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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo dimostra lo studio degli effetti fisiopatologici del fumo di sigaretta (CS) con un sistema di esposizione all'inalazione di tutto il corpo (WBI) (WBIS) costruito internamente. Questo sistema può esporre gli animali a CS in condizioni ripetibili controllate per la ricerca di effetti mediati dalla CS sull'enfisema polmonare e sull'ematopoiesi.

Abstract

Quasi il 14% degli adulti negli Stati Uniti è stato segnalato per fumare sigarette nel 2018. Gli effetti del fumo di sigaretta (CS) sui polmoni e sulle malattie cardiovascolari sono stati ampiamente studiati, tuttavia, l'impatto della CS su altri tessuti e organi come sangue e midollo osseo rimane incompleto definito. Trovare il sistema appropriato per studiare gli effetti della CS sui roditori può essere proibitivo e richiedere l'acquisto di sistemi disponibili in commercio. Pertanto, abbiamo deciso di costruire un sistema conveniente, affidabile e versatile per studiare gli effetti patologici della CS nei topi. Questo sistema di esposizione all'inalazione per tutto il corpo (WBIS) imita la respirazione e il sbuffamento delle sigarette alternando l'esposizione a CS e aria pulita. Qui mostriamo che questo sistema fai-da-te (fai-da-te) induce infiammazione delle vie aeree ed enfisema polmonare nei topi dopo 4 mesi di esposizione al fumo di sigaretta. Sono inoltre mostrati gli effetti dell'inalazione di CS su tutto il corpo sulle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC) nel midollo osseo utilizzando questo apparecchio.

Introduzione

Il fumo di sigaretta rimane una delle principali cause di malattie prevenibili negli Stati Uniti, nonostante il costante calo del numero di adulti che fumano sigarette negli ultimi 50-60 anni1. È ampiamente noto che il fumo è collegato a molteplici malattie dei polmoni e del sangue tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), un gruppo di malattie che include enfisema e bronchitecronica 2,3,4. Secondo il Center for Disease Control (CDC), nel 2014, la BPCO è stata la terza causa di morte negli Stati Uniti con oltre 15 milioni di americani che soffrono di questa malattia5.

Cs è stato anche recentemente associato a un rischio più elevato di sviluppare ematopoiesi clonale (CH)6,7, una condizione in cui una singola cellula staminale ematopoietica produce in modo sproporzionato una grande percentuale del sangue periferico di una persona. Questa scoperta indica una potenziale connessione tra il fumo e la funzione del midollo osseo. Date le diffuse e altamente significative implicazioni per la salute della CS e dato che i modelli murini di malattie sono una pietra miliare del progresso nella ricerca biomedica, è utile sviluppare sistemi efficienti e convenienti per modellare cs nei topi.

Qui, forniamo una guida passo-passo per la costruzione di un sistema conveniente per il trattamento e lo studio degli effetti in vivo di CS sull'enfisema polmonare e sull'omeostasi del midollo osseo. L'assemblaggio di questa apparecchiatura non richiede all'utente di avere conoscenze specializzate e quindi consente l'assemblaggio fai-da-te.

Protocollo

Tutti gli animali coinvolti negli esperimenti e nello sviluppo di questa tecnica sono stati sotto il nostro protocollo sull'uso animale approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e dalle istituzioni del Baylor College of Medicine e MD Anderson accreditate dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AAALAC).

1. Costruzione dell'apparecchio

  1. Assemblaggio del compressore d'aria con il sistema di valvole.
    1. Collegare i misuratori di portata (due 15 L/min con barra Y e 2 decolli di potenza) al regolatore di pressione in miniatura utilizzando un raccordo per capezzoli maschi filettato da 1/8 pollice. Assicurarsi di utilizzare il nastro di tenuta del filo in tutte le estremità filettate.
    2. Collegare il regolatore di pressione assemblato con il flussometro allo strumento del compressore d'aria medicale utilizzando quanto segue: un capezzolo esagonale da 1/8 pollice sulla presa d'aria del compressore, un raccordo di accoppiamento filettato da 1/8 pollice e un raccordo per capezzoli maschi filettato da 1/8 pollice che si collega al regolatore di pressione.
    3. Installare il connettore spinato girevole ad ossigeno su ogni (4) flussometro.
    4. Installare un adattatore maschile sulla presa d'aria superiore del compressore d'aria (parte inclusa con lo strumento del compressore d'aria medico).
  2. Assemblare le camere di esposizione (fare 4 unità)
    1. Tagliare un tubo di cloruro di polivinile clorurato da 3/4 pollici (CPVC) in otto segmenti da 4 pollici.
    2. Inserire ogni segmento in un raccordo CPVC a gomito da 3/4" da 90° e collegare il lato di raccordo del gomito a un adattatore maschio CPVC di 3/4 di diametro. Dovrebbero esserci otto segmenti CPVC, ognuno collegato a un raccordo a gomito CPVC e un adattatore maschio CPVC.
    3. Praticare due fori (1 1/4 di diametro) sui lati opposti più distanti l'uno dall'altro di un contenitore ermetico da 8,5 L (11,25 x 7,75 x 6 pollici) con coperchio (vedere figura 1 camera di esposizione). Il posizionamento dei fori deve essere centrato dall'alto verso il basso e da sinistra a destra.
    4. Inserire i lati filettati dell'adattatore maschio CPVC assemblato prima in ogni foro nei contenitori.
    5. Dall'interno del contenitore, attaccare un cappuccio CPVC da 3/4 pollici sull'altro lato (ingresso fumo camera) e un adattatore femmina di irrigazione CPVC Drip da 3/4 pollici su un lato (uscita fumo camera).
    6. Praticare cinque fori da 3 mm sulla parte superiore del cappuccio CPVC dell'uscita del fumo della camera in un motivo quincunx (soffione). Ciò consentirà al fumo di sigaretta di entrare nella camera con una velocità maggiore e assicura che si diffonda uniformemente all'interno della camera in tutte le direzioni.
  3. Assemblaggio camere di sigarette (costituisce fino a 4 unità di esposizione murina)
    1. Prendi un tappo in gomma a un foro (formato produttore 8.5) e inserisci un connettore Y spinato da 1/4 di pollice sul lato più largo e un raccordo spinato dritto (apertura di 8 mm) sul lato più stretto. La sigaretta verrà posta qui durante la procedura di fumo (piedistallo di sigaretta).
    2. Collegare un'estremità di un tubo in vinile di grado medico lungo 12 pollici a uno dei connettori spinati sul connettore Y collegato al tappo di gomma e l'altra estremità a un raccordo da 1/4 di pollice e inserire il lato opposto di questo raccordo su un tappo di gomma a foro unico (dimensione 1 del produttore).
    3. Su un altro tappo di gomma (dimensione del produttore 8.5), inserire un connettore di tubi dritti da 1/4 di pollice sul lato più largo del tappo e collegare l'estremità esterna del raccordo a un tubo in vinile di grado medico da 7 piedi.
    4. Collegare le due strutture del tappo in gomma assemblate prima nei passaggi da 1.3.1 a 1.3.3 a un cilindro di vetro da 8 pollici x 1,75 pollici da un tubo di scarico in vetro da laboratorio.
  4. Sistema di controllo valvole
    1. Il sistema è controllato da un'apertura ritmica e chiusura di valvole solenoidi che simulano l'inalazione (sbuffamento) di fumo di sigaretta e aria pulita. Il sistema che controlla le valvole solenoidi è stato progettato commercialmente (vedi Tabella dei materiali).
  5. Assemblaggio di tutti i componenti (vedere figura 1)
    1. Montare quattro valvole solenoidi ai lati del sistema di controllo della valvola utilizzando elementi di fissaggio da 1 pollice.
    2. Collegare le valvole solenoidi al sistema di controllo della valvola seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Collegare un connettore dritto filettato 10-32 (M) alla connessione di scarico ("EXH") sulla valvola solenoide e un adattatore di porta filettato sulle connessioni "IN" e "OUT" della stessa valvola solenoide.
    4. Collegare il flussometro collegato al compressore alla valvola solenoide attraverso la connessione "OUT" utilizzando un tubo in vinile di grado medico da 7 piedi.
    5. Collegare il tubo in vinile da 7 piedi assemblato con il tappo di gomma nel passaggio 1.3.3. sul connettore "IN" sulla valvola solenoide.
    6. Inserire il piccolo tappo di gomma della camera di sigaretta sull'ingresso di fumo della camera.
    7. Collegare la valvola solenoide al secondo collegamento del connettore Y spinato sul piedistallo delle sigarette assemblato nel passaggio 1.3.1.

figure-protocol-5801
Figura 1: Schema delle connessioni del nostro WBIS per l'esposizione a CS. Questa figura dimostra come tutti i componenti vengono assemblati per formare un apparato funzionante. La figura mostra solo una camera di fumo assemblata dei quattro che la macchina è in grado di funzionare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Esposizione al fumo di sigaretta

ATTENZIONE: Evitare l'esposizione di seconda e terza mano al fumo di sigaretta. Le camere di sigarette e di esposizione devono essere utilizzate all'interno di un armadio di sicurezza biologica a flusso laminare di classe II B2. I DPI appropriati devono essere indossati durante lo svolgimento degli esperimenti di esposizione al fumo (ad esempio, maschere, guanti, retine per capelli, abito).

  1. Impostazione della pressione e del flusso d'aria
    1. Una volta assemblati tutti i componenti, come mostrato nella figura 1, accendere il compressore d'aria e attendere che l'allarme di sicurezza si s spenta da solo.
    2. Regolare la pressione del compressore d'aria a 40-50 psi ruotando la manopola sul regolatore di pressione.
    3. Regolare il flusso d'aria dal compressore d'aria a 5 L utilizzando il flussometro.
    4. Accendere il regolatore della valvola.
    5. Regolare il timer digitale sul controller della valvola sulla modalità operativa PULSE-C (visualizzata nel display come "Pu-c") premendo il tasto SET/LOCK tenendo premuto il tasto UP alla prima cifra del timer. Quindi, premere il tasto UP fino a raggiungere la modalità Pu-c. Premere IL TASTO RESET per impostare la modalità operativa visualizzata (ad esempio Pu-C) come modalità di lavoro.
    6. Premere IL SET/LOCK per cambiare timer 1 (visualizzato nel display come "T1").
    7. Premere i tasti SU o GIÙ per impostare T1 su 20 s.
    8. Premere IL SET/LOCK per cambiare timer 2 (visualizzato nel display come "T2").
    9. Premere i tasti SU o GIÙ per impostare T2 su 3 s.
      NOTA: I passaggi da 2.1.5 a 2.1.9 sono personalizzati per essere utilizzati con il timer specifico (vedi Tabella dei materiali). Per ulteriori istruzioni su altri usi per questo prodotto, vedere il relativo manuale d'uso.
  2. Trattamento del fumo di sigaretta
    NOTA: Questo sistema consente l'uso di 1-4 camere di esposizione murina allo stesso tempo.
    1. Accendere il compressore d'aria e attendere che l'allarme di sicurezza si sfugni da solo.
    2. Accendere il regolatore della valvola.
    3. Trasferire 5 topi in ciascuna delle quattro camere di esposizione con coperchi rimovibili ermetici con un volume di 8,5 L. Posizionare le quattro camere di esposizione con topi all'interno di un armadio di sicurezza biologica a flusso laminare di classe II tipo B2.
    4. All'interno dell'armadio di sicurezza biologico laminare flow, accendere una sigaretta e inserire la sigaretta all'interno della camera di sigaretta. Utilizzare sigarette disponibili in commercio che contengono 15 mg/catrame cig e 1,1 mg/cig nicotina8 rispetto alle sigarette di ricerca Kentucky 3RF4 (9,5 mg/catrame cig e 0,73 mg/cig nicotina)9.
    5. Accendere le valvole sul controller della valvola che corrispondono alle camere attualmente in uso. L'esposizione è divisa in 2 fasi: (T1) l'aria pulita viene pompata nella camera di esposizione per 20 s e (T2) il flusso d'aria fa bruciare la sigaretta e il fumo dalla camera di sigaretta viene pompato nella camera di esposizione per 3 s. Lasciare bruciare completamente la sigaretta fino a raggiungere il filtro.
      1. Regola le impostazioni del timer per eseguire una media di ~ 10 sbuffi / sigaretta in un periodo di ~ 4 minuti. Si noti che il timer e il sistema sono facilmente personalizzabili per migliorare o abbassare il regime di dosamento CS in base alle esigenze di ricerca degli investigatori.
    6. Rimuovere il filtro per sigarette e smaltirlo mettendo il mozzicone di sigaretta in un bicchiere con acqua per spegnere la fiamma e smorzare l'odore.
    7. Assicurarsi che la camera di sigaretta sia nuovamente chiusa e senza sigaretta. Lasciare pompare aria pulita alla macchina per 10 minuti. È della massima importanza mantenere un monitoraggio costante degli animali vertebrati esposti a CS. Questo regime di esposizione è ottimizzato per 5 topi femmine di età superiore a 9 settimane per camera di esposizione.
    8. Ripetere i passaggi da 2.3.4 a 2.3.7 tre volte per un totale di 4 sigarette per camera al giorno. Questa procedura viene ripetuta 5 giorni alla settimana per tutto il tempo di cui il ricercatore ha bisogno per i loro esperimenti.
    9. Rimuovere i topi dalle camere di esposizione nelle gabbie corrispondenti.
    10. Spegnere il regolatore della valvola e il compressore d'aria.
    11. Rimuovere l'esposizione e le camere di sigarette e lavare con acqua e sapone per rimuovere eventuali residui di catrame.
    12. Lasciare asciugare completamente le camere prima di usarle di nuovo.

Risultati

Uno dei principali tratti distintivi dell'esposizione al CS è l'enfisema che è caratterizzato dal danno e dalla distruzione delle sacche d'aria (alveoli) nel polmone. Pertanto, gli esperimenti iniziali si concentrarono sulla capacità del sistema fai-da-te di provocare cambiamenti enfisematosi nei polmoni delle femmine topi dopo ripetute esposizioni di tutto il corpo a CS. Il regime di dosamento CS è stato scelto sulla base delle nostre precedenti pubblicazioni in cui abbiamo utilizzato il sistema fai-da-te qui descri...

Discussione

Qui forniamo le informazioni necessarie per la costruzione di un apparato per WBIS di topi a CS. Dopo l'installazione del sistema, è di fondamentale importanza che gli investigatori calibrino il sistema in base alla dose erogata di nicotina o cotinina negli animali. L'apparecchio contiene un timer e manometri che possono essere utilizzati per regolare il volume del soffio di sigaretta, la frequenza del puff, il periodo combinato di esposizione al fumo e gli intervalli di riposo che gli animali ricevono tra ogni sigarett...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

AR, XH e PE sono stati sostenuti da una sovvenzione NIH R01HL140398 e da una sovvenzione della Gilson Longenbaugh Foundation. DEMM e KK sono stati sostenuti dalle sovvenzioni NIH R01HL136333 e R01HL134880 (KYK), e da una sovvenzione della Helis Medical Research Foundation. Demm è anche supportato dalla Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Gilliam Fellowship for Advanced Study. PE è anche supportato da Training in Precision Environmental Health Sciences NIEHS T32 ES027801 Fellowship Program. JC e MF sono supportati da Fondi di ricerca sul tabacco del Dipartimento di Epigenetica e Carcinogenesi Molecolare e dal Center for Epigenetics (Scholar Award to MF) di MD Anderson. FK e YZ sono supportati da sovvenzioni NIH R01 ES029442-01 e R01 AI135803-01 e dalla sovvenzione VA Merit CX000104. Questo progetto è stato sostenuto dal Nucleo di citometria e smistamento cellulare del Baylor College of Medicine con il finanziamento del CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), del NIH (CA125123 e RR024574) e dell'assistenza di Joel M. Sederstrom.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 in fastenerLowes756990
1/4 in Barbed Y connectorVWR89093-282
1/4 in straight tubing connectorVWR62866-378
1/8 hex nippleLowes877221
1/8 in threaded coupling fittingLowes877208
1/8 in threaded male adapter nipple fittingLowes877243
10/32 (M) threaded straight connectorBimbaEB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fittingLowes22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipeLowes23814
3/4 in CPVC capLowes23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapterLowes194629
3/4 in diameter CPVC male adapterLowes23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)KomaxN/AListed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)KIMAX6500
Isonic Solenoid ValvesBimbaV2A02-AW1
Marlboro Red 100'sMarlboroN/A
Oxygen swivel barbed connectorGlobal Medical SolutionsRES002
Panasonic Timer LT4H-WPanasonicLT4HWItem was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulatorAllied Electronics and Automation70600552Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)VWR59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)VWR59581-389
Scireq inExpose systemScireq and Emka TechnologiesN/ACommercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)VWR10028-872
Thread Sealant tapeLowes1184243
Threaded port adaptorBimbaP1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air CompressorMFI MedicalAHC-TE20
Timeter flowmeterAllied Healthcare Products15006-03YP2Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control systemShepherd Controls and AssociatesN/ACompany custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipesVitality MedicalRES3007

Riferimenti

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  22. Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

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