Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Resumen

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Resumen

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para visualizar estructuras tisulares específicas, así como la expresión y localización de proteínas. Dos enfoques alternativos son ampliamente utilizados para manejar las secciones de tejido durante el procedimiento de tinción, un enfoque consiste en montar las secciones directamente en portaobjetos de vidrio, mientras que un segundo enfoque, el de flotación libre, permite mantener y teñir secciones fijas mientras están suspendidas en solución. Aunque los enfoques montados en diapositivas y flotantes libres pueden producir resultados similares, la técnica de flotación libre permite una mejor penetración de anticuerpos y, por lo tanto, debe ser el método de elección cuando se van a utilizar secciones más gruesas para la reconstrucción 3D de los tejidos, por ejemplo, cuando el enfoque del experimento es obtener información sobre proyecciones dendríticas y axonales en regiones cerebrales. Además, dado que las secciones se mantienen en solución, una sola alícuota puede acomodar fácilmente de 30 a 40 secciones, cuyo manejo es menos laborioso, particularmente en estudios biomédicos a gran escala. Aquí, ilustramos cómo aplicar el método de flotación libre a la tinción inmunohistoquímica fluorescente, con un enfoque principal en las secciones del cerebro. También discutiremos cómo la técnica de flotación libre puede modificarse fácilmente para adaptarse a las necesidades individuales de los investigadores y adaptarse a otros tejidos, así como a otras tinciones basadas en histoquímica, como hematoxilina y eosina y violeta de cresil, siempre que las muestras de tejido se fijen correctamente, generalmente con paraformaldehído o formalina.

Introducción

La inmunotinción es una práctica de investigación popular que comenzó hace 130 años con el descubrimiento de los anticuerpos séricos en 1890 por Von Behring¹. A principios del^siglo XX, los colorantes se unieron a antígenos y más tarde a anticuerpos como una forma de cuantificar y visualizar reacciones¹, y en 1941 Albert Coons desarrolló las primeras etiquetas de anticuerpos fluorescentes, un descubrimiento que revolucionó la microscopía de luz ^2,3. El término "inmunotinción" abarca muchas técnicas que han sido desarrolladas utilizando este principio, incluyendo Western blot, citometría de flujo, ELISA, inmunocitoquímica e inmunohistoquímica ^3,4. Western blot detecta la presencia de proteínas específicas de extractos de tejidos o células⁵. Las proteínas se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, se transfieren a una membrana y se sondean con anticuerpos. Esta técnica indica la presencia de proteína y cuánta proteína está presente; Sin embargo, no revela ninguna información sobre la localización de la proteína dentro de las células o tejidos. Otro método, la inmunocitoquímica (ICC), marca proteínas dentro de las células, típicamente células cultivadas in vitro. ICC muestra tanto la expresión de proteínas como la localización dentro de los compartimentos celulares⁶. Para detectar y visualizar una proteína específica a nivel tisular, se utiliza la inmunohistoquímica (IHC).

La IHQ es un método que los investigadores utilizan para atacar antígenos específicos dentro del tejido, aprovechando las propiedades químicas del sistema inmune ^7,8. Al generar anticuerpos primarios y secundarios específicos vinculados a una enzima o a un colorante fluorescente, los antígenos de interés pueden ser marcados y revelados en la mayoría de los tejidos (como se revisó en Mepham y Britten)⁹. El término "inmunohistoquímica" por sí mismo no especifica el método de etiquetado que se utiliza para revelar el antígeno de interés; por lo tanto, esta terminología a menudo se combina con la técnica de detección para delinear claramente el método de etiquetado: inmunohistoquímica cromogénica (CIH) para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima, como la peroxidasa; o IHQ fluorescente para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con un fluoróforo, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la tetrametilrodamina (TRITC). La selectividad de IHQ permite a los médicos e investigadores visualizar la expresión y distribución de proteínas a través de los tejidos, a través de varios estados de salud y enfermedad¹⁰. En el ámbito clínico, la IHQ se usa comúnmente para diagnosticar el cáncer, así como para determinar las diferencias en varios tipos de cáncer. IHQ también se ha utilizado para confirmar diferentes tipos de infecciones microbianas dentro del cuerpo, como la hepatitis B o C¹¹. En la investigación biomédica, la IHQ se utiliza a menudo para mapear la expresión de proteínas en los tejidos y es importante para identificar proteínas anormales observadas en estados de enfermedad. Por ejemplo, la neurodegeneración a menudo se acompaña de la acumulación de proteínas anormales en el cerebro, como placas Αβ y ovillos neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. Los modelos animales a menudo se desarrollan para imitar estos estados patológicos, y la IHQ es un método que los investigadores utilizan para localizar y cuantificar las proteínas de interés^10,12,13. A su vez, podemos aprender más sobre las causas de estas enfermedades y las complicaciones que surgen con ellas.

Hay muchos pasos involucrados en la realización de IHC. Primero, el tejido de interés se recolecta y se prepara para la tinción. Podría decirse que la mayoría de los investigadores preparan muestras de tejido fijas, siendo óptima la perfusión del fijador a través del sistema circulatorio ya que preserva la morfología^14,15. También se puede utilizar la fijación posterior de muestras de tejido, pero puede producir resultados inferiores a los ideales¹⁶. Los fijadores de reticulación, como el formaldehído, actúan creando enlaces químicos entre las proteínas en el tejido¹⁷. Luego, el tejido fijo se corta en capas o secciones muy delgadas con un micrótomo, y muchos investigadores prefieren recolectar secciones congeladas con un criostato. A partir de ahí, el tejido se recoge y se monta directamente en un portaobjetos de microscopio (método montado en portaobjetos) o se suspende en una solución (método de flotación libre), como la solución salina tamponada con fosfato (PBS)¹⁸. El método de recolección utilizado está predeterminado en función de las necesidades del investigador, y cada uno de estos dos métodos presenta sus propias ventajas y desventajas.

El método montado en portaobjetos es, con mucho, el más utilizado, con un beneficio importante que es que se pueden preparar secciones muy delgadas (10-14 μm), lo cual es importante, por ejemplo, para investigar las interacciones proteína-proteína. También hay un manejo mínimo de la muestra, lo que disminuye el daño potencial a la integridad estructural del tejido¹⁹. Los investigadores a menudo usan esta técnica con tejido fresco congelado (tejido que se congela inmediatamente con hielo seco, isopentano, etc.), que es muy delicado en comparación con el tejido fijo y se debe tener mucho cuidado para evitar la descongelación de la muestra. Otra ventaja del uso de secciones montadas en guías es que generalmente no se requieren grandes volúmenes de soluciones para teñir⁴. Por lo tanto, los investigadores pueden usar una cantidad menor de anticuerpos costosos u otros productos químicos para completar la mancha. Además, es posible montar secciones de varios grupos experimentales diferentes en la misma diapositiva, lo que puede ser ventajoso, especialmente durante la adquisición de imágenes. Por otro lado, hay algunas desventajas de usar secciones montadas en portaobjetos, sobre todo que la sección de tejido se adhiere al portaobjetos, lo que restringe la penetración de anticuerpos a un lado de la sección, lo que limita el grosor de la sección y la representación 3D del tejido. También puede suceder que durante los lavados, los bordes del tejido y secciones enteras se desprendan del portaobjetos, haciendo inútil todo el experimento. Además, la IHQ generalmente debe realizarse con relativa rapidez cuando se utiliza el enfoque montado en portaobjetos para evitar la degradación del epítopo del antígeno 20,21 con portaobjetos sin procesar almacenados típicamente a -²⁰ o -⁸⁰ °C, a menudo cubiertos y almacenados horizontalmente o en cajas portaobjetos^, lo que resulta en una huella de almacenamiento relativamente grande. Por último, la técnica montada en portaobjetos también puede llevar mucho tiempo si los investigadores deben manejar un gran número de portaobjetos para procesar un gran número de secciones de tejido.

Debido a algunos de estos desafíos utilizando el método montado en deslizamiento, una modificación llamada método de flotación libre se ha convertido en una alternativa popular. Esta técnica entró en la literatura en los años 1960-70 22,23,24, ganando popularidad en la década de 1980 25,26,27,28,29, y ahora es un método bien establecido que consiste en realizar la tinción en las secciones recogidas en suspensión en lugar de adherirse a una diapositiva ^12,30,31 . No se recomienda el método de flotación libre cuando las secciones de tejido son inferiores a 20 μm; Sin embargo, en nuestra experiencia, es el enfoque de elección cuando se van a teñir secciones más gruesas (40-50 μm). Un beneficio distintivo es que los anticuerpos pueden penetrar secciones flotantes desde todos los ángulos y generar menos tinción de fondo debido a un lavado más efectivo, todo lo que resulta en una mejor señalización al obtener imágenes. Además, las secciones se montan en los portaobjetos después del procesamiento, eliminando así la posibilidad de desprendimiento de tejido y disminuyendo el tiempo que ocupa el criostato. El método de flotación libre también puede ser mucho menos intensivo en mano de obra, especialmente para estudios biomédicos a gran escala. Por ejemplo, es posible teñir muchas secciones (18-40) de la misma muestra juntas en el mismo pocillo, lo que ahorra tiempo al realizar los pasos de lavado e incubación de anticuerpos. Además, dado que se puede montar un número mayor (12-16) de secciones por diapositiva utilizando este enfoque, a menudo es más conveniente y más rápido para el investigador ver e imaginar secciones. En particular, durante el montaje de rodajas de tejido en los portaobjetos, las secciones se pueden unir y separar hasta obtener la orientación deseada. Los investigadores también suelen utilizar concentraciones ligeramente más bajas de anticuerpos utilizando el método de flotación libre, y dado que las incubaciones se realizan en tubos de microcentrífuga, los anticuerpos se pueden recolectar y conservar fácilmente con azida de sodio para su reutilización (véase el Paso 5.1). Otra ventaja es que las secciones pueden almacenarse directamente a -80 °C en pequeños tubos de microcentrífuga con solución crioprotectora³², minimizando así el espacio de almacenamiento y maximizando la longevidad de las muestras³³. Una desventaja de usar esta técnica es que las secciones se manejan mucho y, por lo tanto, son propensas a dañarse. Esto, sin embargo, se puede mitigar mediante el uso de bajas velocidades de agitación y rotación, así como la capacitación adecuada de los investigadores sobre cómo transferir las muestras y montar las secciones en las diapositivas.

En conjunto, IHQ es una herramienta establecida y esencial para visualizar y localizar la expresión de proteínas en los campos de investigación clínica y biomédica. La IHQ de flotación libre es un método eficiente, flexible y económico, especialmente cuando se realizan estudios histológicos a gran escala. Aquí, presentamos un protocolo confiable de IHQ fluorescente de flotación libre para la comunidad científica que se puede adaptar en consecuencia para IHC cromogénica y otras tinciones como hematoxilina y eosina o tinción de violeta de cresil.

Protocolo

1. Preparación del tejido para criosección

1. Incruste tejidos fijos en un molde de incrustación apropiado (consulte la Tabla de materiales) para crear un bloque de muestra utilizando una matriz de muestra apropiada (consulte la Tabla de materiales) y congele en hielo seco. Almacene los bloques de muestras a -80 °C hasta que estén listos para seccionar.
   NOTA: Los tejidos fijos se preparan típicamente perfundiendo roedores machos o hembras adultos (aprox. 2,5 – 30 meses de edad) (ratón o rata)³⁴, de acuerdo con el permiso ético disponible, con un fijador apropiado (por ejemplo, formalina al 10%), seguido de pañuelos posfijación en el mismo fijador durante 12 h a 4 °C, lavando los tejidos tres veces con 1x PBS, y colocar los tejidos en 15% y luego 30% de sacarosa en 1x PBS durante la noche o hasta que los tejidos se hundan³⁵. Los investigadores pueden tratar de adaptar este protocolo general a diferentes etapas de desarrollo.

2. Criosección

1. Cuando esté listo para seccionar, aclimatar las muestras en el criostato durante al menos 1-2 h antes de la sección para evitar la rotura del tejido.
2. Usando un criostato, corte el tejido en secciones (20-50 μm) y recoja en insertos de 6 o 12 pocillos (consulte la Tabla de materiales) llenos con 1x solución de PBS.
   NOTA: Dependiendo del grosor de la sección, la cantidad de tejido que se recolectará y el número de insertos de pozo utilizados, cada pocillo contendrá un número variable de secciones que abarcan aproximadamente 10 a 40 rebanadas para el pozo. Por ejemplo, si se secciona un cerebro entero a 40 μm, se recolectarán aproximadamente 18-24 secciones en cada pocillo utilizando insertos de 12 pocillos. Además, las secciones de 20 μm pueden ser algo difíciles de manejar, por lo que se recomienda 40 μm para la tinción a granel (ver Discusión).

3. Almacenamiento de secciones

1. Una vez recogidos, lavar las secciones con 1x PBS recién preparado durante 5 min. Repita 3 veces.
2. Transfiera las secciones en tubos de microcentrífuga de 2 ml llenos de 1-1.5 ml de solución de almacenamiento (para 250 ml, mezcle 70 g de sacarosa, 75 ml de etilenglicol y lleve al volumen con tampón fosfato 0.1 M).
3. Conservar a -80 °C hasta que esté listo para la tinción.

4. Día de tinción I

1. Retire las muestras del congelador y equilibre a temperatura ambiente (RT) durante 10 - 20 min.
2. Vierta las secciones en un inserto de pozo en una placa de 6 pocillos para separar la solución de almacenamiento de las secciones.
3. Mueva el inserto del pozo a otro pocillo que contenga aproximadamente 6 ml de 1x TBS. Lave 3 veces con 1x TBS durante 5 minutos cada una en un agitador orbital usando baja velocidad a RT.
4. Mientras se lavan las secciones, prepare 7 ml (por muestra) de una solución de obstrucción-permeabilización que consista en 1x TBS con 0,3% de Triton X-100 y 3% de suero normal (por ejemplo, suero de caballo normal). Bloquee secciones durante 30 min a RT en agitador orbital, usando baja velocidad.
   NOTA: El bloqueo con sueros evita la unión no específica de anticuerpos a tejidos o receptores Fc no específicos: se recomienda un suero que coincida con la especie del anticuerpo secundario, pero si no está disponible, se puede usar cualquier suero normal de una especie diferente del animal huésped de anticuerpos primario. El detergente Triton X-100 permite una mejor penetración de anticuerpos al permeabilizar el tejido.
5. Preparar 1 ml por muestra de solución de anticuerpos primarios que consista en anticuerpos primarios seleccionados (diluidos adecuadamente) en 1x TBS con Triton X-100 al 0,3% y suero normal al 1% (ver Paso 4.4 Nota). Transfiera secciones del inserto de pozo a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga solución de anticuerpos primarios para unirse al antígeno (s) de interés.
   NOTA: Se pueden usar múltiples anticuerpos primarios (generados en diferentes especies hospedadoras).
6. Colocar un tubo de microcentrífuga de 2 ml con secciones en un mezclador giratorio a baja velocidad (por ejemplo, velocidad de 7 rpm) e incubar durante la noche durante 12-16 h a 4 °C.

5. Día de tinción II

1. Al día siguiente, vierta las secciones en un inserto de pozo en una placa de 6 pocillos para separar las secciones de la solución de anticuerpos primarios.
   NOTA: La solución de anticuerpos se puede recolectar y reutilizar; Agregue azida de sodio al 0,02% (p/v) para inhibir el crecimiento microbiano.
2. Lave las secciones 3 veces con 1x TBS en RT (30 s para los primeros 2 lavados y 10 minutos para el lavado final).
3. Preparar 1 ml por muestra de solución de anticuerpos secundarios que consista en anticuerpos secundarios apropiados (diluidos en consecuencia) en 1x TBS con Triton X-100 al 0,3% y suero normal al 1% (solución protectora contra la luz).
   NOTA: El marcado indirecto con un anticuerpo secundario conjugado amplifica la señal y permite la visualización colorimétrica o fluorescente de la proteína diana.
4. Transfiera las secciones a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga una solución de anticuerpos secundaria. Incubar durante 2 h a RT en un agitador orbital a baja velocidad (solución de protección de la luz).
5. Vierta las secciones en un inserto de pocillo en una placa de 6 pocillos para separar las secciones de la solución de anticuerpos secundaria.
6. Continuando protegiendo las muestras de la luz, lave 2 veces con 1x TBS durante 30 s en RT. Luego lavar durante 15 minutos en 1x TBS, agregue DAPI (1-0.1 μg / ml) si lo desea.

6. Montaje

1. Verter secciones en una cámara histológica rectangular de vidrio llena tres cuartos con 1x TBS.
2. Sumerja una diapositiva de vidrio en el 1x TBS y use un pincel fino para convencer a las secciones hacia la diapositiva.
3. Golpee suavemente las secciones en la diapositiva, asegurándose de que no haya arrugas ni pliegues.
4. Repita hasta que todas las secciones estén montadas en la(s) diapositiva(s).
   NOTA: Cuando un cerebro entero, por ejemplo, se secciona a 40 μm, se recoge en insertos de 12 pocillos con una alícuota que contiene 18-24 secciones; Los sectores generalmente se montan en 1-2 diapositivas, pero también se pueden montar menos secciones por diapositiva según las preferencias del investigador.

7. Cubreción

1. Después de que las secciones se sequen en la(s) diapositiva(s), aproximadamente 10-15 minutos en RT o hasta que las secciones se vean opacas (recuerde proteger las diapositivas de la luz), aplique un medio de montaje acuoso apropiado (endurecimiento o no endurecimiento). Se prefiere el antidecolorante si se utiliza un anticuerpo secundario conjugado fluorescente.
   NOTA: La calidad de fluorescencia puede ser menor cuando se utiliza un medio de montaje de endurecimiento, pero las guías deben durar más tiempo.
2. Usando pinzas, coloque un cubreobjetos encima del medio. Cubra con papel de filtro y presione firmemente hacia abajo para eliminar el exceso de medio de montaje.
   NOTA: Si utiliza un soporte no endurecedor, pinte los bordes de la corredera deslizada con esmalte de uñas transparente para sellar.
3. Secciones de imágenes usando un microscopio apropiado. Conservar en una caja deslizante oscura a 4 °C.
   NOTA: Las secciones se pueden obtener imágenes utilizando una variedad de microscopios, como el escaneo láser confocal y fluorescencia de campo amplio invertida o vertical, con aumentos (por ejemplo, 10x, 20x, 40x) según las necesidades del investigador.

Resultados

El esquema general del uso del método de flotación libre para realizar un ensayo inmunohistoquímico fluorescente se ilustra en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo representativo de IHQ fluorescente utilizando el método de flotación libre en cerebro de ratón que examina la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) con un aumento menor y más alto para ilustrar la calidad general de la tinción. Este enfoque también es apropiado ...

Discusión

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica versátil que se ha vuelto crucial para identificar la expresión y localización de proteínas dentro de las secciones de tejido. Este ensayo se utiliza en toda la comunidad científica para comprender mejor las características del tejido a través de las etapas de la función normal a los estados de enfermedad. La IHQ se emplea en una variedad de campos, desde el diagnóstico clínico de enfermedades como el cáncer hasta los descubrimientos iniciales en la investigación p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042