare 5-20 g di RNA totale in un volume di 5-15 l con un volume uguale di colorante da carico formamide (vedi Tabella dei materiali; 95% deionizzato formamide, 0.025% bromophenol blu, 0.025% xylene cyanol, 5 mM EDTA pH 8) in un 200L. Allo stesso modo, mescolare 10 l (200 ng) di scala di RNA piccolo (vedi Tabella dei materiali) con un volume uguale di colorante di carico formamide. Incubare per 5 min a 65 gradi centigradi in un termociclore con coperchio riscaldato, quindi posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio.
4. Caricare la scala e il campione sullo stesso gel con almeno una corsia tra di loro e correre a 200 V fino a quando il bromofenolo blu (blu scuro) è migrato circa due terzi della lunghezza del gel (circa 40 min).
5. Preparare un sistema per eluire l'RNA dal gel come segue: forare il fondo di un tubo di micro centrifuga di 0,5 mL senza nuclesione con un ago da 21 calibro. Posizionare il tubo forato da 0,5 mL in un tubo di micro centrifugatura da 2 mL senza nuclesi.
6. Togliere il gel e incubare a temperatura ambiente con una macchia di gel acido nucleico (10.000 x concentrato; vedi Tabella dei materiali)in 30 mL di acqua per 10-15 min.
7. Guarda il gel su un illuminatore trans 'Dark Reader' (si consiglia vivamente di evitare i raggi UV in quanto ciò potrebbe danneggiare l'RNA) e ritagliare l'RNA campione tra le bande da 17 nt e 29 nt. Trasferire il pezzo di gel al tubo da 0,5 mL dal punto 1.5.
8. Centrifugare il tubo da 0,5 mL nel tubo da 2 mL in una micro centrifuga alla velocità massima per 2 min. Rimuovere il tubo da 0,5 mL, che ora dovrebbe essere vuoto.
9. Aggiungete 300 l di nuclenon-free 0,3 M NaCl al tubo da 2 mL contenente il gel frantumato e ruotate per almeno 2 h a temperatura ambiente o a 4 gradi durante la notte (16 h).
10. Trasferire la sospensione dei pezzi di gel schiacciati in una colonna di spin (vedi Tabella dei materiali)e centrifugare per 2 min alla massima velocità in una micro centrifuga.
11. Aggiungete 1 ll di glicogeno (cfr. tabella dei materiali)e 950 l un po' di temperatura ambiente 100% di etanolo. Incubare per almeno 30 min a -80 gradi centigradi.
12. Centrifuga per 20 min alla massima velocità in una micro centrifuga a 4 gradi centigradi. Togliere il supernatante, lavare il pellet con 800 o lun di freddo 80 % di etanolo. Centrifuga di nuovo per 5 min a 4 gradi centigradi, e rimuovere con attenzione tutti i supernatali. Risospendere l'RNA pellet in 15 gradi di acqua priva di nucleato. Tipicamente, 5-20 ng di piccolo RNA dovrebbero essere recuperati, a seconda della quantità di ingresso totale di RNA (1 ng di piccolo RNA per 1 g di RNA totale di ingresso).
13. Passo aggiuntivo consigliato: Controllare la quantità e la qualità dello sRNA recuperato (ad esempio, mediante elettroforesi gel capillare utilizzando un piccolo kit di RNA; vedi Tabella dei materiali).

2. Preparazione dell'adattatore HD pre-anegato 3'

NOTA: La pre-negazione dell'adattatore HD 3' è stata effettuata in modo simile al protocollo descritto da Chen et al¹⁸. Si noti che l'adattatore preadentale può essere ordinato direttamente (/5rApp / modifica), ma questo è piuttosto costoso.

1. Ordina 5' fosforolato, 3' bloccato 3' oligonucleotide adattatore HD. Vedere la Tabella 1 per la sequenza e le modifiche. Si noti che '3AmMO' è un 3' amino modificatore gruppo, la maggior parte dei fornitori possono produrre oligonucleotide con questa modifica. Diluire in acqua priva di nuclea fino a 100 M.
2. Impostare una reazione di 100 gradi con i seguenti reagenti: 10 ldi di oligo (100 m), 10 lof di T4 RNA ligase buffer (10x), 10 L di ATP (10 mM), 40 L del 50% PEG8000, 5 -L di T4 RNA ligase 1 (50 unità), 25L di acqua senza nucleato. Incubare per una notte a 20 gradi centigradi.
3. Eseguire un'estrazione fenomenolismitale classica dell'oligonucleotide pre-adentata seguita da precipitazioni di etanolo. Aggiungere 100 l di acido (pH 4,5) fenolo: cloroformio e vortice. Girare per 5 min a temperatura ambiente, velocità massima. Trasferire con cura 90 l della fase superiore in un nuovo tubo; aggiungete 10 L di pH di acetato di sodio da 3 M 5,2, 1 L di glicogeno ultra-puro e 250 l di etanolo freddo 100%.
4. Mantenere a -20 gradi centigradi per almeno 30 min. Centrifuga per 30 min alla velocità massima di 4 gradi centigradi. Togliere il supernatante, lavare il pellet una volta con 500 o luna fredda 80% etanolo. In alternativa all'estrazione del fenolo-cloroformio e alla precipitazione dell'etanolo, può essere utilizzato un kit di rimozione dei nucleotidi (vedere Tabella dei materiali). Risospendere in 25 acqua l.
5. Misurare la concentrazione dell'adattatore utilizzando un kit per il rilevamento specifico del DNA a filamento singolo (vedere Tabella dei materiali). Diluire fino a 80 ng/l (10 M).
6. Passo aggiuntivo consigliato: Verificare l'efficacia della preadenlazione migrando 1 o l'insieme di 10 m di adattatore su un gel TBE-urea del 15% (Tabella dei materiali)insieme a oligonucleotide non trattata. L'adattatore pre-negato dovrebbe migrare leggermente più lentamente dell'oligonucleotide non trattato. Se lo si desidera, l'adattatore preadensato può essere purificato in gel; come descritto in precedenza (passaggi 1.2-1.12).

3. Preparazione della libreria - Protocollo TS5

NOTA: Presentiamo qui il protocollo TS modificato 'TS5' che abbiamo descritto in precedenza¹² e che può essere eseguito sia con reagenti dal kit che con reagenti auto-forniti. Va notato che abbiamo ottenuto risultati simili o anche leggermente migliori con un protocollo diverso, 'TS7'. Tuttavia, con TS7 è più difficile eliminare i dimeri dell'adattatore. Abbiamo quindi preferito descrivere TS5 in dettaglio, ma TS7 può essere seguito semplicemente sostituendo gli adattatori. Per TS7 utilizzare le sequenze di adattatori 'MidRand-Like (MRL)'(Tabella 1). Si noti che in questo caso le aree randomizzate si trovano al centro degli adattatori. I Primer per la trascrizione inversa e la PCR si istitreranno alle sequenze a valle dell'area randomizzata nell'adattatore 3' e a monte dell'area randomizzata nell'adattatore 5'. Il sequenziamento inizierà dal primo nucleotide randomizzato nell'adattatore da 5'.

1. 3' legatura dell'adattatore.
   1. Unire 1 luna di adattatore HD pre-adenurato da 3' (10 m) con 1 o l un'RNA di piccolo dna purificato (0,1-1 M) in un micro impianto di fusione da 0,2 mL. Incubare per 2 min a 72 gradi centigradi in un termociclolo, quindi mettere direttamente sul ghiaccio.
   2. Aggiungete 4 - L del 50 % PEG 8000 (soluzione viscosa; pipet lentamente), 1 -L di tampone di ligase di RNA (10x), 1 -L di H₂O, 1 L di T4 RNA ligase2 troncato, e 1 -L di inibitore di RNase. Incubare per notando a 16 gradi centigradi.
2. Eliminazione dell'adattatore 3' non ligato
   1. Aggiungere 10 l di acqua priva di nuclenonri e mescolare bene. Aggiungete 6 -L di 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Soluzione di esaurimento dell'adattatore' dal kit Nf (Tabella dei materiali) e mescolate bene. Aggiungete 40 -L di perline di purificazione magnetica (Tabella dei materiali) e 60 -L di isopropanolo e mescolate bene. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Mettere il campione in un rack magnetico fino a quando la soluzione non appare chiara. Rimuovere e scartare il super-natante.
   3. Aggiungete 180 l di etanolo appena preparato all'80 %. Incubare per 30 dollari, quindi rimuovere. Fare attenzione a utilizzare l'80% di etanolo appena preparato e non incubare con l'80% di etanolo per lunghi periodi.
   4. Ruotare brevemente il tubo e rimuovere il liquido residuo che potrebbe aver raccolto sul fondo del pozzo. Lasciare asciugare le perline per 2 min, quindi risospendere in 22 mL di 10 mM Tris pH 8 o buffer di sospensione dal kit Nf. Incubare per 2 min, quindi magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare chiara.
   5. Aggiungete 6 -L di 3 M NaOAc pH 5.2 o 'Soluzione di esaurimento dell'adattatore' dal kit Nf (Tabella dei materiali) a un nuovo tubo. Trasferire 20 l del supernatante dal passo precedente a questo nuovo tubo e mescolare con il pipettaggio. Aggiungete 40 - L di perline magnetiche e 60 -L di 100% isopropanolo e mescolate bene pipettando. Incubare per 5 min.
   6. Magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare chiara, quindi rimuovere e scartare il supernatante.
   7. Aggiungete 180 l di etanolo appena preparato all'80 %. Incubare per 30 dollari, quindi rimuovere. Take cura di utilizzare appena preparato 80% etanolo e non incubare per con 80% etanolo per lunghi periodi.
   8. Ruotare brevemente il tubo e rimuovere il liquido residuo che potrebbe aver raccolto sul fondo del pozzo. Lasciare asciugare le perline per 2 min e risospendere a 10 gradi di acqua priva di nuclea. Incubare per 2 min, quindi magnetizzare il campione fino a quando la soluzione appare chiara.
   9. Trasferire 9 l.l di supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere 1 - L di T4 RNA ligase tampone (10x) e 1 - L di acqua. In alternativa, aggiungere 2 lofon di ligase buffer dal kit TS.
3. Ligazione dell'adattatore da 5' .
   1. Aggiungere 1 adattatore HD da 5' (10 M; Tabella 1) a un tubo PCR da 200 luna in un termociclore con coperchio riscaldato. Incubare per 2 min a 70 gradi centigradi, quindi mettere il tubo direttamente sul ghiaccio.
   2. Aggiungete 1 OL da 10 mM ATP e 1 L di T4 RNA ligase 1. Mescolare bene pipettando delicatamente. Aggiungere 3 - L di questo mix all'RNA ligated 3' dal passo 3.2.9 e mescolare con la pipa. Incubare per 1 h a 28 gradi centigradi.
4. Trascrizione inversa (RT)
   1. Trasferire l'RNA ligate dell'adattatore di 6 e 5' su un nuovo tubo PCR da 200 litri (mantenere il restante 8 A -80 gradi centigradi per un uso successivo, se necessario). Aggiungete 1 - L di RT primer (10 M; Tabella 1) e mescolare con il pipettaggio. Incubare per 2 min a 70 gradi centigradi, quindi mettere il tubo direttamente sul ghiaccio.
   2. Aggiungere i seguenti reagenti per RT: 2 l'luna di 5 volte il primo buffer di filamento, 0,5 ll di miscela dNTP da 12,5 mM, 1 DTT da 100 mM, 1 l di inibitore di RNase e 1 ll di trascrizione inversa (Tabella dei materiali). Incubare per 1 h a 50 gradi centigradi.
5. Amplificazione PCR
   1. Aggiungere i seguenti reagenti alla miscela di reazione di 12,5 litri di RT: 10 litri di buffer di polimerasi PCR, 2 l di primer P5 universale (10 M; Tabella 1), 2 l of P7-index primer (10 M; Tabella 1), 1 L da 12,5 mM dNTP, 0,5 l di polimerasi di DNA (Tabella dei materiali) e 22 l di acqua. Mantenere la reazione sul ghiaccio fino all'uso.
   2. Eseguire il seguente programma di PCR: 98 gradi centigradi per 30 s, 11 cicli (98 gradi centigradi per 10 s, 60 gradi centigradi per 30 s e 72 gradi per 15 s) e 72 gradi per 10 min. Mantenere la reazione a 4 gradi centigradi quando è terminato.
      NOTA: Per quanto riguarda il numero di cicli PCR: in genere eseguiamo 11 cicli, ma questo dovrebbe essere ottimizzato dall'utente. Provare a eseguire il minor numero possibile di cicli PCR.
6. Purificazione del gel
   1. Eseguire 5, 10 e 20 . Eseguire il gel per circa 1 h a 145 V (fino a quando il blu bromofenolo raggiunge il fondo; questo colorante migra alla posizione 65 bp).
   2. Rimuovere il gel e incubare con macchia di gel acido nucleico (vedi Tabella dei materiali)in acqua per 10-15 min.
   3. Guarda il gel su un "Dark Reader" trans illuminatore (si consiglia vivamente di evitare UV in quanto ciò potrebbe danneggiare l'RNA) e ritagliare la banda della libreria a 150 bp. Preparare un sistema per eluire l'RNA dal gel come descritto nel passaggio 1.5 e trasferire il pezzo di gel al tubo da 0,5 mL.
   4. Centrifuga in una micro centrifuga alla massima velocità per 2 min. Rimuovere il tubo da 0,5 mL, che ora dovrebbe essere vuoto.
   5. Aggiungere 300 l' di acqua priva di nuclenono al tubo da 2 mL contenente il gel tritato e ruotare per almeno 2 h a temperatura ambiente o a 4 gradi durante la notte.
   6. Trasferire la sospensione dei pezzi di gel schiacciati in acqua in una colonna di spin e centrifugare per 2 min alla massima velocità.
   7. Aggiungete 1 ll di glicogeno, 30 di 3 M NaOAc e 975 L di ghiaccio freddo 100% di etanolo. Centrifuga per 20 min alla velocità massima a 4 gradi centigradi.
   8. Risospendere il pellet a 20 gradi l un valore di 10 mM Tris pH8. Utilizzare 1 : L per la misurazione della concentrazione e 1 L per il controllo di qualità.

4. Analisi dei dati

NOTA: la procedura di analisi dei dati descritta di seguito si basa sul sistema operativo Linux Ubuntu 16.04 LTS.

1. Trattamento dei file di sequenza raw
   1. Scaricare i file di sequenza FASTQ generati durante l'esecuzione della sequenza. Se necessario, eseguire il demultiplexing con bcl2fastq2 (versione V2.2.18.12; un manuale può essere scaricato dal seguente collegamento: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      Utilizzare il seguente comando:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1 --aggregated-tiles AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
   2. Rimuovere le sequenze dell'adattatore utilizzando Cutadapt versione 19 1.15.Remove adapter sequences using^{Cutadapt 19} version 1.15. Un manuale può essere scaricato qui: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Utilizzare il seguente comando:
      Percorso_to_cutadapt/ cutadapt -a TGGAATTCTCGGGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz Input_File_Read1 .fastq.gz
      Si noti che la sequenza nel comando corrisponde all'adattatore HD 3' senza i 4 nucleotidi casuali; questi non verranno pertanto rimossi durante questo passaggio.
   3. Utilizzare seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) per la rimozione dei nucleotidi casuali terminali nelle letture di sequenziamento. Utilizzare il comando seguente (nomi di variabili in grassetto):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt .fastq > Output_File_Read1 _trimmed File con estensione fastq
   4. Utilizzare il seguente comando awk per eliminare le sequenze più corte di 10 nt:
      awk 'BEGIN 'FS ' "'t" ; OFS : "n" , intestazione , 0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (lunghezza (seq) > 10) - intestazione di stampa, seq, qheader, qseq ' Output_File_Read1_triturato.fastq > Length_Filtered.fastq
2. Mappatura delle sequenze tagliate
   1. Scaricare il database corrispondente all'organismo di studio da miRBase come segue. Vai su http://www.mirbase.org/ftp.shtml e scarica il file 'mature.fa'. Si noti che le sequenze sono indicate nella notazione RNA. Sostituire i residui U con T con il seguente comando:
      sed -i '/>/! s/U/T/g' mature.fa
      NOTA: Questo produrrà un elenco completo di tutti i miRNA in miRBase, provenienti da una varietà di organismi.
   2. Selezionate le sequenze di miRNA del vostro organismo di interesse con il seguente comando:
      awk 'nome_dell'organismo:print; nr[NR'1]; next; NR in nr' mature.fa >mature_name_of_the_organism_mirs.fa
   3. Eseguire il mapping delle letture al file creato sopra utilizzando Bowtie2²⁰ (versione 2.3.0) senza corrispondenze. Creare innanzitutto un indice per il file con il comando seguente:First, build an index for your file with the following command:
      bowtie2-buildmature_name_of_the_organism_mirs.famature_name_of_the_organism_mirs
   4. Allineare le letture di sequenziamento al database, richiedendo che una lettura sia mappata interamente a un miRNA del database, senza alcuna corrispondenza. A tal fine, utilizzare il seguente strumento:
      bowtie2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -xmature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_FILTERED _ALIGNMENT.sam
      NOTA: l'opzione: --score-min C,0,0 assicura che l'allineamento sia senza corrispondenze. Per una spiegazione dei vari parametri dello strumento, visitare il seguente sito Web: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
   5. Per eliminare le letture non allineate, utilizzare il comando seguente:
      Visualizzazione samtools -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
      NOTA: a seguito di questi passaggi, ora dovresti aver ottenuto le letture allineate, corrispondenti ai miRNA.

Risultati

I passaggi critici sono l'isolamento della piccola frazione di RNA del materiale RNA totale iniziale (Figura 3) e del prodotto biblioteca finale desiderato (Figura 4). Entrambi i passaggi comportano la purificazione del gel di poliacrilammide; piccolo RNA è isolato dal 15% di gel di urea TBE, mentre le librerie finali sono isolate dai gel TBE nativi del 6%. Piccolo RNA isolato dal gel può essere analizzato su un piccolo chip di elettroforesi capillare di RNA (...

Discussione

La preparazione della piccola libreria di RNA rimane impegnativa a causa della distorsione, introdotta principalmente durante le fasi di legatura dell'adattatore. Gli RNA con una modifica di 2'OMe alla loro estremità 3' come miRNA vegetali, piRNA in insetti, nematodi e mammiferi e piccoli RNA interferenti (siRNA) negli insetti e nelle piante sono particolarmente difficili da studiare perché la modifica di 2'-OMe inibisce la legatura dell'adattatore 3'. Un certo numero di soluzioni sono state proposte in letteratura per...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	ThermoFisher	AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	Nex England Biolabs	P0756S
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit	Agilent	5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma Aldrich	CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator	various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs	Kapa Biosystems	KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit	BIOO Scientific	NOVA-5132-05	optional
Novex TBE gels 6%	ThermoFisher	EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15%	ThermoFisher	EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit	ThermoFisher	Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit	ThermoFisher	Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNA Gel Loading Dye (2X)	ThermoFisher	R0641
RNase Inhibitor, Murine	Nex England Biolabs	M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	ThermoFisher	S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	Nex England Biolabs	M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated	Nex England Biolabs	M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder	ThermoFisher	10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit	Illumina	RS-200-0012/24/36/48	optional
UltraPure Glycogen	ThermoFisher	10814010
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher	EI0001
ZR small RNA ladder	Zymo Research	R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes