총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Summary

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다.

Abstract

수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 클러스터링 이벤트를 검출하고 군집의 정도를 측정하는 몇 가지 방법이 적용 가능하다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포의 막에 있는 mEGFP 꼬리표 수용체 동종 복합체의 평균 올리고메릭 상태를 결정하기 위하여 화상 진찰 접근을 기술합니다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&B) 분석을 기반으로 합니다. N&B는 형광 상관분광법(FCS) 및 광자 계수 히스토그램(PCH)과 유사한 방법으로, 형광의 형광 강도의 변동에 대한 통계적 분석을 기반으로 조명 안팎으로 확산되는 형광 의 강도에 대한 통계적 분석을 기반으로 합니다. 관찰 시간 동안 볼륨을 볼 수 있습니다. 특히, N&B는 올리고머 혼합물에서 평균 단백질 수에 대한 정보를 얻기 위해 PCH를 단순화한다. 강도 변동 진폭은 불소의 분자 밝기와 조명 부피 내의 평균 형광부 수에 의해 설명됩니다. 따라서 N&B는 진폭 분포의 첫 번째 및 두 번째 모멘트, 즉 평균 강도와 분산만 고려합니다. 이것은, 동시에, 방법의 강도와 약점이다. 두 순간만 고려되기 때문에 N&B는 혼합물에서 알 수 없는 올리고머의 어금니 분율을 확인할 수 없지만 혼합물의 평균 올리고머화 상태만 추정합니다. 그럼에도 불구하고, 단순히 형광 강도의 시간 변동을 모니터링함으로써, 픽셀 단위로 라이브 셀의 이미지의 상대적으로 작은 시간계 (다른 모멘트 방법에 비해)에 적용 될 수있다. 픽셀당 유효 시간을 몇 마이크로초로 줄여 초 단위로 수집할 수 있으므로 빠른 올리고머화 역학에 필요합니다. 마지막으로, 넓은 세포 지역 뿐만 아니라 하위 세포 구획을 탐구할 수 있습니다.

Introduction

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에 수용체 분자의 평균 올리고메상태를 결정하기 위한 총 내부 반사 형광 수 및 밝기(TIRF-N&B) 이미징 접근법을 설명하며, 수용체 어셈블리를 연결하는 것을 목표로 합니다. 단백질의 생물학적 기능에 역학(그림 1).

세포외 리간드 결합시, 수용체는 그들의 형태, 올리고머화, 잠재적인 공동 수용체 및 막 조성에 따라 세포내 신호 변환을 개시한다. 수용체 올리고머화의 중요성과 보편성에도 불구하고, 세포 신호의 주요 사건으로 인식^{1,2,3,4,5,6, 7,}몇 가지 방법은 클러스터링 이벤트를 감지하고 실험적으로 클러스터링의 정도를 측정 할 수 있습니다^8,9. 공초점 부피(....

Protocol

1. 견본 준비

1. 1일차. 유리 바닥 접시에 100,000-200,000 세포 / mL의 농도에서 완전한 배지에 종자 HeLa 세포. 씨앗 6-8 접시를 복제합니다.
   참고: 이 예에서, 배지는 10% 열 불활성화 된 태아 소 혈청 (FBS), 1 mM 나트륨 피루브, 100 U/ 100 μg 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충됩니다. 여러 가지 복제 요리가 준비됩니다.
2. 2-3일차. 세포가 하위 합류에있을 때, 단백질 플라스미드와 요.......

Discussion

N&B는 셀 모델 및 라벨링 전략의 선택에 몇 가지 예방 조치가 필요합니다. 이미지 캡처 시간 동안 안정적으로 부착된 상태로 유지되는 라이브 셀에만 적용할 수 있습니다. 전체 셀 강성 변위로 인한 추가 변동은 적절한 이미지 복원 접근법^38로처리될 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 세포가 움직일 때, 세포막은 또한 변형되고, 구조 변형, 큰 추가 편광을 일으키, 막 단백질의 분석.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections