Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

Riepilogo

Questo protocollo consente la preparazione di sezioni trasversali di semi di cereali (ad esempio, riso) per l'analisi della morfologia dell'endosperma e del granulo di amido utilizzando la microscopia elettronica a scansione.

Abstract

I granuli di amido (SG) presentano morfologie diverse a seconda delle specie vegetali, soprattutto nell'endosperma della famiglia delle Poaceae. La fenotipizzazione dell'endosperma può essere utilizzata per classificare i genotipi basati sul morfotipo SG utilizzando l'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM). Gli SG possono essere visualizzati utilizzando SEM tagliando il kernel (pericarpo, strati di aleurone ed endosperma) ed esponendo il contenuto organellare. I metodi attuali richiedono che il chicco di riso sia incorporato in resina plastica e sezionato usando un microtomo o incorporato in una punta di pipetta troncata e sezionato a mano usando una lama di rasoio. Il primo metodo richiede attrezzature specializzate e richiede molto tempo, mentre il secondo introduce una nuova serie di problemi a seconda del genotipo del riso. Le varietà di riso gessoso, in particolare, rappresentano un problema per questo tipo di sezionamento a causa della natura friabile del loro tessuto endospermatico. Qui viene presentata una tecnica per preparare sezioni di riso traslucide e gessose per la microscopia, che richiedono solo punte di pipette e una lama di bisturi. La preparazione delle sezioni entro i confini di una punta di pipetta impedisce all'endosperma del nocciolo di riso di frantumarsi (per fenotipi traslucidi o "vitrei") e sgretolarsi (per fenotipi gessosi). Utilizzando questa tecnica, è possibile osservare il pattern delle cellule endospermatiche e la struttura di SG intatti.

Introduzione

I granuli di amido (SG) presentano morfologie diverse a seconda della specie vegetale, soprattutto nell'endosperma della famiglia delle Poaceae ^1,2. La fenotipizzazione dell'endosperma può essere utilizzata per classificare i genotipi in base al fenotipo SG utilizzando l'analisi al microscopio elettronico a scansione. Gli SG possono essere visualizzati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) tagliando il kernel e allontanando le pareti cellulari dell'endosperma².

Lo scopo di questa tecnica è quello di preparare facilmente sezioni trasversali di chicchi di riso esclusivamente per la rapida analisi SEM. Lo sviluppo di questa tecnica è stato motivato dalla necessità di un approccio rapido alla sezione trasversale in base al quale i campioni vengono preparati per la microscopia SEM immediatamente prima della visualizzazione utilizzando attrezzature minime.

Questa tecnica prevede l'inserimento del chicco di riso semigreggio nella punta della pipetta per una completa immobilizzazione. Ciò è particolarmente importante quando si sezionino fenotipi di chicchi di riso gessosi, che sono friabili e si sbriciolano facilmente sotto^{pressione 3}. La gessosità è una qualità indesiderabile nel riso poiché influisce sull'aspetto del nocciolo e fa sì che il nocciolo si rompa facilmente durante la lucidatura e la macinazione³. La calcaresità si presenta come un'area opaca in una sezione trasversale del nocciolo che può essere osservata ad occhio nudo; a livello microscopico, la gessosità è caratterizzata da piccoli granuli di amido scarsamente confezionati. Le cause di calcare possono essere genetiche^4,5 o ambientali^6,7.

Le sezioni trasversali dei semi di cereali sono state tradizionalmente preparate utilizzando metodi di fissaggio chimico e sezionamento dopo l'incorporazione del campione nella cera di paraffina o in un'altra matrice solida^4,8,9,10. Nel 2010, il metodo Matsushima è stato introdotto come un modo per evitare la preparazione complicata e dispendiosa in termini di tempo del campione di riso⁴. Questo metodo prevedeva l'inserimento del chicco di riso semigreggio in una punta di pipetta troncata. La punta è tenuta ferma da un trimmer a blocchi e sezioni sottili e parziali dell'endosperma vengono raccolte utilizzando una lama di rasoio portatile. Un'altra tecnica rapida sviluppata nel 2016 ha permesso di sezionare l'intero sottile di un'ampia varietà di semi secchi, comprese le varietà gessose¹⁰. Questi metodi hanno motivato lo sviluppo della tecnica rapida qui presentata.

Questa nuova tecnica è appropriata per i ricercatori che desiderano ottenere sezioni trasversali incrociate intatte di chicchi di riso per la fenotipizzazione dell'endosperma e l'analisi morfologica dell'amido utilizzando SEM.

Questo protocollo rappresenta un adattamento del metodo⁴della punta della pipetta troncata di Matsushima, con diverse modifiche degne di nota: (1) i kernel non vengono assorbiti in nessun punto della tecnica; (2) per preparare le sezioni non sono necessari né un trimmer a blocchi né un ultramicrotomo. In questo studio sono state esaminate una cultivar "traslucida" di tipo selvatico (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) e una linea mutagenizzata "gessosa" di Nipponbare (ssg1, granello di amido scadente1)^4. Queste due cultivar sono state selezionate per l'analisi qui per dimostrare le differenze tecniche e visive nella lavorazione di sezioni di riso traslucido e gessoso.

Protocollo

1. Preparazione della sezione trasversale di riso

1. De-husk noccioli secchi e intatti come mostrato nella Figura 1A.
   1. Allentare le bucce e desollire i chicchi di riso macinando i chicchi tra due tappi di gomma piatti. Rimuovere i chicchi di riso semigreggio dalla pannocchia, se necessario.
   2. Posizionare un singolo kernel su un tappo di gomma piatto su un banco di lavoro (Figura 1B). Assicurarsi che questo tappo rimanga fermo.
   3. Utilizzare un secondo tappo di gomma piatto (Figura 1C) per abradere il nocciolo torcendolo contro il primo tappo di gomma, usando una pressione sufficiente (Figura 1D). Rimuovere le bucce dal nocciolo, facendo attenzione a non frantumare l'endosperma. Rimuovere l'eventuale buccia rimanente usando una pinza fine. Un kernel de-husked è mostrato nella Figura 1E.
2. Usando una pinza fine, inserire un singolo nocciolo decorticato in una punta di pipetta di plastica (dimensione 250 μL, un seme / punta) (Figura 1F). Assicurarsi che l'estremità embrionale del kernel sia rivolta verso l'estremità (conica) della punta della pipetta (Figura 1G).
   NOTA: l'inserimento del kernel in questo modo assicura che il kernel si adatti il più comodamente possibile alla punta della pipetta poiché il kernel è più stretto verso la sua estremità prossimale.
3. Inserire una seconda punta della pipetta da 250 μL per forzare il kernel nella punta della pipetta e per mantenere il kernel immobile durante il sezionamento, facendo attenzione a non danneggiare il kernel o piegare la seconda punta della pipetta (Figura 1H). Il corretto assemblaggio del "telescopio" è indicato nella Figura 1I.
4. Appoggiare l'assemblaggio della punta della pipetta su un banco di lavoro e tenerlo in posizione a mano (Figura 1J). Con l'altra mano, utilizzare una lama affilata per bisturi (n. 20) per tagliare il centro del kernel e tagliare l'estremità della punta della pipetta (Figura 1K). Utilizzando il bisturi tagliare sezioni spesse 1 mm del chicco di riso (Figura 1L).
   NOTA: La sezione del kernel è strettamente racchiusa all'interno di un anulus di plastica (Figura 1M). Lo spessore medio della sezione per tre genotipi esemplari si trova nella Tabella 1. Sezioni significativamente più sottili di 1 mm si frantumano o si sbriciolano. È importante notare da quale parte del nocciolo ha origine ogni sezione se questo esperimento viene eseguito su diverse varietà di riso per il confronto, poiché la morfologia dell'amido varia in tutto l'endosperma¹¹.

2. Microscopia a luce riflessa di sezioni trasversali di riso

1. Utilizzare una pinza fine per posizionare le sezioni trasversali di riso (preparate nella sezione 1) su un pezzo nero di carta nera pesante.
2. Ottenere immagini luminose di sezioni trasversali di Nipponbare utilizzando uno stereomicroscopio con colli d'oca montati per l'illuminazione obliqua, come mostrato nella Figura 1N-S.
3. Osservare la morfologia dell'endosperma con un ingrandimento di almeno 10x.
   NOTA: Qualsiasi sorgente di epilight è preferibile alla microscopia a campo luminoso poiché le sezioni ottenute utilizzando questa tecnica non sono abbastanza sottili da consentire il passaggio della luce.

3. Microscopia elettronica a scansione di sezioni trasversali di riso

1. Posizionare i campioni su un disco di carbonio attaccato a un mozzicone di alluminio e posizionarli su un portacampioni per la riduzione della carica. Rimuovere l'anello di plastica dal supporto della punta della pipetta utilizzando una pinza fine per impedire alla plastica di entrare nell'apparato di vuoto del SEM.
   NOTA: le immagini di cellule endospermatiche, SG e subgranuli sono ottenute utilizzando una macchina SEM desktop che non richiede campioni da rivestire sputter.
2. Ottenere le immagini utilizzando un rilevatore di elettroni retrodiffusi multimodali ad alta sensibilità (BSE) a 10 kV.

Risultati

Le sezioni Nipponbare di tipo selvatico (Figura 2A) e ssg1 (Figura 2B) sono state esaminate sotto tre ingrandimenti: 260x, 920x e 4200x. Questa tecnica consente la preparazione di sezioni di qualità sufficiente per osservare l'intera cellula endospermatica (Figura 3A), granuli di amido composti (Figura 3B) e singoli subgranuli (Figura 3C). I chicchi decorticati richiedono più tempo per la lavorazione rispetto ai chicchi lucidati poiché gli scafi asciutti devono essere rimossi per abrasione prima del sezionamento. Anche i kernel gessosi richiedono più tempo per l'elaborazione rispetto ai kernel traslucidi lucidati, poiché è necessario prestare attenzione a non frantumare il kernel durante il sezionamento. Una sezione di riso adeguatamente preparata deve avere uno spessore di circa 0,9 mm (Tabella 1) con una frantumazione minima o nulla dell'endosperma (Figura 1N) e strati intatti di pericarpo e aleurone (Figura 1O). Il posizionamento improprio del bisturi sulla punta della pipetta durante il sezionamento può portare a sezioni "scheggiate" (Figura 1P). Allo stesso modo, le immagini in campo luminoso di sezioni trasversali ottimali di ssg1 (Figura 1Q) hanno mostrato strati intatti di endosperma, pericarpo e aleurone intatti e disponibili per la visualizzazione (Figura 1R). Una sezione del kernel gessosa rotta (Figura 1S) può ancora essere utilizzabile per la visualizzazione se l'unico scopo è quello di osservare gli SG, ma il modello di cellule dell'endosperma non sarà visibile. Una sezione rotta può essere difficile da gestire per l'analisi. Una maggiore tosatura delle pareti cellulari dell'endosperma è stata osservata nel Nipponbare selvatico, poiché le cellule sono più strettamente imballate e meno friabili rispetto ai chicchi ssg1. Non è stata osservata alcuna cesoiatura delle cellule dell'endosperma nelle sezioni ssg1 e i granuli di amido composti sono intatti.

La Figura S1 dimostra l'affidabilità dei risultati utilizzando la tecnica del "telescopio" per sezionare i chicchi di riso. Le linee di riso identificate come produttori di kernel traslucido – la linea ibrida di amido resistente (RS) di tipo selvatico Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)^12,13,14 ( FiguraS1A) e il mutante generato dal cobalto RS111^13,15 ( FiguraS1B) hanno prodotto sezioni attraverso le quali la luce era visibile utilizzando uno stereomicroscopio. Le corrispondenti immagini SEM hanno rivelato che queste linee producono il fenotipo "normale" dell'endosperma del riso: granuli di amido poliedrico strettamente imballati. I produttori di kernel gessosi, la varietà commerciale Yi-Tang¹⁶ (Figura S1C)e RS4^13,un mutante di RS111¹⁵ (Figura S1D),mostravano sezioni bianche e opache del kernel. Le corrispondenti immagini SEM mostravano una morfologia marcatamente diversa rispetto alla linea di sfondo RS traslucida di tipo selvaggio: i granuli di amido erano rotondi e scarsamente imballati. Il tipo selvatico Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (Figura S1E) e il suo mutante, KMD1 (Kemingdao1), che esprimono il gene Cry1Ab per inibire la predazione degli insetti^17,18,19 ( FiguraS1F) hanno mostrato sezioni e morfotipi di endosperma simili alle linee RS traslucide.

La tecnica qui presentata è ottimale per la preparazione di campioni di chicchi di riso di tipo gessoso per l'analisi fenotipica, ma fornisce anche vantaggi per il sezionamento dei fenotipi traslucidi dei chicchi di riso²⁰: affettare i campioni usando la pressione dall'alto riduce il rischio di frantumazione dell'endosperma e dislocazione. I campioni possono essere facilmente preparati in pochi secondi (Tabella 2). Sono stati analizzati più genotipi utilizzando questa tecnica per testarne l'efficacia (Tabella 3). Come mostrato nella Figura S2, questa tecnica può essere applicata a semi di altre specie. Il modello monocot Brachypodium distachyon produce semi molto duri contenenti solo amido B-granulo²¹, che mancano di puroindolina A, una proteina che conferisce morbidezza ai granuli di amido²². Era ancora possibile ottenere una sezione trasversale intatta (Figura S2A). Ottenere una sezione trasversale intatta da grano tenero bianco invernale (SWWW) è stato impegnativo ma può essere eseguito (Figura S2B). I semi SWWW sono ricchi di puroindolina A e grandi rispetto ai semi di B. distachyon e ai chicchi di riso. Questi semi si sbriciolano frequentemente durante il sezionamento utilizzando l'assemblaggio del telescopio.

Genotipo	Larghezza media della sezione (μm) utilizzando l'assemblaggio del telescopio	Larghezza media della sezione (μm) sezionamento a mano libera
Nipponbare (decorticato)	971,7 ± 152,4ab	1059.571 ± 394,2ab
Xieyou 7954 ·	825,1 ± 128,3byte	1306.187 ± 179,1a
RS4 ·	910,6 ± 165,0ab	1126.694 ± 395.3ab
I mezzi seguiti dalle stesse lettere non sono significativamente diversi a P < 0,01 usando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test di Tukey (n = 10). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software JMP 15.

Tabella 1: Spessore medio della sezione del kernel.

Genotipo	Tempo (i) medio(i)*
Nipponbare (decorticato)	14,7 ± 1,36a
Xieyou 7954 ·	9,81 ± 0,98byte
RS4 ·	11.9 ± 1.28c
*Utilizzo dell'assemblaggio del telescopio.
I mezzi seguiti dalle stesse lettere non sono significativamente diversi a P < 0,01 usando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test di Tukey (n = 10). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software JMP 15.

Tabella 2: Tempo medio di preparazione del campione.

Genotipo	Sfondo	Qualità
Nipponbare	Tipo selvaggio	Traslucido
Granello di amido scadente1 (ssg1)	Nipponbare	Calcareo
Amido resistente (RS) Xieyou 7954	Tipo selvaggio	Traslucido
RS111 ·	Xieyou 7954 ·	Traslucido
RS4 ·	RS111 ·	Calcareo
Yi-Tang, 'New Life', marchio Lujuren	Xieyou 7954 ·	Calcareo
Xiushui 11 ·	Tipo selvaggio	Traslucido
Kemingdao1 (KMD1)	Xiushui 11 ·	Traslucido

Tabella 3: Genotipi di riso esaminati in questo studio.

Figura 1: Preparazione di sezioni trasversali di riso. (A) Nocciolo selvatico di Nipponbare con buccia intatta. (B). Nocciolo posto su un tappo di gomma piatto di quattro pollici di diametro. (C) Le bucce sono state rimosse macinando il nocciolo tra due tappi di gomma che si appongono. (D) La lolla è stata separata dal nocciolo di riso. (E) Primo piano del chicco di riso semigreggio. L'estremità dell'embrione è indicata. (F) Inserimento del nocciolo nella punta della pipetta usando una pinza fine. (G) Il nocciolo è stato depositato nell'estremità distale della punta della pipetta. (H) Inserimento della seconda punta della pipetta per immobilizzare il nocciolo per il sezionamento (l'assemblaggio del 'telescopio'). (I) Il nocciolo di riso è stato inserito comodamente nell'estremità distale della punta della pipetta. (J) Sezionamento del nocciolo di riso all'interno dell'assemblaggio. (K) Primo piano del taglio della sezione. (L) Una sezione del nocciolo racchiusa dall'anulus di plastica. (M) Primo piano della sezione trasversale. (N) Sezione trasversale di Nipponbare selvatico. (O) Primo piano dell'endosperma all'interno della sezione nipponbara selvatica. (P) Sezione povera e non ottimale del kernel Nipponbare di tipo selvaggio. (Q) Sezione trasversale del mutante Nipponbare ssg1⁴. (R) Primo piano dell'endosperma all'interno della sezione ssg1. (S) Scarsa, sottosezione non ottimale di ssg1. Barra (pannelli A, N-S) = 1 mm. Il nocciolo di riso intero e le sezioni sono state fotografate utilizzando uno stereomicroscopio con una fotocamera zoom digitale e luci a collo d'oca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini SEM di sezioni trasversali del kernel. (A) Nipponbare selvatico, una cultivar traslucida. I granuli di amido composti sono stati cementati strettamente l'uno all'altro; (B) Nipponbare mutante ssg1⁴, un fenotipo gessoso. I granuli di amido composti erano scarsamente imballati e mancano della natura cementizia del morfotipo di amido nipponbare di tipo selvatico. Ingrandimento da sinistra a destra: 260x, 920x e 4200x. La lunghezza della barra è indicata nei pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Anatomia microscopica SEM di una sezione trasversale del kernel di Xiushui 11. (A) Una singola cellula endospermatica è delineata in rosso. Ingrandimento 260x. (B) Un granulo di amido composto è delineato in rosso. Ingrandimento 920x. (C) I subgranuli di amido multipli sono delineati in rosso. Ingrandimento 2250x. Le lunghezze delle barre sono indicate nei pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1: Sezioni trasversali di altri genotipi di riso preparati per SEM utilizzando questa tecnica. (A) Amido resistente (RS) Xieyou 7954¹². (B) RS111, un mutante trasparente ad alta RS di 7954¹³. (C) RS4, un mutante gessoso di RS111¹⁵. (D) Yi-Tang, una varietà commerciale di riso ad alto contenuto di amilosio¹⁶. (E) Xiushui 11. (F) KMD1 (Kemingdao1)^17,18,19. Ingrandimento 10x per immagini in campo luminoso. Barra bianca = ingrandimento 1 mm. 2250x per immagini SEM. Le lunghezze delle barre sono indicate nei pannelli. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura S2: La tecnica è utile per altri semi. (A) Sezione trasversale di falso bromo viola (Brachypodium distachyon L. accession Bd21) seme. (B) Sezione trasversale di grano tenero bianco invernale (Triticum aestivum L. cv. Augusta) seme. Campo luminoso, ingrandimento 20x. Barra = 1 mm. Clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

La tecnica qui presentata rappresenta un approccio veloce, semplice e acuto alla preparazione di sezioni trasversali di riso per la visualizzazione SEM desktop. Questa tecnica di sezionamento consente la rapida osservazione della struttura dell'endosperma, della forma, delle dimensioni e del modello delle cellule dell'endosperma, dei granuli composti e della morfologia dell'amido. Ai fini della fenotipizzazione dell'endosperma e dello screening del germoplasma, è fondamentale ottenere un'intera sezione trasversale del nocciolo di riso^4,23,24. È fondamentale inserire il nocciolo interamente all'interno della punta della pipetta per evitare che la pressione della lama del bisturi costringa l'endosperma a sgretolarsi o frantumarsi. A condizione che l'assemblaggio del "telescopio" sia costruito correttamente, i campioni possono essere preparati per la visualizzazione entro 15 secondi(Tabella 2)utilizzando materiali già in mano in un tipico ambiente di laboratorio. Questa tecnica è applicabile alla sezione trasversale di qualsiasi seme ellissoidale di circa quattro millimetri di diametro nel suo punto più largo. I semi dell'erba modello Brachypodium distachyon (Figura S2A) possono essere sezionati in modo simile ma non rimangono racchiusi all'interno dell'anulus. I semi più grandi, come il grano, si fratturano facilmente e richiedono cura durante il sezionamento (Figura S2B).

Tuttavia, ci sono diverse limitazioni alla tecnica presentata qui. Le sezioni ottenute con questa tecnica non sono abbastanza sottili da consentire il passaggio della luce, il che vieta l'uso di questa tecnica per approcci microscopici basati sulla luce trasmessa come il campo luminoso (spessore massimo del campione di 500 μm per le sezioni del nocciolo di riso²⁵) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (spessore massimo del campione 500 nm²⁶ ). L'uso di una punta di pipetta come "matrice" di sezionamento limita anche la dimensione del seme che può essere sezionato usando questa tecnica. Sarebbe necessaria un'ulteriore risoluzione dei problemi per adattare questa tecnica a specie altamente dissimili dal riso e la dimensione della "matrice" è limitata dalla dimensione delle punte delle pipette disponibili per l'acquisto.

Un altro netto vantaggio che questa tecnica fornisce è la qualità dei campioni che possono essere prodotti da chicchi di riso fenotipo gessoso. Vale la pena notare che anche lo studio di Matsushima ha ammesso che era difficile ottenere sezioni trasversali usando quel particolare metodo per i fenotipi gessosi⁴, come replicato in questo studio a scopo di confronto (Figura 1S). Nel loro caso, è diventato necessario fissare chimicamente i loro campioni di riso gessoso e incorporarli in resina per il sezionamento. La nuova tecnica, in combinazione con l'imaging SEM desktop, consente al ricercatore di preparare facilmente sezioni trasversali di chicchi di riso per la microscopia con maggiore consistenza rispetto a senza supporto di immobilizzazione(Tabella 3).

Nella nuova era della fenomica e della metabolomica, è importante monitorare le linee mutagenizzate e le librerie con tag di trasposone per comprendere meglio la funzione e l'importanza dell'amido nei semi. Inoltre, la International Rice Genebank detiene oltre 130 000 accessioni di riso²⁷. Una tecnica di fenotipizzazione rapida dei semi come quella qui presentata accelererebbe la classificazione e il campionamento per la qualità nutrizionale²⁸. Infine, questa tecnica può essere utile alla luce dell'invasione degli impatti dei cambiamenti climatici. Lo stress stagionale ad alta temperatura durante il riempimento del grano era già stato identificato come una delle principali cause di calcare^6,ma studi recenti hanno implicato l'aumento delle temperature globali nell'aumento della gessosità delle rese di riso^7,29. Tale fenotipizzazione accelerata dell'endosperma può aiutare a fornire un'ampia immagine agricola dell'effetto dell'aumento delle temperature globali.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP 15	SAS	N/A	N/A
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100)	Agar Scientific	AGG3347N	N/A
Phenom Pro Desktop SEM	Thermo Scientific	PHENOM-PRO	N/A
Pipette Tips RC UNV 250 µL	Rainin	17001116	N/A
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium	Micro to Nano	10-002012-50	N/A
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm	Thermo Scientific	3120019	N/A
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm	Thermo Scientific	28618256	N/A
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle	Thermo Scientific	5334	N/A
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope	Zeiss	N/A	N/A