Développement d’un modèle d’infection par le poisson zèbre larvaire pour Clostridioides difficile

Résumé

Présenté ici est une méthode sûre et efficace pour infecter les larves de poissons zèbres avec fluorescent étiqueté C. difficile anaérobie par microinjection et microgavage non invasif.

Résumé

L’infection à Clostridioides difficile (CDI) est considérée comme l’une des infections gastro-intestinales les plus courantes associées aux soins de santé aux États-Unis. La réponse immunitaire innée contre C. difficile a été décrite, mais les rôles exacts des neutrophiles et des macrophages dans CDI sont moins compris. Dans la présente étude, les larves de Danio rerio (poisson zèbre) sont utilisées pour établir un modèle d’infection À C. difficile pour l’imagerie du comportement et de la coopération de ces cellules immunitaires innées in vivo. Pour surveiller C. difficile, un protocole d’étiquetage à l’aide d’un colorant fluorescent a été établi. Une infection localisée est réalisée par micro-injection étiquetée C. difficile, qui se développe activement dans le tractus intestinal du poisson zèbre et imite les dommages épithéliales intestinaux dans cDI. Cependant, ce protocole d’infection directe est invasif et cause des blessures microscopiques, qui peuvent affecter des résultats expérimentaux. Par conséquent, un protocole de microgavage plus non invasif est décrit ici. La méthode consiste à aciver des cellules C. difficile directement dans l’intestin des larves de poissons zèbres par intubation par la bouche ouverte. Cette méthode d’infection imite étroitement la voie naturelle d’infection de C. difficile.

Introduction

C. difficile est un bacille gram-positif, spore-formant, anaérobie, et toxine-producteur qui est la principale cause des infections graves dans le tractus gastro-intestinal¹. Les symptômes typiques de l’ICD comprennent la diarrhée, des douleurs abdominales et une colite pseudomembraneuse mortelle, et elle peut parfois entraîner la mort^1,2. Les preuves ont montré que les réponses immunitaires de l’hôte jouent un rôle critique dans la progression et les résultats de cette maladie³. En plus de la réponse immunitaire, le microbiote intestinal indigène est crucial pour l’début et la pathogénie de CDI⁴. Au cours de la dernière décennie, le nombre de cas et le taux de mortalité de l’ICD ont considérablement augmenté en raison de l’émergence d’une souche hypervirulente de C. difficile (BI/NAP1/027)^5,6. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires sous-jacents et du rôle du microbiote pendant l’ICD contribuera à la mise en place de nouveaux développements et progrès thérapeutiques, permettant ainsi un meilleur contrôle de cette épidémie.

Plusieurs modèles animaux, tels que le hamster et la souris, ont été développés pour donner un aperçu de la défense immunitaire contre C. difficile^7,8. Cependant, le rôle des cellules immunitaires innées est encore mal compris, d’autant plus que le comportement inné des cellules immunitaires est principalement dérivé de l’analyse histologique ou des cellules cultivées in vitro. Par conséquent, l’établissement d’un modèle transparent de poisson zèbre pour révéler la réponse immunitaire innée à C. difficile à l’intérieur d’un organisme vertébré vivant facilitera de telles études. Les larves de poissons zèbres ont un système immunitaire inné fonctionnel, mais elles n’ont pas le système immunitaire adaptatif jusqu’à 4 à 6 semaines après la fécondation^9. Cette caractéristique unique fait des larves de poissons zèbres un excellent modèle pour étudier la réponse et la fonction isolées des cellules immunitaires innées en CDI.

Ce rapport décrit de nouvelles méthodes utilisant des larves de poissons zèbres pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires C. difficile et innées, telles que les macrophages et les neutrophiles. Tout d’abord, un protocole de microinjection localisé qui comprend l’inoculum c. difficile et la coloration est présenté. À l’aide de la formation image in vivo confocaltime lapse, la réponse des neutrophiles et des macrophages vers le site d’infection est enregistrée, et la phagocytose des bactéries par les neutrophiles et les macrophages est observée. Cependant, il a été rapporté que l’injection elle-même cause des dommages de tissu et mène au recrutement des leucocytes indépendants de la bactérie^10. Par conséquent, un protocole de microgavage non invasif pour livrer C. difficile dans l’intestin des larves de poissons zèbres est décrit plus tard. Des études antérieures ont démontré que le microbiote gastro-intestinal indigène protège un hôte contre la colonisation de C. difficile¹¹. Par conséquent, les larves de poissons zèbres gnotobiotiques sont également utilisées pour prédisposer les poissons zèbres qui sont infectés ¹². Par la suite, la dissection intestinale est effectuée pour récupérer le C. difficile viable et valider la durée de leur présence dans les voies intestinales de poisson zèbre.

Protocole

Tous les travaux sur les animaux décrits ici ont été effectués conformément à la réglementation légale (EU-Directive 2010/63, licence AZ 325.1.53/56.1-TUBS et licence AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Préparation de l’Agarose à faible fusion, de la plaque de gel et des aiguilles de microinjection/microgavage

1. Dissoudre 0,08 g d’agarose fondante faible(Tableau des Matériaux, agarose A2576) en 10 ml de 30% du milieu danieau (0,12 mM MgSO₄, 0,18 mM Ca [NO₃]₂), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH 7,2) et 17,4 mM NaCl, stockés à température ambiante (RT) pour obtenir une solution de 0,8 %.
   REMARQUE : Des concentrations plus élevées ou plus faibles d’agarose peuvent être utilisées. Cependant, le temps nécessaire pour se solidifier varie selon les marques d’agarose, même à la même concentration.
2. Préparer les aiguilles de microinjection et de microgavage à partir de capillaires en verre (Tableau des matériaux).
   1. Utilisez un puller micropipette avec les paramètres suivants (à noter que les unités sont spécifiques à la traction utilisée ici; voir Tableau des matériaux):aiguilles microinjection (pression de l’air 500; chaleur 400; traction 125; vitesse ' 75; temps - 150); et les aiguilles de microgavage (pression d’air 500; chaleur 400; traction 100; vitesse de 75; temps 150). Utilisez une pointe de microchargeur pour charger 3 'L de H₂O sans nucléane dans l’aiguille tirée.
   2. Introduisez l’aiguille dans l’injecteur et fixez-la correctement. Ajustez l’aiguille à un angle approprié pour l’injection. Fixez la pression d’injection entre 600 à 900 hPa pour l’aiguille microinjection et 200 à 300 hPa pour l’aiguille de gavage.
   3. Placez une goutte d’huile minérale sur le cercle noir de la glissière d’étalonnage. Utilisez des pinces fines pour couper le bout de l’aiguille. Injecter une goutte dans l’huile minérale pour mesurer la taille de la gouttelette.
   4. Pour la microinjection, ajuster le temps d’injection pour obtenir une gouttelette d’un diamètre de 0,10 à 0,12 mm, ce qui équivaut à un volume de 0,5 à 1,0 nL. Pour le microgavage, obtenir une gouttelette d’un diamètre de 0,18 à 0,20 mm, ce qui équivaut à un volume de 3 à 5 nL.
3. Préparer une plaque d’agarose de 1,5 % avec agarose(Table of Materials, 8050) dans un plat Petri de 10 cm dans le milieu de 30 % de Danieau en utilisant un moule en plastique comme moule à microgavage. Conserver à 4 oC pour éviter la dessiccation jusqu’à ce que nécessaire. Chaud à RT ou 28 oC avant l’expérience.

2. Préparation et étiquetage de C. difficile et spores avec colorant fluorescent

1. Préparer une solution de stock de 1 mM d’un colorant fluorescent (Table des Matériaux). Étant donné que le colorant est vendu en 50 aliquots de poudre, ajouter 69 l de DMSO au flacon pour obtenir une concentration de 1 mM de stock.
2. Préparer une solution de travail de 100 MM du colorant fluorescent en ajoutant une solution de stock de 2 l l à 18 L de DMSO dans un tube de centrifugeuse, et bien mélanger.
3. Culture C. difficile (R20291, une souche ribotype 027) en inoculé 10 ml de milieu liquide BHIS avec deux à trois colonies d’une plaque dans une hotte anaérobie sans trembler du jour au lendemain. BHIS est BHI complété avec 0.5% (w/v) extrait de levure et 0.1% (w/v) L-cysteine. Dissoudre 1 g de L-cystéine dans 10 ml de ddH₂O et stériliser par filtration, puis ajouter au milieu autoclaved pour obtenir une concentration finale de 1 g/L. Les plaques sont préparées en ajoutant 15 g/L d’agar-agar au milieu avant l’autoclacation. La culture sélective du C. difficile se fait à l’aide de plaques chromID C. difficile (Table des Matériaux).
4. Coloration C. difficile avec le colorant fluorescent
   1. Récolte C. difficile à un OD₆₀₀ de 1,0 à 1,2 et laver 1x avec 1 ml de 1x PBS (5 000 x g pour 3 min à RT). Resuspendre dans 1 ml de 1 x PBS.
   2. Ajouter 3 ll de solution de travail du colorant fluorescent dans 1 ml de suspension bactérienne. Incuber l’échantillon pendant 15 min à RT dans l’obscurité. Laver le C. difficile taché une fois avec 1 mL de PBS pour enlever le colorant résiduel et le resuspendre en 1x PBS à un OD₆₀₀ de 1,0 (1,0 OD₆₀₀ équivaut approximativement à 10⁸ cfu/mL).

3. Injection de C. difficile taché dans les larves de poisson zèbre

1. Anesthésiez 20 à 30 larves de poissons zèbres à 5 jours après la fécondation (appelée ici 5 dpf) avec 0,02 % à 0,04 % de tricaine (la poudre de tricaïne est dissoute dans de l’eau à double distillation et ajustée au pH 7 avec une solution Tris-HCL de 1 M) dans le milieu de 30 % de Danieau de 10 min avant Injection. Transférer les larves anesthésiées dans un plat Petri frais de 10 cm et enlever l’excédent de 30 % du milieu de Danieau.
2. Placer une goutte d’agarose fondante de 0,8 % sur les larves de poissons zèbres pour couvrir. Ajuster délicatement les larves à une position latérale. Placer le plat Petri sur la glace pendant 30 à 60 s pour permettre à l’agarose fondante de se solidifier. Ajouter 30% du milieu Danieau contenant 0,02% à 0,04% de tricaine pour couvrir l’agarose.
3. Préparer la solution d’injection. Ajouter 1 ll de 0,5 % de phénol rouge dans la solution PBS dans 9 ll de l’inoculum C. difficile teinté de colorant pour visualiser le processus d’injection.
4. Chargez une aiguille de microinjection calibrée avec la solution d’injection à l’aide d’un microchargeur. Montez l’aiguille chargée sur un micromanipulateur et placez-la sous un stéréomicroscope.
5. Ajustez la pression d’injection entre 600 et 900 hPa. Définir le temps d’injection à 0,1 à 0,3 s pour obtenir 0,5 à 1,0 nL. Placez l’aiguille dans le micromanipulateur à un angle de 45 degrés pointant vers les larves encastrées.
6. Placez l’extrémité de l’aiguille au-dessus du tractus gastro-intestinal près du pore urogénital. Percer à travers agarose puis le muscle avec la pointe de l’aiguille, puis l’insérer dans le lumen intestinal et injecter 0,5 à 1,0 nL de C. difficile. Utilisez un microscope à fluorescence pour surveiller les larves injectées et ramasser les larves correctement injectées pour l’imagerie confocale.

4. Génération de larves de poissons zèbres gnotobiotiques

1. Utiliser la méthode de reproduction naturelle bien établie pour générer des embryons de poissons zèbres gnotobiotiques, y compris : la fécondation in vitro, le lavage à l’air d’un milieu contenant des antibiotiques (1 'g/mL amphotericin B, 10 'g/mL kanamycin, et 20 'g/mL ampicillin), le lavage avec 0.1% wt/vol polyvinyl pyrrolidone-iode (PVP-I) solution, et l’incubation des embryons dans une hotte de culture cellulaire¹².
2. Maintenir toutes les larves de poissons zèbres gnotobiotiques dans des conditions gnotobiotiques jusqu’à 5 dpf ou juste avant le gavage. Après le gavage, les larves de poissons zèbres seront transférées dans un incubateur standard mais avec le milieu stérile de 30% de Danieau.

5. Gavage de larves de poissons zèbres

1. Calibrer l’aiguille microgavage telle que décrite à l’étape 1.2.
2. Mesurer le diamètre de la pointe de l’aiguille en plaçant l’aiguille sur une glissière d’étalonnage avec une goutte d’huile minérale. Assurez-vous que la pointe est de 30 à 40 m de diamètre, émoussée et lisse. Jeter les aiguilles pointues ou rugueuses.
   REMARQUE : Les bords pointus des aiguilles peuvent être émoussés par la flamme rapide.
3. Préparer la solution de gavage telle que décrite à l’étape 3.3.
4. Chargez et montez l’aiguille sur un micromanipulateur tel que décrit à l’étape 3.4. Ajuster le micromanipulateur pour positionner l’aiguille à un angle de 45 degrés.
5. Anesthésiez les larves de poissons zèbres mentionnées à l’étape 3.1. Lorsque les larves cessent de bouger, transférez-les dans la rainure d’un moule à microgavage à l’aide d’une pipette Pasteur.
6. Placer une goutte d’agarose fondante de 0,8 % sur les larves de poissons zèbres pour couvrir. Ajustez délicatement les larves, les têtes orientées vers la verticale à des angles de 45 degrés dans la rainure et les queues contre le mur de la rainure. Assurez-vous que les angles des têtes sont à peu près les mêmes afin qu’ils soient alignés avec l’angle des aiguilles de gavage. Placer le moule microgavage sur la glace pendant 30 à 60 s, ce qui permet à l’agarose fondante de se solidifier afin de stabiliser la position des larves.
7. Ajustez la pression d’injection entre 200 et 300 hPa. Fixer le temps d’injection à 0,1 à 0,3 s pour obtenir un volume d’injection de 3 à 5 nL de C. difficile.
8. Actionnez doucement l’aiguille à travers l’agarose puis dans la bouche des larves de poissons zèbres, à travers l’œsophage. Une fois que la pointe de l’aiguille est à l’intérieur de l’ampoule intestinale antérieure, appuyez sur la pédale d’injection pour libérer les bactéries. Remplissez le lumen de l’intestin avec le volume livré. Ne le laissez pas déborder de l’œsophage ou du cloaque. Retirez délicatement l’aiguille de l’embouchure du poisson zèbre.
9. Après le gavage, sauvez les larves infectées de poissons zèbres de l’agarose avec une pointe flexible de microchargeur en coupant d’abord l’agarose loin puis en soulevant les larves. Transférez ces larves dans le milieu stérile de Danieau à 30 %. Rincer les larves dans un milieu stérile deux fois. Transférer les larves dans un plat Petri frais de 10 cm. Les larves seront maintenues jusqu’à 11 dpf.

6. Analyse de microscopie confocale des larves injectées de poisson zèbre

1. Anesthésie rhénaniser les larves de poissons zèbres mentionnées étape 3.1. Faire un trou dans le fond d’un plat Petri de 35 mm avec une glissière en verre attachée au trou, appelée chambre d’imagerie. Transférer les embryons au fond de la chambre d’imagerie avec une quantité suffisante de 30% du milieu de Danieau.
2. Ajouter 200 à 300 l d’agarose fondante faible de 1 % pour couvrir les larves anesthésiées. Puisqu’un microscope confocal inversé est utilisé, placez la région infectée des larves contre la glissière de verre aussi étroitement que possible.
3. Laissez l’agarose se solidifier sur la glace pendant 30 à 60 s. Submergez l’agarose avec 30 % de La tricaine de Danieau contenant 0,02 % à 0,04 %.
4. Imagez les larves avec un microscope à balayage laser confocal(Tableau des matériaux).

7. Dissection de l’intestin de poisson zèbre larvaire pour récupérer le C. difficile viable

1. Isoler les voies gastro-intestinales des larves pour analyser la charge bactérienne. Commencez par euthanasier les larves de poissons zèbres avec 0,4 % de tricaine.
2. Rincer brièvement le poisson zèbre avec le 1x PBS stérile et les transférer dans une plaque d’agarose fraîche.
3. Dissection du poisson zèbre
   1. Insérez une aiguille dans le tronc dorsal des larves de poissons zèbres près de la tête pour immobiliser le poisson zèbre. Retirez la tête derrière les branchies à l’œil d’une lancette.
   2. Insérer la deuxième aiguille au milieu du tronc dorsal. Insérez la troisième aiguille dans l’abdomen du poisson zèbre et tirez l’intestin hors de la cavité du corps.
      REMARQUE : Des soins extrêmes sont nécessaires pour isoler l’intestin intact. S’il est difficile de le faire, effectuer des tractions supplémentaires pour séparer le reste de l’intestin des organes internes restants.
   3. Utilisez une aiguille à microinjection pour transférer de 10 à 15 intestins dans un tube de 1,5 ml contenant 200 l stériles de 1 x PBS.
   4. Homogénéiser les intestins avec un pilon pour perturber le tissu et préparer les homogénéates. Assurez-vous que le pilon atteint le fond du tube pour perturber complètement tous les intestins.
4. Incuber les homogénéités dans le milieu d’élevage C. difficile contenant de la D-cycloserine et de la cefoxitin, avec ou sans taurocholate (TCA, un germinant de spores de C. difficile) dans une chambre anaérobie.
5. Incuber la plaque anaérobie pendant 48 h à 37 oC.
6. Utilisez la culture bactérienne pour 16S rRNA-PCR.
   1. Resuspendre une colonie dans 50 oL de H₂O et la faire bouillir à 95 oC pendant 15 min. Pelleter les débris lysés par centrifugation (14 000 tr/min pour 2 min à RT) et utiliser 2 ll du supernatant comme modèle dans 25 L de RÉACTION PCR à l’aide d’amorces spécifiques C. difficile(Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
   2. Lorsque des bactéries issues de la culture liquide sont utilisées, récoltez 1 ml de culture et lavez une fois avec 1 ml de PBS (14 000 tr/min pendant 2 min à RT). Resuspendre la pastille dans 100 oL de H₂O_dd et traiter comme fait ci-dessus. Pour caractériser davantage les colonies bactériennes, stries sur une plaque BHIS- ou chromID(Tableau des matériaux).

   

Résultats

C. difficile est strictement anaérobie, mais le chromophore des protéines fluorescentes nécessite généralement de l’oxygène pour mûrir. Pour surmonter ce problème, un colorant fluorescent a été utilisé pour tacher les cellules vivantes de C. difficile qui se développaient activement (R20291, une souche de ribotype 027; Figure 1A). À l’aide du système Gal4/UAS, des lignées transgéniques stables de poissons-zèbres ont été générées po...

Discussion

Les méthodes présentées modifient et étendent une approche existante pour infecter les larves de poissons zèbres en effectuant à la fois l’injection et le microgavage^10,14. Il démontre également une approche pour étudier les agents pathogènes anaérobies avec les larves de poissons zèbres²². En outre, le protocole facilite l’analyse des réponses innées de cellules immunitaires in vivo sur CDI et sur la colonisation de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)	Pronadisa	8050	It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain	Thermo Fisher Scientific	B35001	Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth	Carl Roth GmbH	X916.1
Brass (wild-type)			deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396
Capillary Glass	Harvard Apparatus	30-0019	Injection needles
Clostridioides difficile			R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	open-source platform		Image processing
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Horizontal needle puller	Sutter instrument Inc	P-87
L-cysteine	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4)	Carl Roth GmbH	P026
Micro injector	eppendorf	5253000017
Microinjection molds	Adaptive Science Tools	TU1
Leica SP8 confocal microscope	Leica
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Yeast extract	BD Bacto	212750