Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Resumen

Este protocolo presenta el ensayo de brotación coroides, un modelo ex vivo de proliferación microvascular. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales y evaluar los tratamientos farmacológicos utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

Resumen

La angiogénesis coroidal patológica, una característica destacada de la degeneración macular relacionada con la edad, conduce a un deterioro de la visión y ceguera. Los ensayos de proliferación de células endoteliales (EC) que utilizan células endoteliales microvasculares de retina humana (HRMEC) o EC de retina primaria aisladas se utilizan ampliamente en modelos in vitro para estudiar la angiogénesis retiniana. Sin embargo, aislar las células endoteliales de la retina murina pura es técnicamente difícil y las CE de la retina pueden tener diferentes respuestas de proliferación que las células endoteliales coroidales y diferentes interacciones celulares/células. Se desarrolló un ensayo de brotación coroidacional ex vivo altamente reproducible como modelo de proliferación microvascular coroidal. Este modelo incluye la interacción entre la vasculatura coroides (EC, macrófagos, pericitos) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Los explantes de RPE/coroide/escleral de ratón se aíslan e incuban en el extracto de membrana basal (BME) con factor de crecimiento reducido (BME) (día 0). El medio se cambia cada dos días y la brotación coroides se cuantifica en el día 6. Las imágenes de la explanta de coroides individuales se toman con un microscopio de fase invertida y el área de brotación se cuantifica utilizando un macro plug-in semiautomático para el software ImageJ desarrollado en este laboratorio. Este ensayo de brotación coroidal ex vivo reproducible se puede utilizar para evaluar compuestos para el tratamiento potencial y para la investigación de enfermedades microvasculares para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos coroidacionales utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

Introducción

La desregulación de la angiogénesis coroidal se asocia con la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (AMD)¹. La coroides es un lecho microvascular presente debajo del epitelio pigmentario de la retina (RPE). Se ha demostrado que la reducción del flujo sanguíneo en la coroides se asocia con la progresión de AMD^2. La intrincada relación entre el endotelio vascular, RPE, macrófagos, pericitos y otras células es responsable de la homeostasis del tejido^3,4,5. Por lo tanto, un ensayo reproducible que modela el microambiente coroideo es fundamental para el estudio de la DMAE neovascular.

Los ensayos de angiogénesis ex vivo y los cultivos celulares endoteliales in vitro pueden complementar los estudios del comportamiento microvascular in vivo, para la prueba de nuevos fármacos y para estudios de patogénesis. Células endoteliales tales como células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), cerebro animal primario aislado o EC de la retina se utilizan a menudo en estudios in vitro para la investigación de la angiogénesis ocular^6,7,8. Los HDH, en particular, se han utilizado ampliamente como modelo de neovascularización coroidal in vitro (CNV)^{9 mediante} la evaluación de la proliferación endotelial, la migración, la formación tubular y la fuga vascular para evaluar las intervenciones^6,10. Sin embargo, las CE en el cultivo son limitadas como modelo de CNV debido a la falta de interacciones con otros tipos de células que se encuentran en la coroides y porque la mayoría de las CE utilizadas en estos ensayos no se originan en la coroides. Las ECs coroideales de ratón son difíciles de aislar y mantener en el cultivo.

El ensayo de anillo aórtico es ampliamente utilizado como un modelo de proliferación macro vascular. Los brotes vasculares de explantes aórticos incluyen ECs, pericitos y macrófagos¹¹. El ensayo de anillo aórtico modela bien de angiogénesis de vasos grandes^12,13,14. Sin embargo, tiene limitaciones como modelo de neovascularización coroidal ya que los anillos aórticos son un tejido macrovascular que carece del entorno microvascular coroidal característico, y los brotes de grandes vasos pueden diferir de los brotes de redes capilares implicadas en la patología microvascular. Recientemente un grupo publicó un ensayo de retina ex vivo^15,16. Aunque, es adecuado para la enfermedad neovascular de la retina, no es tan apropiado para la neovascularización coroidal como se ve en la DMAE.

El ensayo coral de brotación utilizando RPE de ratón, tejido coroides y explantado escleral fue desarrollado para modelar mejor el CNV. El tejido se puede aislar fácilmente de los ojos de ratón (u otras especies)¹⁷. Este ensayo permite una evaluación reproducible del potencial pro y anti-angiogénico de los compuestos farmacológicos y la evaluación del papel de vías específicas en la neovascularización coroidacional utilizando tejido de ratones modificados genéticamente y controles¹⁸. Este ensayo coral de brotación ha sido referenciado en muchas publicaciones posteriores^{9,10,18,19,20}. Aquí se demuestra el método implicado en el uso de este ensayo.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en boston Children's Hospital (protocolo ARCH número 19-04-3913R).

1. Preparación

1. Añadir 5 ml de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL) y 5 ml y 10 ml de suplementos disponibles comercialmente a 500 ml de medio clásico completo con suero. Aliquot 50 mL del medio inicialmente.
   NOTA: No devuelva ningún medio a la población para evitar la contaminación.
2. Ponga una alícuota de medio clásico completo sobre hielo.
3. Use 70% de etanol para limpiar el microscopio de disección, los fórceps y las tijeras.
4. Preparar dos platos de cultivo celular (10 cm), uno en el microscopio de disección, otro sobre hielo; poner 10 ml de medio clásico completo en cada plato.

2. Pasos experimentales (Figura 1)

1. Sacrificar ratones C57BL/6J alrededor del postnatal (P) 20 usando 75-100 mg/kg de ketamina y 7,5 -10 mg/kg de xiazina inyectada intraperitonealmente. Mantenga los ojos en medio clásico completo sobre hielo antes de la disección.
2. Retire el tejido conectivo (músculo y tejido graso) y el nervio óptico en el ojo.
3. Utilice una micro-tijera para cortar circunferencialmente 0,5 mm posterior al limbo corneal. Retire el complejo de córnea/iris, el vítreo y la lente.
4. Haga una incisión de 1 mm perpendicular al borde de corte hacia el nervio óptico y corte una banda circunferencial de 1 mm de ancho. Separe las regiones central y periférica del complejo. Use fórceps para despegar la retina del complejo RPE/coroide/sclera.
5. Mantener la banda coroidea periférica en medio clásico completo sobre hielo; aislar el otro ojo y repetir el proceso para cortar una segunda banda.
6. Cortar la banda circular en piezas cuadradas iguales a 6o (1 mm x 1 mm).
   NOTA: Nunca toque ningún borde.
7. Descongelar el extracto de membrana basal (BME) por instrucción de fabricación. Añadir 30 l/pozo de BME en el centro de cada pocómo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Asegúrese de que la gota de BME forma una cúpula convexa en la parte inferior de la placa sin tocar los bordes.
   NOTA: Descongele el BME durante la noche en un refrigerador. BME debe estar en el hielo en cualquier momento después de descongelar.
8. Coloque el tejido en el centro de la BME.
   NOTA: No aplanar el explano coroides; generalmente, deje que el tejido se expanda dentro de la BME. La orientación del tejido (lado escleral hacia arriba o hacia abajo) no afecta el resultado experimental.
9. Incubar la placa a 37oC durante 10 min para dejar que el gel se solidifique.
10. Añadir 500 l del medio/pozo clásico completo.
11. Cambie el medio clásico cada dos días (500 l). La brotación de coroide se puede observar después de 3 días con un microscopio.
    NOTA: Para el tratamiento del factor de crecimiento, muera de hambre el tejido durante 4 h. Diluir un compuesto de ensayo en medio reducido por factor de crecimiento (1:200 impulso en lugar de 1:50).

3.SWIFT-Método de cuantificación computarizada Choroid¹⁷ (Figura 2)

NOTA: Se utilizó un método computarizado para medir el área cubierta por los buques en crecimiento. Se necesita un plugin de macro para el software ImageJ antes de la cuantificación (consulte Información complementaria para obtener más detalles).

1. Abra la imagen de brotación de coroides con ImageJ y marque "Imagen | Tipo| 8 bits" con escala de grises.
2. Vaya a"| de imagen Ajustar | Brillo/Contraste (Ctrl/shift/C)" y optimizar el contraste.
3. Utilice la función de varita mágica para perfilar y eliminar de la imagen el tejido coroides que está presente en el centro de los brotes (utilizando la tecla de método abreviado "F1") (Figura 2A,B).
   NOTA: Establezca la tasa de tolerancia de la varita mágica en 20-30%.
4. Elimine el fondo de la imagen con las herramientas de selección gratuitas (Figura 2C). Vaya a"| de imagen Ajustar | Umbral (Ctrl/shift/T)". Utilice la función de umbral para definir los brotes microvasculares en el fondo y la periferia (Figura 2D).
5. Haga clic en "F2" y aparecerá un resumen. Guarde una imagen del área seleccionada haciendo clic en "Guardar". Guarde en la misma carpeta que la imagen original para futuras referencias.
6. Después de medir un grupo de muestras, copie el registro para el análisis de datos.
   NOTA: También es posible medir el área (m2) por"Analizar | Establezca Escala" utilizando imágenes con barras de escala.

Resultados

Comparación del crecimiento de brotes de coroides por día

Diseccionamos la coroides con esclerótica, incrustada en BME y la cultivamos durante 6 días(Figura 1). El coroides que brota en ratones C57BL/6J desde el día 3 hasta el día 6 fueron examinados con un microscopio y cuantificados con SWIFT-Choroid un método de cuantificación semiautomático en ImageJ. En un caso representativo, la zona de brotación coroidal (los vasos que se extiende...

Discusión

El ensayo coral de brotes ayuda a la investigación en NEOvascular AMD^{9,10,18,19,20}. Los explantes de coroide se pueden aislar de ratones, así como ratas y humanos^17,21. El explanto coroides incluye ECs, macrófagos y pericitos^17. En este ensayo la interacción entre las CE cor...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed (Xylazine)	AKORN	59339-110-20
Basal membrane extract (BME) Matrigel	BD Biosciences	354230
Cell culture dish	NEST	704001	10cm
Complete classic medium with serum and CultureBoost	Cell systems	4Z0-500
Ethyl alcohol 200 Proof	Pharmco	111000200	use for 70%
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666
Microscope	ZEISS	Axio Observer Z1
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140	10000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)	Olympus	25-107
VetaKet CIII (Ketamine)	AKORN	59399-114-10