Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores

Resumen

Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles.

Resumen

A medida que nuestra comprensión de la neurobiología ha progresado, los análisis moleculares a menudo se realizan en pequeñas áreas cerebrales como la corteza prefrontal medial (mPFC) o núcleo accumbens. El reto de este trabajo es diseccionar el área correcta preservando al mismo tiempo el microambiente a examinar. En este artículo, describimos un método simple y de bajo costo utilizando recursos disponibles en la mayoría de los laboratorios. Este método preserva el ácido nucleico y las proteínas manteniendo el tejido congelado durante todo el proceso. Los cerebros se cortan en secciones de 0,5-1,0 mm usando una matriz cerebral y dispuestos en una placa de vidrio congelado. Las marcas de interés dentro de cada sección se comparan con una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas, y las regiones se diseccionan usando un bisturí frío o un punzón de biopsia. A continuación, el tejido se almacena a -80 oC hasta su uso. A través de este proceso mPFC de rata y ratón, núcleo accumbens, hipocampo dorsal y ventral y otras regiones se han analizado con éxito utilizando qRT-PCR y ensayos occidentales. Este método se limita a las regiones cerebrales que se pueden identificar por puntos de referencia claros.

Introducción

Este trabajo ilustra la disección de regiones cerebrales congeladas para la extracción de ácido nucleico o proteína de alta calidad utilizando una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas¹, como guía. En esta técnica, los cerebros se congelan con flash y se almacenan a -80 oC para su posterior seccionamiento y disección mientras se mantienen en una condición congelada. Este proceso permite al investigador cosechar un gran número de cerebros en una sesión y luego diseccionarlos para una colección precisa de múltiples regiones cerebrales.

La recopilación precisa de regiones cerebrales de interés (ROI) a menudo es necesaria al responder preguntas relacionadas con la expresión de genes y proteínas. Mientras que la farmacología, electrofisiología y optogenética se pueden utilizar en roedores de tipo salvaje o modificados genéticamente para ayudar a dilucidar los cambios moleculares que sustentan los comportamientos observados^2,3,4, la medición de los cambios inducidos en transcriptomes y proteomes se utiliza a menudo para apoyar estos hallazgos. Técnicas como la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR), la hincha occidental, el RNAseq^5,el MAPSeq⁶ y el HPLC⁷ son robustos y relativamente bajos en costo, lo que permite a muchos laboratorios estudiar los cambios moleculares inducidos dentro de las regiones cerebrales pequeñas^2,,4,5,6.

Hay varias maneras de extraer y purificar el ácido nucleico o proteína de las regiones cerebrales^8,9,10,11,12. Muchos laboratorios cosechan regiones cerebrales enfriando y cortando cerebros en hielo en el momento de la cosecha^9,13. Si bien este enfoque puede dar lugar a ácido nucleico y proteína de alta calidad, es algo limitado en el tiempo, ya que la degradación dentro del microambiente del tejido puede tener lugar a estas temperaturas. Esto puede ser particularmente cierto cuando se intenta diseccionar un gran número de animales o IRO en una sola sesión. Mantener las muestras congeladas ayuda a mantener las moléculas diana lábiles mientras que proporciona al investigador tiempo para comparar cuidadosamente puntos de referencia en ambos lados de cada sección en el esfuerzo por recoger muestras relativamente puras. La captura láser es otra forma de recolectar tejido para el análisis de ARN o proteínas de las áreas cerebrales^10. Este procedimiento es superior a la disección mecánica en el que se pueden identificar y aislar ROI muy pequeños y de forma irregular. Sin embargo, la captura láser está limitada por el uso de costosos equipos y reactivos, consume mucho tiempo y también puede ser más susceptible a la degradación de la muestra.

La disección de micropundado en tejidos congelados no es nueva. Los primeros trabajos de Miklos Palkovits y otros describen las técnicas básicas en detalle^14,15. Esta presentación sigue en gran medida el trabajo original, con algunas mejoras para facilitar la eficiencia y disminuir el gasto del equipo necesario. Por ejemplo, las secciones cerebrales se hacen en un bloqueo cerebral congelado en lugar de en un criostato. Esto produce secciones más gruesas que reduce el número de secciones necesarias para recoger muestras de ROI. Este método también disecciona muestras en una placa de vidrio congelado que se sienta en hielo seco dentro de una caja aislada. Esto produce una etapa de subcongelación en el banco en el que trabajar. Las secciones diseccionadas de esta manera son fácilmente manipulables, lo que permite al investigador comparar ambos lados de cada sección con una referencia con el fin de limitar la contaminación de regiones fuera del ROI deseado.

Las ventajas de este protocolo son que 1) el cerebro se mantiene en una condición congelada durante todo el proceso, lo que ayuda a preservar la proteína y el ácido nucleico y da al investigador tiempo para cosechar cuidadosamente los IRO, y 2) los reactivos requeridos son baratos y se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. En este proceso, los cerebros enteros se seccionan a 0.5–1.0 mm en una matriz cerebral y se colocan en una placa de vidrio congelado que se enfría continuamente con hielo seco. Los lugares de interés que se encuentran en el Allen Brain Atlas¹ u otros atlas cerebrales^16,17 se utilizan para identificar las regiones de interés, que luego se diseccionan usando un puñetazo frío o un bisturí. Debido a que el tejido nunca se descongela, las regiones cosechadas de esta manera proporcionan ARN y proteínades de alta calidad para análisis posteriores.

Protocolo

Los animales utilizados en este estudio fueron tratados de una manera ética y humana según lo establecido por las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Indiana y los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

NOTA: Todas las herramientas y superficies deben lavarse con un disolvente adecuado para eliminar las nucleasas¹⁸ antes de comenzar cualquier trabajo.

1. Almacenar cerebros

1. Retire rápidamente los cerebros de ratones de tipo salvaje CD1 adultos eutanasiados que pesen aproximadamente 30 g utilizando un enfoque convencional^{de 13} y congelación de flash durante 60 segundos en nitrógeno líquido o isopentano preenfriado con hielo seco.
2. Almacene los cerebros congelados a -80 oC en papel de aluminio o tubos cónicos hasta su uso.

2. Preparación de la matriz cerebral

1. Veinticuatro horas antes de disección de tejido, coloque una matriz cerebral limpia (ver Tabla de Materiales)en una pila de paquetes de congelador descongelados. Sandwich los lados de la matriz entre dos paquetes de congelador asegurándose de dejar aproximadamente 0,5 cm entre la parte inferior de las ranuras de afeitar y la parte superior de los paquetes de gel(Figura 1A). Coloque papel de aluminio en los extremos para ayudar en el enfriamiento.
   NOTA: Al comprar una matriz cerebral, comprar uno que es lo suficientemente grande como para encerrar todo el volumen del cerebro para ser diseccionado.
2. Coloque la caja que contiene la matriz cerebral y los paquetes de congelador en un congelador de -20 oC con la parte superior entreabierta durante la noche.

3. Configuración de una placa de vidrio congelado

NOTA: El propósito de esta configuración es preparar una superficie congelada en la que diseccionar secciones cerebrales.

1. Coloque el hielo en una caja aislada hasta aproximadamente 5 cm de la parte superior. A continuación, coloque una capa de hielo seco de 2,5 cm sobre el hielo y cúbrala con láminas de plástico negras para ayudar a visualizar la muestra(Figura 1B, Figura 1C).
2. Coloque una placa de vidrio (debe caber en la abertura de la caja) en la parte superior del plástico y coloque hielo seco en la parte superior de la placa en las esquinas lejanas(Figura 1C).
3. Tome la matriz cerebral congelada del congelador e inserte el cerebro para ser cortado del lado de la corteza hacia arriba. Deje que se equilibre a la temperatura en la caja durante 10 minutos.
4. Ajustar la posición del cerebro en la matriz con fórceps fríos para que el seno sagital sagital y el seno transversal se alineen con las ranuras perpendiculares del bloque(Figura 1D). Esto ayudará a garantizar secciones simétricas para facilitar la disección. Toque las puntas de los fórceps para secar el hielo brevemente para enfriar antes de ajustar el cerebro.
5. Una vez que el cerebro esté en posición, coloque una cuchilla de afeitar refrigerada cerca de su centro y presione la hoja aproximadamente 1 mm en el tejido. Agregue cuchillas refrigeradas a los extremos rostral y caudal para ayudar a mantener el cerebro en su lugar(Figura 2A y Figura 2B).
6. Comenzando en el extremo rostral, agregue las cuchillas una a la vez, colocándolas en las ranuras y presionándolas suavemente hacia abajo en el tejido aproximadamente 1 mm(Figura 2B). Continúe agregando cuchillas a intervalos de 1 mm trabajando hacia el extremo caudal.
7. Asegúrese de que el cerebro no cambie durante este tiempo. Alinee las cuchillas horizontal y verticalmente(Figura 2B). Para cortar secciones en anchos de 0,5 mm, se pueden utilizar cuchillas de microtome de perfil bajo (ver Tabla de Materiales). Colóquelos entre las cuchillas de afeitar más grandes(Figura 2C).
8. Una vez que las cuchillas estén en su lugar, presione hacia abajo en la parte superior del grupo con los dedos, la palma de la mano o alguna otra superficie plana(Figura 2C, Figura 2D). Mece el grupo de cuchillas lentamente de lado a lado para moverlas a través del tejido.
   NOTA: Esto puede tardar algún tiempo (1-2 min) y requiere paciencia. Debe haber resistencia a las cuchillas que se mueven a través del tejido. La entrada fácil significa que el cerebro se está descongelando y el bloque debe enfriarse con hielo seco.
9. Cuando todas las cuchillas hayan llegado a la parte inferior de las ranuras, agarre cada lado del grupo de cuchillas y trabaje libre de la matriz balanceándose hacia adelante y hacia atrás.
   NOTA: Tenga cuidado para evitar cortarse en los bordes afilados de las cuchillas.
10. Una vez que el grupo esté libre, coloque la pila, lado rostral hacia arriba, en la placa de vidrio(Figura 2E). Coloque hielo seco al lado y/o en la parte superior de la pila para congelar aún más las muestras para facilitar la separación.
11. Coloque la pila con bordes afilados hacia abajo en la placa de vidrio y separe las cuchillas desplazando la pila entre los pulgares y los dedos. Las cuchillas deben separarse entre sí con secciones unidas.
12. Alinee las secciones en la placa de vidrio de rostral a caudal (Figura 2F).
13. Separe el tejido de las cuchillas flexionando las cuchillas entre los dedos o separándose con una segunda maquinilla de afeitar fría(Figuras 2G,2H,2I).

4. Sección de disección

1. Abra el Allen Mouse Brain Atlas u otra referencia y encuentre los puntos de referencia necesarios para identificar las regiones de interés. Algunos puntos de referencia obvios incluyen la comisura anterior, el cuerpo calloso, los ventrículos laterales y el hipocampo(Figura 3).
2. Voltee la sección a cortar con fórceps refrigerados y asegúrese de que la región a punto de ser recolectada sea consistente en toda la sección. Durante la cosecha, consulte el atlas de referencia a menudo para asegurarse de que se obtiene el ROI correcto.
   NOTA: Una lupa o un microscopio de disección a menudo es útil en este proceso. Una buena iluminación también es esencial. Para ello se pueden utilizar lámparas LED de baja potencia o una lámpara fría (ver Tabla de Materiales).
3. Con un bisturí o punzón limpio, corte en la sección(Figura 4). Preenceles cada herramienta antes de cortarla tocándola brevemente para secar el hielo. Empuje la hoja suavemente pero firmemente en el tejido, balanceándola hacia adelante y hacia atrás para hacer el corte. No empuje demasiado fuerte o el tejido se fracturará.
   NOTA: Las herramientas se calentarán con el tiempo. Las cuchillas ligeramente calentadas pueden ser útiles para hacer cortes limpios y pueden limitar la fractura, pero tenga cuidado de evitar la descongelación del tejido. Enfríe periódicamente las herramientas sobre hielo seco.
4. Una vez que se cosecha un ROI, colóquelo en tubos de 1,5 ml preenfriados y etiquetados. Conservar los tejidos cosechados a -80oC hasta que sea necesario.
5. Procesar el tejido congelado recogido de esta manera mediante la adición de tampón RIPA frío (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS y cóctel inhibidor de proteínas (ver Tabla de Materiales))para extracción de proteínas, o un disolvente que contiene guanidinio (ver Tabla de Materiales)para la extracción de ARN a la muestra congelada y homogeneizar inmediatamente utilizando un Dounce de vidrio o un homogeneizador mecánico (ver Tabla de Materiales). De esta manera, los inhibidores de la proteasa y la nucleasa están en su lugar a medida que la muestra se calienta para proteger las proteínas y los ácidos nucleicos de la degradación.

Resultados

Para validar este método, la corteza prefrontal medial se recogió de ratones machos de tipo salvaje CD1 adultos y ARN y proteínas fueron extraídos y caracterizados. El ARN fue analizado por electroforesis capilar. El ARN degradado muestra una pérdida en la intensidad de las bandas ribosomales 28S y 18S y también muestra los productos de degradación como un frotis entre 25 y 200 nucleótidos(Figura 5A,muestra 1). ARN de alta calidad muestra bandas ribosomales distintas con poca o ningu...

Discusión

Este trabajo describe una técnica para aislar pequeñas regiones específicas del cerebro mientras limita la degradación del ácido nucleico y la proteína. El daño a los tejidos cerebrales ocurre rápidamente una vez que un organismo muere. Esto se debe en parte a una rápida acumulación de glutamato extracelular y la excitotoxicidad resultante que se produce²¹. El ARN mensajero es particularmente vulnerable a la degradación^22,23. La...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 505C	Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice	Braintree Scientific	BS-SS 705C	Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes	Dot Scientific	229443	For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage gel	Invitrogen	NPO323BOX	protein gradient gel
Bioanalyzer System	Agilent	2100	RNA analysis system
Dounce tissue grinder	Millipore Sigma	D8938	Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	Cool lamp
Glass plates	LabRepCo	11074010
HALT	ThermoFisher	78440	protease inhibitor cocktail
Low profile blades	Sakura Finetek USA Inc.	4689
mouse anti-actin antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	JLA20	Antibody
Nanodrop	Thermo Scientific	2000C	Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade	Surgical Design Inc	17467673
Odyssey Blocking buffer	LiCor Biosciences	927-40000	Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125	VWR	10046-866	Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody	Cell Signaling Technology	94725S	Antibody
RNA Plus Micro Kit	Qiagen	73034	Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap	Life Technologies	AM9780
Scalpel handle	Excelta Corp.	16050103
Standard razor blades	American Line	66-0362
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	Used to extract RNA from tissue