Сингенная мышиная модель эндометриоза с использованием естественно циклических мышей

Резюме

Многие модели эндометриоза на грызунах ограничены технической сложностью, воспроизводимостью и / или потребностью в животных с ослабленным иммунитетом или специальных мышах-репортерах. Мы представляем упрощенную систему индукции поражения с использованием любой экспериментальной мыши с независимо проверяемой, объективной системой оценки и без необходимости овариэктомии или операции по выживанию.

Аннотация

Эндометриоз является основной причиной тазовых болей и бесплодия. Определяется наличием ткани эндометрия во внематочном расположении. Разработка новых методов лечения и диагностических инструментов для эндометриоза была ограничена отчасти из-за проблем в изучении заболевания. За пределами приматов немногие млекопитающие менструают, и ни у одного из них не развивается спонтанный эндометриоз. Модели грызунов популярны, но требуют искусственной индукции эндометриоза, причем многие из них используют либо иммунокомпрометированных мышей, либо хирургически индуцированное заболевание. В последнее время больше внимания уделяется моделям, включающим внутрибрюшинную инъекцию. Мы представляем мышиную модель эндометриоза, которая объединяет несколько особенностей существующих моделей эндометриоза в новую, упрощенную систему, которая опирается на микроскопическую количественную оценку вместо субъективной оценки. В этой модели мы выполняем гормональную стимуляцию мышей-доноров, внутрибрюшинную инъекцию, систематическое абдоминальное обследование и сбор тканей, а также гистологическую количественную оценку, которая может быть выполнена и проверена в любое время после некропсии. Эта модель требует минимальных ресурсов и обучения; не требует экспертизы лаборантов в хирургии выживания мысов или в выявлении грубых эндометриотических поражений; может быть использован у иммунокомпрометированных, иммунокомпетентных и/или мутантных мышей; и надежно создает эндометриотические поражения, которые гистологически согласуются с эндометриотической болезнью человека.

Введение

Эндометриоз является загадочным заболеванием женского репродуктивного тракта со значительным финансовым и оздоровительным бременем для женщин^1,2. Этиология эндометриоза не полностью понята, и было предложено множество объяснений, включая целовую метаплазию, эмбриональные остатки Мюллера, набор клеток-прогениторов костного мозга и ретроградную менструацию^3. Хотя могут быть задействованы многочисленные аспекты этих предлагаемых механизмов, и ни одно объяснение не может объяснить все формы заболевания, ведущей моделью патогенеза эндометриоза является ретроградная менструация. Ретроградная менструация – это прохождение менструальных стоков по фаллопиевым трубам и в брюшинную полость; Подсчитано, что 90% менструаций женщин регулярно подвергаются ретроградным менструациям^4,5. Учитывая это обыденное явление ретроградной менструации, почему эндометриоз развивается только у подгруппы женщин, неясно^5. Чтобы лучше понять этиологию этого заболевания, прямые исследования на людях невозможны, и исследования на животных оправданы.

Эндометриоз является проблемой как для лечения, так и для изучения. Распространенность заболевания неизвестна, но оценивается в 10%¹. В то время как некоторые продвинутые типы эндометриоза могут быть точно идентифицированы с помощью неинвазивной визуализации, окончательный диагноз достигается только путем гистопатологического анализа хирургически полученных образцов биопсии; поражения, которые визуально кажутся больными, на самом деле могут быть фиброзом или рубцеванием от других причин^6. Тяжесть и степень заболевания не коррелирует с симптоматикой^7.

Поражения эндометриоза состоят из гетерогенных типов клеток и популяций, которые взаимодействуют сложными способами в микросреде, что ограничивает полезность клеточных моделей^8,9. Модели in vivo существуют, но они имеют присущие им проблемы и ограничения^10,11,12. Модели приматов идеальны, но часто неосуществимы^13,14,15. Немногие млекопитающие, не являющиеся приматами, менструают и у них развивается эндометриоз спонтанно^16. Модели эндометриоза на грызунах существуют, но каждая из них имеет ограничения^17. Многие из этих моделей требуют операции по выживанию для наложения швов или имплантации ткани эндометрия в стенку донора-реципиента или кишечник, добавляя техническую сложность, потребность в анестезии и смешивая иммунные факторы от самой операции^18,19,20. Кроме того, многие модели требуют овариэктомии и добавок эстрогена; увеличивая выход поражения, это увеличивает время, затраты и дополнительную операцию по выживанию. Модели внутрибрюшинных (IP) инъекций не требуют анестезии или операции по выживанию, и эти модели логически имитируют ретроградную менструацию лучше, чем шовные модели^21,22,23. Однако большинство моделей ИС подвержены большей изменчивости в месте поражения из-за случайного рассеивания фрагментов эндометрия после инъекции и, следовательно, большей погрешности в идентификации и измерении поражения.

Здесь мы представляем мышиную модель эндометриоза, которая объединяет несколько особенностей существующих моделей эндометриоза в новую, упрощенную и эффективную систему, которая опирается на микроскопическую количественную оценку вместо субъективной классификации.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование животных в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Кливлендском научно-исследовательском институте клиники Лернера. Все общедоступные стандарты ухода за животными и их использования были выполнены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения. Эта процедура использует асептические методы. Чашка Петри стерильна. Используемый PBS/физиологический раствор является стерильным. Хирургические инструменты для некропсии и рассечения тканей стерилизуются с помощью автоклава. Мы используем 70% EtOH на инструментах между случаями с животными (если более одного за сеанс), чтобы уменьшить загрязнение.

1. Подготовка мышей-доноров и реципиентов (см. Рисунок 1)

1. Убедитесь в том, что для работы с лабораторными животными получено соответствующее разрешение.
2. Определите штамм мыши. В этих экспериментах использовались мыши дикого типа и мутанты, имеющие фон C57BL/6J, но исследователи, использующие аналогичные модели, сообщают об успехе с другими штаммами мышей, такими как мыши BALB/ c^10. Кроме того, мыши-доноры и/или мыши-реципиенты могут использовать репортерные системы, такие как мыши GFP или RFP (см. Рисунок 2 и Рисунок 3).
3. Для определения сроков трансплантации ткани эндометрия убедитесь, что мышам-донорам на момент инъекции гонадотропина было от 22 до 24 дней. Это гарантирует, что они репродуктивно наивны, например, еще не начали эструйную езду на велосипеде.
4. Убедитесь, что мыши-реципиенты репродуктивно неповреждены (без предшествующих овариэктомий) в возрасте от 2 до 4 месяцев. Хотя это и не требуется, рекомендуется периодически помещать пропитанную мочой постельное белье из клетки самцов мышей в клетку реципиента, чтобы облегчить продолжающийся цикл эструсов, и снова за 72 часа до трансплантации ткани эндометрия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это не обеспечит синхронизацию эстрального цикла реципиентов, так как размещение пропитанного мочой постельного белья сильно зависит от количества используемых мужских постельных принадлежностей и имеет переменные результаты. Если синхронизация эстрального цикла желательна, три последовательные подкожные инъекции 100 нг/100 мкл эстрадиола приведут всех животных к эструсной фазе. В то время как мы не обнаружили различий в индукции поражения на основе фазы эстрального цикла, другие группы обнаружили, что фаза цикла важна^10.
5. Подкожно вводят беременной кобыле сыворотки гонадотропин (ПМСГ, 2 МЕ, разведенные в 200 мкл) мышам-донорамподкожно с использованием тонкой иглы (рекомендуется 25-27 г). Не давайте ПМСГ мышам-реципиентам, так как это вызовет овуляцию и последующую среду с высоким содержанием прогестерона, которая менее восприимчива к образованию эндометриоза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие мышиные модели использовали pmsg или эстроген для стимуляции пролиферации эндометрия у мышей-доноров до сбора урожая эндометрия^23. PMSG рекомендуется по следующим причинам: Период полувыведения PMSG составляет 40 ч, тогда как период полувыведения 17-бета-эстрадиола составляет всего 2 ч. Использование однократной подкожной инъекции ПМСГ донорам за 40 ч до забора ткани эндометрия обеспечивает устойчивую продолжительность воздействия стимуляции гонадотропином, который действует для стимуляции эндогенного эстрогена. Многие препараты экзогенного эстрогена требуют многократных инъекций для адекватной праймы эндометрия.
6. После инъекции PMSG запланируйте некропсию, закупку и трансплантацию реципиенту в промежутке 38-42 ч. Время сбора ткани эндометрия после инъекции гонадотропина для обеспечения сбора ткани перед овуляцией, которая происходит через 42 ч после инъекции. Овуляция производит среду с высоким содержанием прогестерона (P4), что уменьшает очаг поражения.

2. Закупка донорской ткани эндометрия мыши

1. После эвтаназии донорской мыши (с использованием камеры CO₂ с последующим вывихом шейки матки) опрыскайте брюшную полость 70% раствором этанола; это служит для уменьшения загрязнения закупаемой ткани от кожной флоры и от смещенных волосков. Рассекая ножницами, сделайте неглубокий поперечный срез по средней линии через кожу и подкожную клетчатку. Затем, захватив каждую сторону разреза кожи, используйте тупое вытяжение, чтобы открыть живот.
2. Определите матку. Перед удалением матки обрежьте прилегающую соединительную ткань. Трансектейте каждый рог матки чуть ниже соответствующей фаллопиевой трубы, а затем трансектете шейку матки, чтобы удалить всю матку в блоке.
3. После удаления из брюшной полости тщательно осмотрите матку и удалите дополнительный периферический жир или соединительную ткань. Поместите матку в каплю холодного PBS на чашке Петри. Определите и задокументируйте совокупную массу всей матки.
4. Трансекция каждого рога от дна матки, делая трансекцию как можно ближе к дну, чтобы максимизировать длину каждого рога. С помощью рассекающего микроскопа поместите одно лезвие рассекающих ножниц внутрь просвета первого рога, затем разрезайте вдоль большой оси трубки. Осторожно откройте трубку, имея в виду, с какой стороны находится сероза, а с какой стороны эпителий.
5. Положите 500 куб. см физиологического раствора или PBS на новую чашку Петри; жидкость будет оставаться вместе из-за поверхностного натяжения.
6. Затем выполняют фрагментацию матки в равномерном порядке. Лучше иметь меньше более крупных поражений, чем многих меньших поражений. Начните с отделения эпителия от миометрия, захватив слой эндометрия и отклеив его.
   1. С другой стороны, просто фрагментируйте ткань, не отделяя миометрий (до тех пор, пока эпителиальная сторона полностью открыта), но сохранение миометрия уменьшает физиологическую значимость этой модели для заболеваний человека. Убедитесь, что фрагменты как можно больше, но достаточно малы, чтобы пройти через иглу 18 Г; (рекомендуется 1 мм x 1 мм).
   2. Соберите 10-12 из этих фрагментов размером 1 мм х 1 мм из первого рога (что примерно соответствует 40 мг ткани у мышей C57BL/6J). Поместите собранные фрагменты в коллекцию жидкости.
7. Выполните те же шаги для другого рога матки в общей сложности около 24 фрагментов на мышь. Задокументируйте общее количество фрагментов.

3. Перитонеальная инъекция фрагментов тканей мыши-реципиенту

1. Аспирировать взвешенные фрагменты 1 мм х 1 мм с помощью тупого конца шприца объемом 1 куб. см; общий объем должен составлять 1 мл.
2. Прикрепите иглу 18 г к полному шприцевой шприца и загрузите жидкость в иглу. Рассмотрите имитацию инъекции обратно в чашку Петри, чтобы гарантировать, что вся ткань пройдет через иглу.
3. Возьмите мышь получателя. Либо до, либо после инъекции ИП, получите вагинальный мазок мыши-реципиента для документирования эстрального цикла (10 мкл физиологического раствора с помощью шприца луковицы на вагинальном отверстии и покрытые стеклянным слайдом с крышкой).
4. Выполняют внутрибрюшинное введение отломков шприцем под углом 45 градусов, заботясь о том, чтобы не вводить подкожно.
5. Если фрагменты остаются после инъекции, втяни дополнительные 200 мкл жидкости в шприц для инъекции, чтобы убедиться, что все фрагменты успешно введены внутрибрюшинно.
6. Уверившись в отсутствии кровотечений или осложнений, поместите мышей-реципиентов обратно в их клетки и кормите нормальной диетой.

4. Сбор эндометрийных поражений

1. Усыпляйте мышей-реципиентов примерно через 21 день после инъекции фрагмента после трансплантации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из опыта и из обсуждения с сотрудниками, использующими аналогичные модели, максимальный размер и количество поражений происходят примерно через 3 недели после трансплантации; через 3 недели поражения начинают регрессировать в размерах. Используется одобренный IACUC метод эвтаназии.
2. После эвтаназии и вывиха шейки матки опрыскайте брюшко животного 70% этанолом и позолойте кожу поверхностно рассекающими ножницами. Разрезайте кожу и подкожное пространство ножницами, чтобы тупо открыть живот.
3. Перед проведением любого дальнейшего вскрытия проводится полное обследование грубых поражений, размер которого измеряется суппортами и документируется их анатомическая область (см. Ниже).
4. Выполните полный сбор трех различных анатомических областей в блоке (независимо от того, могут ли поражения быть оценены грубо). Если поражения наблюдаются в других областях (например, в кишечнике), их следует игнорировать и не собирать, если поражение не пересекает одну из трех областей ниже.
   1. A = брюшная стенка/брюшина (может быть либо сплющена в кассету, либо свернута, при том случае, если она согласуется между образцами).
   2. B = поджелудочная железа и брыженеечный жир.
   3. C = параматочная соединительная ткань и жир (белая сверкающая ткань, которая окружает матку, но не затрагивает никаких органов, кроме мочевого пузыря; позаботьтесь о том, чтобы не принять мочевой пузырь за поражение).
5. Поместите каждую рассеченную область в кассету, соответствующим образом помеченную, и поместите ее в формалин и обработайте в соответствии с лабораторным протоколом для гистологического сечения.
6. Сечение формалиновых блоков в два слайда (D1 и D2) на площадь ткани на двух однородных глубинах.

5. Оценка эндометрийных поражений

1. Сканирование (при 40-кратном увеличении) и архивирование слайдов.
2. Используйте программное обеспечение для цифрового считывания слайдов, определите самое большое расстояние (X) между краями эндометриотического поражения - независимо от того, состоит ли край из желез или стромы - и отметьте его. Непрерывное поражение определяется железами, окруженными стромой; линия не обязательно пересекает только эндометриотическую ткань (как в случае определения конечных точек на неправильной форме или волнообразном очаге эндометриоза), но две конечные точки должны быть соединены непрерывной стромой и/или железами (см. Рисунок 4).
3. Сделайте вторую линию (Y) 90 градусов поперек первой линии, причем длина второй линии определяется в соответствии с приведенными выше правилами.
4. Если встречается несколько несмежных поражений, дайте каждому свои собственные измерения X и Y.
5. Рассчитайте итоговый балл для каждого слайда как суммирование областей (X*Y) каждого поражения.
6. Возьмите большую из оценок с двух слайдов (D1 против D2) в качестве окончательной оценки для этого региона (A, B, C).
7. Суммировать баллы из каждого региона, чтобы дать окончательный микроскопический балл для этого животного.

Результаты

Для первоначального экспериментального доказательства концепции донорский эндометрий от мышей RFP вводили мышам-реципиентам дикого типа. Окрашивание H&E выявило гистопатологическое подтверждение классической архитектуры поражения эндометриозом(рисунок 3А). Флуоресце...

Обсуждение

Наше исследование показывает, что эндометриоз может быть надежно индуцирован у мышей, не требуя использования овариэктомии и / или операции по выживанию, и что внематочные поражения эндометрия могут быть идентифицированы и количественно определены с ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle	Fisher Scientific	14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma-Aldrich	9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip	Electron Microscopy Sciences	72993-6C
70% ethanol solution	Pharmco	33000HPLCCS4L	70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance	Mettler Toledo	ME54TE
Carbon dioxide	TriGas Supplier
Dissecting tray	Fisher Scientific	S14000
No. 10 disposable scalpel	Fisher Scientific	NC9999403
Scissors, curved	Electron Microscopy Sciences	72941
Scissors, straight	Electron Microscopy Sciences	72940
Stereo microscope	Leica Microsystems	Leica SE 4	For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray	Electron Microscopy Sciences	66112-02
Tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772E
Weighing dishes	Fisher Scientific	02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe	BD Biosciences	301025
18 G needle	Fisher Scientific	148265d
200 uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-422
Double distilled water	Institutional core facility supplies
Latex bulb	Fisher Scientific	03-448-21
Micro cover glass slip	VWR	48366-067
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-7
Standard light microscope	Leica Microsystems	DM IL	For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Biopsy foam pads	Fisher Scientific	22-038-222
Precision Digital Calipers	Electron Microscopy Sciences	62065-40
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	22-272416