Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

Riepilogo

Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Abstract

La gonade embrionale maschile Drosophila melanogaster è un modello vantaggioso per studiare vari aspetti della biologia dello sviluppo tra cui, ma non solo, lo sviluppo delle cellule germinali, la biologia del piRNA e la formazione di nicchia. Qui, presentiamo una tecnica di dissezione per l'immagine dal vivo della gonade ex vivo durante un periodo in cui l'imaging dal vivo dal vivo è altamente inefficace. Questo protocollo delinea come trasferire gli embrioni in un piatto di imaging, scegliere embrioni maschili opportunamente messi in scena e sezionare la gonade dal tessuto circostante pur mantenendo la sua integrità strutturale. Dopo la dissezione, le gonadi possono essere fotografate utilizzando un microscopio confocale per visualizzare i processi cellulari dinamici. La procedura di dissezione richiede tempi e destrezza precisi, ma forniamo informazioni su come prevenire errori comuni e su come superare queste sfide. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo di dissezione per la gonade embrionale Drosophila e consentirà l'imaging dal vivo durante una finestra di tempo altrimenti inaccessibile. Questa tecnica può essere combinata con manipolazioni transgeniche farmacologiche o specifiche del tipo cellulare per studiare eventuali processi dinamici che si verificano all'interno o tra le cellule nel loro ambiente gonadico naturale.

Introduzione

Il testicolo della Drosophila melanogaster è servito come paradigma per la nostra comprensione di molti processi cellulari dinamici. Gli studi di questo modello hanno fatto luce sulla regolazione della divisione delle cellule staminali ^1,2,3, sullo sviluppo delle cellule germinali ^4,5, sulla biologia del piRNA ^6,7,8 e sugli eventi di segnalazione delle cellule staminali di nicchia 9,10,11,12,13. Questo modello è vantaggioso perché è geneticamente trattabile^14,15 ed è uno dei pochi in cui possiamo vivere le cellule staminali nel loro ambiente naturale ^3,16,17,18. Tuttavia, l'imaging dal vivo di questo modello è stato limitato al tessuto adulto e ai primi stadi embrionali, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza della dinamica gonadica nell'embrione tardivo, lo stadio preciso in cui la nicchia si sta formando per la prima volta e inizia a funzionare.

La gonade embrionale in stadio avanzato è una sfera, costituita da cellule di nicchia somatiche nella parte anteriore e cellule germinali incistate da cellule gonadiche somatiche in più regioni posteriori¹⁹. Questo organo può essere ripreso vivo fino allo stadio embrionale precoce 17 17,20,21. Ulteriori immagini sono prevenute a causa dell'inizio di contrazioni muscolari su larga scala. Queste contrazioni sono così gravi che spingono la gonade fuori dal fotogramma di imaging e tale movimento non può essere corretto con un software di imaging. Il nostro laboratorio è interessato a svelare i meccanismi della formazione di nicchia, che si verifica durante questo periodo sfuggente per l'imaging dal vivo. Pertanto, abbiamo generato un approccio ex vivo per l'immagine dal vivo della gonade a partire dallo stadio embrionale 16, facilitando lo studio della dinamica cellulare durante questo periodo cruciale di sviluppo delle gonadi. Precedenti lavori del nostro laboratorio mostrano che questa imaging ex vivo ricapitola fedelmente lo sviluppo delle gonadi in vivo ¹⁷. Questa tecnica è la prima e unica del suo genere per la gonade embrionale drosophila.

Qui presentiamo il protocollo di dissezione richiesto per l'imaging live ex vivo della gonade durante le fasi embrionali tardive. Questo protocollo può essere combinato con trattamenti farmacologici o manipolazione transgenica di specifici lignaggi cellulari all'interno della gonade. Usando questa tecnica, abbiamo ripreso con successo le fasi della formazione di nicchia delle cellule staminali¹⁷. Questo approccio di imaging è quindi strumentale per il campo della biologia delle cellule staminali, in quanto consentirà la visualizzazione delle fasi iniziali della formazione di nicchia in tempo reale all'interno del suo ambiente naturale^15,17. Mentre questo metodo è utile per il campo della biologia delle cellule staminali, è inoltre applicabile per visualizzare eventuali processi dinamici che si verificano nella gonade durante questo punto temporale di sviluppo, compresi i riarrangiamenti cellulari²², l'adesione cellulare ^2,12,23 e la migrazione cellulare²³. Questo protocollo di dissezione migliorerà così la nostra comprensione di molti processi biologici cellulari fondamentali.

Protocollo

1. Preparazione del giorno prima della dissezione

1. Affilare elettroliticamente un ago di tungsteno²⁴ in modo che il diametro risultante sia di circa 0,03 mm. Regolare la tensione fornita a circa 14 V e utilizzare 3,3 M NaOH. L'affilatura non dovrebbe richiedere più di 1 o 2 minuti.
   ATTENZIONE: NaOH è altamente corrosivo e causerà ustioni a contatto con la pelle. Indossare guanti e occhiali durante la manipolazione e lavorare all'interno di un cappuccio fumi.
   NOTA: Dopo l'uso, conservare NaOH in un tubo Falcon in polipropilene.
2. Creare il supporto di imaging preparato. In un tubo conico da 15 mL, combinare 4,25 mL di mezzi di Schneider con 750 μL di siero bovino fetale (FBS, concentrazione finale del 15%) e 27,5 μL di penicillina-streptomicina (0,05 U/μL di penicillina, 0,05 μg/μL di concentrazione finale). Conservare questo supporto di imaging preparato a 4 °C.
3. Fare la soluzione eptano-colla. Aggiungere circa 0,5 mL di eptano a un flaconcino sigillabile da 20 mL farcito con nastro biadesivo di circa 20 cm. Cullare su un nutatore per circa un'ora o mescolare con una punta di pipetta fino a raggiungere una consistenza tra quella di acqua e glicerolo. Questa soluzione di colla disciolta durerà per diversi giorni prima che l'eptano evapori. Per rinfrescare la soluzione, aggiungere altri 0,5 ml di eptano e roccia.
   NOTA: Una soluzione efficace di eptano-colla può essere preparata utilizzando vari rapporti tra eptano e nastro adesivo, nonché durate variabili di oscillazione / agitazione. Le specifiche di cui sopra sono solo suggerimenti per preparare o rinfrescare una di queste soluzioni adeguate.

2. Raccolta degli embrioni: 15-17 ore prima della dissezione

1. Aggiungere la pasta di lievito fresco a un piatto di agar di succo di mela²⁵. Allestire una gabbia per la raccolta degli embrioni aggiungendo mosche adulte (meno di 10 giorni) a una bottiglia di cibo vuota, perforata con piccoli fori²⁶. Tappare la gabbia di raccolta utilizzando la piastra di agar lievitato, fissata alla bottiglia, e posizionare la gabbia con il lato della piastra verso il basso in un'incubatrice scura a 25 °C per 1 ora.
   NOTA: Le mosche devono esprimere un transgene che segnerà fluorescentemente la gonade, ad esempio six4-eGFP::Moesin²⁰, perché la dissezione degli embrioni avverrà sotto un microscopio stereo-fluorescente. Vedere Tabella dei materiali per un elenco dei genotipi utilizzati per contrassegnare la gonade.
2. Rimuovere la gabbia dall'incubatrice e scartare questa prima raccolta. Sostituirlo con una piastra di agar appena lievitato e riposizionare la gabbia nell'incubatrice per 2 ore.
   NOTA: La prima raccolta di embrioni viene utilizzata per liberare le femmine dagli embrioni fecondati e in via di sviluppo, per ottenere una seconda raccolta di embrioni strettamente programmata.
3. Rimuovere la piastra di agar dalla gabbia e posizionarla (con il lato lievitato rivolto verso l'alto) su un tovagliolo di carta umido all'interno di un contenitore di plastica sigillabile. Posizionare questa camera umida in un'incubatrice a 25 °C per invecchiare gli embrioni per 14,5 ore (età finale, 14,5-16,5 ore dopo la deposizione delle uova).
   NOTA: immediatamente prima di iniziare il passaggio 2.4, completare i passaggi 3.1 e 3.2.
4. Rimuovere la piastra di agar dall'incubatrice e, usando una bottiglia di schizzo, aggiungere abbastanza acqua alla piastra di agar per sciogliere la pasta di lievito spazzolando leggermente con un pennello. Risciacquare gli embrioni e il lievito disciolto in un piccolo cestello a rete seduto all'interno di una barca di pesatura. Risciacquare il cestello con la bottiglia di spruzzo d'acqua fino a quando la maggior parte della pasta di lievito non è filtrata attraverso la rete.
5. Rimuovere l'acqua dalla barca di pesatura e riposizionare il cestello all'interno. Decorionare gli embrioni immergendoli in una soluzione di candeggina al 50%, utilizzando un flacone di schizzo. La soluzione di candeggina dovrebbe avere una profondità di 3-5 mm. Tenere gli embrioni immersi nella candeggina per ~ 2 minuti, con vortici occasionali.
   ATTENZIONE: La candeggina è corrosiva e può irritare o danneggiare gli occhi e le vie respiratorie. Indossare guanti e occhiali mentre si maneggia la candeggina.
   NOTA: durante questo periodo, completare il più possibile il passaggio 3.3. L'avanzamento della decorionazione può essere controllato posizionando il cestello sotto uno stereomicroscopio e controllando l'assenza delle appendici dorsali. Immergere gli embrioni nella soluzione di candeggina per un ulteriore tempo, se necessario.
6. Scartare la candeggina e risciacquare accuratamente gli embrioni all'interno del cestello con acqua da una bottiglia di schizzo (per ~ 3 s, tamponando il cestello a rete con carta assorbente; ripetere 2-3 volte).

3. Preparazione del giorno di dissezione

1. Aggiungere 30 μL di insulina (10 mg/mL) a 1.500 μL di imaging preparato (vedere fase 1.2) in un tubo di Eppendorf da 1,5 mL (concentrazione finale di 0,2 mg/mL). Mescolare bene e lasciare il tubo sul banco per equilibrare a temperatura ambiente.
2. Preparare strisce di coverslip rivestite con colla.
   1. Utilizzare un coltello con punta di diamante per tagliare un coverslip di 22 mm x 22 mm in quattro strisce di dimensioni uguali (Figura 1A).
   2. Utilizzare una pinza per raccogliere una striscia e distribuire un totale di circa 30 μL di soluzione di eptano-colla su entrambi i lati della striscia (Figura 1B). Per ottenere uno strato uniforme di residui di colla, inclinare la striscia a varie angolazioni mentre l'eptano evapora.
   3. Conservare la striscia ricoperta di colla in una fessura vuota di una scatola di coverslip; per mantenere la sua viscosità, posizionare la striscia in posizione inclinata, ma verticale, appoggiandosi ai bordi della scatola per ridurre al minimo il contatto con le superfici della scatola (Figura 1C). Chiudere la scatola in modo che le particelle nell'aria non rivestano la colla e ne riducano la viscosità.
3. Posizionare i seguenti elementi sul banco: una pipetta Pasteur in vetro da 6 pollici, un vetrino per microscopio, un pipettaman P200 e P1000 con le punte appropriate per pipette, la soluzione²⁷ di Ringer (pH regolato a 7,3 con NaOH) e una parabola di imaging da 35 mm rivestita in Poli-D-lisina scoperta.
4. Trasferire gli embrioni dal cestello dello schermo a rete a un piccolo vetro dell'orologio riempito con 500-750 μL di eptano.
   1. Asciugare i lati e il fondo del cestello con una salvietta di tessuto. Inumidire un pennello nell'eptano, toccare il pennello agli embrioni (la membrana vitellina idrofobica dovrebbe aderire alle setole) e immergere nuovamente il pennello nell'eptano nel vetro dell'orologio (gli embrioni dovrebbero affondare sul fondo).
      NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per evitare che gli embrioni si secchino. Gli embrioni non devono essere esposti all'aria per più di 20 s.
5. Trasferire gli embrioni sul vetrino del microscopio utilizzando una pipetta Pasteur (Figura 1D). Aspirare lentamente gli embrioni nella pipetta e limitarli alla porzione stretta della pipetta. Gli embrioni di pipetta sul vetrino lentamente, in modo tale che si aggregano appena all'interno della punta della pipetta prima di fluire sul vetrino. Ruotare l'angolo di una salvietta di tessuto in una punta fine e allontanare l'eptano dagli embrioni sul vetrino. Si aggregano e coprono un'area più piccola, rendendo più facile catturarli su una striscia ricoperta di colla nella fase successiva.
6. Con la pinza, raccogliere una striscia ricoperta di colla e toccarla delicatamente agli embrioni (Figura 1E). Posizionare la striscia nel piatto di imaging, nell'embrione lateralmente e appena fuori dal centro rivestito di poli-D-lisina. Premere la striscia sul piatto usando una pinza, per assicurarsi che sia fissata in posizione. Inondare immediatamente il piatto con 2-3,5 ml di soluzione di Ringer; immergere prima gli embrioni per evitare che si secchino (Figura 1F).

4. Dissezione

NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti al microscopio stereofluorescenza.

1. Devitellinizzare 10-15 embrioni.
   NOTA: Questo può variare da due embrioni, per principianti, a quindici embrioni, per esperti.
   1. Selezionare gli embrioni di stadio 16 in base alla morfologia intestinale (Figura 2). In questa fase, gli embrioni hanno tre costrizioni intestinali che creano quattro segmenti intestinali impilati (Figura 2B,B'). Per iniziare la devitellinizzazione, perforare l'embrione selezionato a un'estremità, preferibilmente quella anteriore, con l'ago di tungsteno. L'embrione può uscire dalla sua membrana vitellina, ma in caso contrario, staccare la membrana dall'embrione.
      NOTA: Gli embrioni troppo giovani per essere sezionati hanno un intestino non regionalizzato (Figura 2C). La dissezione degli embrioni di stadio 17 è possibile, ma più impegnativa della dissezione di embrioni di stadio 16 perché la cuticola sta iniziando a svilupparsi in questa fase. Gli embrioni di stadio 17 precoce presentano quattro segmenti intestinali che sono spostati l'uno rispetto all'altro (Figura 2D,D').
   2. Aggancia l'ago attraverso l'embrione in una regione lontana dalle gonadi. Trasferire l'embrione uncinato nella regione rivestita di polilisina del piatto (da qui in poi indicato semplicemente come "cover slip") e trascinarlo contro il fondo fino a quando non aderisce. Ripeti questi passaggi e disponi gli embrioni devitellinizzati in fila lungo la parte superiore dello slip di copertura rivestito di polilisina (Figura 3A), lasciando molto spazio sotto per un'ulteriore dissezione.
      NOTA: Le gonadi appaiono come piccoli aggregati sferici di cellule che dovrebbero fluorescere brillantemente, a seconda del marcatore specifico utilizzato e del numero di copia transgenica. In questa fase, le gonadi si trovano lateralmente nel segmento A5, a circa il 70%-80% della lunghezza dell'embrione dall'anteriore. Durante tutto il protocollo di dissezione, il tessuto può attaccarsi all'ago. Per liberare l'ago dai detriti, sollevarlo appena sopra la superficie della soluzione del Ringer. La devitellinizzazione può essere disordinata finché la gonade vera e propria è disturbata il meno possibile.
2. Finezza le gonadi fuori dall'embrione e sul piatto (Figura 3C,D).
   1. In primo luogo, filettare l'embrione per esporre il suo interno (Figura 3C). Taglia l'embrione dal suo centro, muovendo l'ago posteriormente, tra le gonadi. Stuzzicare un po 'di tessuto interno, in quanto questo si attaccherà al piatto molto meglio della cuticola esterna. La viscosità del tessuto consentirà alle successive manipolazioni di rivelare la gonade e consentirle di aderire allo slittamento del coperchio.
      NOTA: se il tessuto non si attacca al piatto, prova a convincerlo in una regione incontaminata dello slip di copertura rivestito; le regioni esterne dello slittamento del coperchio saranno particolarmente appiccicose. Come indicato nel passaggio 4.1.2, non importa se le manipolazioni di dissezione provocano una carcassa embrionale maciullata, purché le gonadi rimangano indenni.
   2. Usa l'ago per affettare una gonade fino a quando un pezzo di tessuto, compresa la gonade, è separato dalla carcassa rimanente. Con l'ago, disegnare questo tessuto in una regione fresca di copertura rivestita e convincerlo contro il fondo fino a quando non aderisce al piatto.
      NOTA: La migliore immagine sarà ottenuta per quei casi in cui la gonade stessa si attacca direttamente allo slittamento del coperchio, piuttosto che all'attacco indiretto tramite tessuto sovrastante. Pertanto, mentre il tessuto viene guidato lontano dalla carcassa, tentare di far scivolare prima la gonade sul coperchio, piuttosto che il tessuto estraneo.
   3. Rimuovere il più possibile il tessuto circostante dalla gonade (Figura 3D) trascinando delicatamente il tessuto aderente lontano dalla gonade con l'ago. Evitare di toccare direttamente la gonade, che la danneggerebbe (Figura 4E). Per assicurarti che la gonade sia sufficientemente aderente al piatto, sposta l'ago con un delicato movimento circolare attorno alla gonade, se si muove, tocca l'ago sul tessuto aderente rimanente e dirigi la gonade verso una regione fresca di scivolamento appiccicoso della copertura. Ripeti questo processo fino a quando non c'è alcun movimento rilevabile della gonade.
   4. Ritorna alla carcassa dell'embrione e seziona la seconda gonade. Ripeti questo processo sul maggior numero possibile di embrioni ma NON superare i 25 minuti. La vitalità tissutale sarà compromessa nella soluzione di Ringer dopo più di ~ 40-45 minuti.
3. Una volta completate le dissezioni, utilizzare un marcatore indelebile per aggiungere segni di registrazione al bordo esterno della parabola di imaging per registrarne l'orientamento durante la dissezione.
4. Rimuovere la striscia rivestita di colla dal piatto.
   1. Inserire delicatamente la punta inferiore di un paio di pinze sotto la striscia, stringere e inclinare lentamente la striscia verso l'alto per liberarla dal piatto con il minor scorrimento possibile della soluzione di Ringer per ridurre al minimo il disturbo delle gonadi aderenti.
      NOTA: la striscia deve essere inclinata lontano dalle gonadi sezionate.
5. Portare delicatamente il piatto al microscopio per immagini in modo da evitare lo slittamento della soluzione di Ringer.

5. Imaging

1. Posizionare la parabola di imaging nel supporto del palco, utilizzando i segni di registrazione per posizionare la parabola nell'orientamento approssimativo come durante la dissezione. Utilizzando la microscopia a campo luminoso e un obiettivo a bassa potenza (~ 10x), identificare e mettere a fuoco qualsiasi pezzo di tessuto che aderisce al coperchio. Cambia le impostazioni dell'oculare per rivelare la fluorescenza e, utilizzando gli oculari binoculari, scansiona sistematicamente il piatto, contrassegnando la posizione di ciascuna gonade all'interno del software di imaging (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: assicurarsi che le gonadi siano centrate nel campo visivo prima di contrassegnare le posizioni.
2. Rimuovere delicatamente l'intero gruppo portastadio, con la parabola di imaging nel supporto, e posizionare l'assemblaggio sul banco di lavoro.
3. Sostituire la soluzione di Ringer con il mezzo di imaging preparato contenente insulina (vedere i passaggi 1.2 e 3.1).
   1. Utilizzare un P1000 per rimuovere tutta la soluzione di Ringer dalla sporgenza superiore interna della parabola di imaging (non pipettare Ringer dalla regione di scorrimento del coperchio centrale). Quindi, passa a un P200 e posiziona la sua punta appena sotto la superficie dei Ringer rimanenti nella regione centrale. Rimuovere con attenzione 50-100 μL di Ringer; NON rimuovere l'intera soluzione.
   2. Aspirare ~ 200 μL di supporti di imaging e, posizionando nuovamente la punta P200 appena sotto la superficie della suoneria rimanente, aggiungere lentamente questo supporto di imaging. Quindi, aggiungere il supporto di imaging rimanente (~ 1.300 μL) al piatto, a partire dal bordo più esterno della sporgenza superiore. Durante il pipettaggio, spostati verso la cupola centrale del fluido e alla fine unisci i due spazzolando la punta della pipetta su entrambi. Posizionare il coperchio sul piatto.
      NOTA: il supporto di imaging deve coprire l'intero diametro interno del piatto, con una profondità di circa 2 mm, per evitare l'evaporazione (Figura 4D).
4. Passare il microscopio a un obiettivo di potenza superiore (63x, 1,2 NA), applicare il fluido di immersione appropriato in base all'obiettivo utilizzato (tipo di fluido ad immersione e indice di rifrazione richiesto dall'obiettivo) e quindi sostituire l'assieme portastadio. Utilizzare la microscopia a campo luminoso per concentrarsi sul tessuto aderente al fondo della parabola di imaging.
   NOTA: se il palco non è stato spostato, l'ultima gonade dovrebbe essere visualizzata una volta che l'obiettivo è focalizzato.
5. Passa attraverso ogni posizione della gonade contrassegnata e regola quella posizione, se necessario. Seleziona quali gonadi visualizzare in base alla chiarezza dell'immagine, al sesso delle gonadi, ecc. Personalizza le impostazioni di imaging (multicanale, tempi di esposizione, intensità laser, incrementi della serie Z, time-lapse con intervalli appropriati, ecc.). Inizia l'imaging.
   NOTA: Le gonadi maschili possono essere identificate dalla presenza sia di una nicchia, sia all'estremità opposta della gonade, un gruppo di piccole cellule somatiche altamente circolari chiamate precursori gonadici somatici maschili-specifici (msSGP). Se viene utilizzato il marcatore fluorescente six4-eGFP::moesin, le cellule di nicchia sono le seconde cellule più luminose nella gonade, la più luminosa è la msSGP. In questa fase, le gonadi femminili non hanno né una nicchia né msSGP.

Risultati

Illustriamo la preparazione del piatto di imaging nella Figura 1, come descritto in "Preparazione del giorno della dissezione". Questi metodi dovrebbero alla fine portare a embrioni ben idratati aderenti a una striscia di copertura, che viene temporaneamente fissata al fondo del piatto e immersa nella soluzione di Ringer (Figura 1F). Un coltello con punta di diamante consente di tagliare in modo pulito un coperchio di 22 x 22 mm in tre o quattro strisce più pic...

Discussione

Durante la gonadogenesi, la gonade embrionale, e in particolare la nicchia delle cellule staminali all'interno della gonade maschile¹⁵, subisce rapidi cambiamenti morfologici. I meccanismi di sviluppo che sono alla base di questi cambiamenti dinamici sono meglio compresi attraverso tecniche di live-imaging. Tuttavia, allo stadio embrionale 17, l'imaging in vivo della gonade è reso impossibile dall'insorgenza di contrazioni muscolari su larga scala¹⁷. Con questo pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024