Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

Resumen

El artículo describe un protocolo rápido para gonadectomizar y tomar muestras de sangre de los pequeños peces teleóseos, utilizando medaka japonés(Oryzias latipes)como modelo, para investigar el papel de los esteroides sexuales en la fisiología animal.

Resumen

Los esteroides sexuales, producidos por las gónadas, juegan un papel esencial en la plasticidad del cerebro y el tejido pituitario y en el control neuroendocrino de la reproducción en todos los vertebrados al proporcionar retroalimentación al cerebro y la hipófisis. Los peces teleóstos poseen un mayor grado de plasticidad tisular y variación en las estrategias reproductivas en comparación con los mamíferos y parecen ser modelos útiles para investigar el papel de los esteroides sexuales y los mecanismos por los que actúan. La eliminación de la principal fuente de producción de esteroides sexuales mediante gonadectomía junto con el muestreo de sangre para medir los niveles de esteroides ha sido bien establecida y bastante factible en peces más grandes y es una técnica poderosa para investigar el papel y los efectos de los esteroides sexuales. Sin embargo, estas técnicas plantean desafíos cuando se implementan en modelos de teleósto de tamaño pequeño. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso de la gonadectomía en medaka japonés masculino y femenino seguido de un muestreo de sangre. Estos protocolos han demostrado ser altamente factibles en medaka indicados por una alta tasa de supervivencia, seguridad para la vida útil y el fenotipo de los peces, y reproducibilidad en términos de eliminación de esteroides sexuales. El uso de estos procedimientos combinado con las otras ventajas de usar este pequeño modelo de teleósto mejorará en gran medida la comprensión de los mecanismos de retroalimentación en el control neuroendocrino de la reproducción y la plasticidad tisular proporcionada por los esteroides sexuales en vertebrados.

Introducción

En los vertebrados, los esteroides sexuales, que son producidos principalmente por las gónadas, juegan un papel importante en la regulación del eje Cerebro-Hipófisis-Gonadal (BPG) a través de varios mecanismos de retroalimentación^1,2,3,4,5. Además, los esteroides sexuales afectan la proliferación y la actividad de las neuronas en el cerebro^6,7,8 y las células endocrinas, incluidos los gonadotropos, en la hipófisis^9,10,y por lo tanto cumplen funciones cruciales en el cerebro y la plasticidad pituitaria. A pesar de un conocimiento relativamente bueno en mamíferos, el mecanismo de regulación del eje BPG mediado por esteroides sexuales está lejos de ser entendido en especies no mamíferas, lo que lleva a una comprensión deficiente de los principios conservados evolutivamente¹¹. Todavía hay un número limitado de estudios que documentan el papel de los esteroides sexuales en el cerebro y la plasticidad pituitaria, lo que plantea la necesidad de más investigaciones sobre el papel y los efectos de los esteroides sexuales en diversas especies de vertebrados.

Entre los vertebrados, los teleóstos se han convertido en poderosos animales modelo para abordar numerosas preguntas biológicas y fisiológicas, incluida la respuesta al estrés^12,13,el crecimiento^14,15,la fisiología nutricional^16,17 y la reproducción^2. Los teleóstomos, en los que los esteroides sexuales están representados principalmente por estradiol (E2) en las hembras y 11-cetotestosterona (11-KT) en los machos^18,19,han sido durante mucho tiempo modelos experimentales confiables para investigar el principio general de reproducción en todas las especies. Los teleóstomos muestran singularidad en su conexión hipotalámico-hipofisaria^20,21 y distintas células gonadotropas^22,que a veces son convenientes para la elucidación de los mecanismos reguladores. Además, debido a su capacidad para experimentos de laboratorio y de campo, los teleóstodos ofrecen muchas ventajas en comparación con otros organismos. Son relativamente baratos de comprar y mantener^23,24. En particular, los pequeños modelos de teleósto como el pez cebra(Danio rerio)y el medaka japonés(Oryzias latipes),son especies con una fecundidad muy alta y un ciclo de vida relativamente corto que permite un análisis rápido de la función génica y los mecanismos de la enfermedad^23,proporcionando así ventajas aún mayores al abordar una gran cantidad de preguntas biológicas y fisiológicas, teniendo en cuenta los numerosos protocolos bien desarrollados y el conjunto de herramientas genéticas disponibles para estas especies²⁵.

En numerosos estudios, la eliminación de gónadas (gonadectomía) junto con técnicas de muestreo de sangre se han utilizado como método para investigar muchas cuestiones fisiológicas, incluido su impacto en la fisiología reproductiva de vertebrados en mamíferos^26,27,28,aves²⁹ y anfibios^30. Aunque el efecto de la gonadectomía sobre la fisiología reproductiva puede ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuales, como el tamoxifeno y el clomifeno, el efecto de los fármacos parece ser inconsistente debido a los efectos bimodales^31,32. La exposición crónica a un antagonista de esteroides sexuales puede conducir a un agrandamiento ovárico^33,34, lo que puede deshabilitar la observación de sus efectos para fines a largo plazo debido a un fenotipo poco saludable. Además, es imposible realizar un experimento de recuperación después del tratamiento con antagonistas de esteroides sexuales, para garantizar el efecto específico de ciertos esteroides sexuales. Junto con esos puntos antes mencionados, otras compensaciones del uso de antagonistas de esteroides sexuales han sido ampliamente revisadas^31,32. Por lo tanto, la gonadectomía todavía aparece hoy en día como una técnica poderosa para investigar el papel de los esteroides sexuales.

Si bien las técnicas de gonadectomía y muestreo de sangre son relativamente fáciles de realizar en especies más grandes, como la lubina europea(Dicentrarchus labrax)^35,el pez cabeza azul(Thalassoma bifasciatum)^36,el cazón(Scyliorhinus canicula)³⁷ y el bagre(Heteropneustes fossilis y Clarias bathracus)^38,39,plantean desafíos cuando se aplican en peces pequeños como medaka. Por ejemplo, el uso del Sistema de Administración de Anestesia de Peces (FADS)⁴⁰ es menos factible y parece ser propenso a daños físicos excesivos para los peces pequeños. Además, un procedimiento de gonadectomía que se usa comúnmente para peces más grandes⁴⁰ no es adecuado para peces pequeños que requieren alta precisión para evitar daños excesivos. Finalmente, el muestreo de sangre es un desafío debido al acceso limitado a los vasos sanguíneos y la pequeña cantidad de sangre en esos animales. Por lo tanto, es importante un protocolo claro que demuestre cada paso de la gonadectomía y el muestreo de sangre en un pequeño teleósto.

Este protocolo demuestra los procedimientos paso a paso de la gonadectomía seguidos de la toma de muestras de sangre en la medaka japonesa, un pequeño pez de agua dulce nativo del este de Asia. Los medaka japoneses tienen un genoma secuenciado, varias herramientas moleculares y genéticas disponibles^25,y un sistema genético de determinación del sexo que permite la investigación de las diferencias sexuales antes de que las características sexuales secundarias o gónadas estén bien desarrolladas⁴¹. Curiosamente, los medaka japoneses poseen gónadas fusionadas contrariamente a muchas otras especies de teleóstos⁴². Estas dos técnicas combinadas toman solo 8 minutos en total y completarán la lista de protocolos de video ya existentes para esta especie que incluyeron el etiquetado de los vasos sanguíneos^43,patch-clamp en las secciones hipofisarias⁴⁴ y neuronas cerebrales^45,y el cultivo celular primario^46. Estas técnicas permitirán a la comunidad de investigación investigar y comprender mejor los roles de los esteroides sexuales en los mecanismos de retroalimentación, así como la plasticidad cerebral y pituitaria en el futuro.

Protocolo

Todas las experimentaciones y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida. Los experimentos con gonadectomía fueron aprobados por la Autoridad Noruega de Seguridad Alimentaria (FOTS ID 24305).

NOTA: Los experimentos se realizaron utilizando machos y hembras adultos (6-7 meses de edad, peso aprox. 0,35 g, longitud aprox. 2,7 cm) medaka japonés. El sexo se determinó distinguiendo las características sexuales secundarias, como el tamaño y la forma de la aleta dorsal y anal, como se describe en^42,47.

1. Preparación de instrumentos y soluciones

1. Preparar solución anestésica stock (0,6% Tricaine).
   1. Diluir 0,6 g de Tricaína (MS-222) en 100 ml de solución salina tampón de fosfato 10x (PBS).
   2. Distribuya 1 ml de la solución de material de tricaína en varios tubos de plástico de 1,5 ml y guárdelo a -20 °C hasta su uso.
2. Prepare agua de recuperación (solución de NaCl al 0,9%) agregando 18 g de NaCl en 2 L de agua de acuario. Guarde la solución a temperatura ambiente hasta su uso.
3. Prepare las herramientas de incisión rompiendo una maquinilla de afeitar en diagonal para obtener un punto afilado(Figura 1A).
4. Preparar la solución anticoagulante en sangre (0,05 U/μL de heparina sódica) diluyendo 25 μL de heparina sódica en 500 μL de 1x PBS. Conservar la solución anticoagulante a 4 °C hasta su uso.
5. Prepare dos agujas de vidrio de un capilar de vidrio de 90 mm de largo tirando de un capilar de vidrio con un arrancador de agujas(Figura 1B)siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: El diámetro exterior de la aguja de vidrio es de 1 mm, mientras que el diámetro interior es de 0,6 mm.
6. Prepare una tapa de tubo de plástico de 1,5 ml cortando la tapa y haga un orificio que encaje con el diámetro exterior de la aguja(Figura 1C). Para hacer el agujero, caliente un extremo del capilar de vidrio de 9 mm y apuñale el capilar de vidrio calentado a través de la tapa. Alternativamente, use una aguja para atravesar la tapa hasta que el diámetro del orificio encaje con el capilar de vidrio de 9 mm.

2. Procedimiento de gonadectomía

1. Prepare el 0,02% de la solución anestésica diluyendo un tubo de caldo de Tricaína (0,6%) en 30 ml de agua de acuario.
2. Prepare herramientas de disección que incluyan una ultrafina y dos fórceps finas (una con punta relativamente ancha), tijeras pequeñas, hilo de nylon y maquinilla de afeitar como se describe en el paso 1.3.
3. Anestesiar el pescado poniéndolo en la solución anestésica al 0,02% durante 30-60 segundos.
   NOTA: La duración de la anestesia depende del tamaño y peso del pez y debe adaptarse. Para asegurarse de que el pez esté completamente anestesiado, el cuerpo del pez se puede pellizcar suavemente con pinzas. Si el pez no reacciona, se puede iniciar la gonadectomía.
4. Saque el pez de la solución anestésica y colóquelo horizontalmente de lado, fuera del agua bajo un microscopio de disección.
5. Ovariectomía (OVX) en mujeres
   1. Retire los huevos ovipositados (huevos que cuelgan fuera del cuerpo femenino) si los hay y raspe las escamas en el área de la incisión(Figura 2A).
   2. Haga suavemente una incisión de aproximadamente 2-2.5 mm de largo entre las costillas, entre las aletas pélvica y anal(Figura 2A),usando la hoja de afeitar. Luego, pellizca suavemente el abdomen del pez mientras saca los ovarios poco a poco usando pinzas finas con punta ancha.
   3. Cortar el extremo de los ovarios con fórceps finos y colocar los ovarios a un lado (Figura 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de no romper el saco ovárico si es posible. Si el saco ovárico está roto, elimine cualquier rastro de gónada lo más completamente posible sin dejar incluso óvulos no ovulados.
6. Orquidectomía en varones
   1. Haga suavemente una incisión entre las costillas por encima del ano(Figura 2A)y abra la incisión lentamente con fórceps finos.
   2. Agarre suavemente los testículos con las pórceps finos y saque lentamente los testículos. Posteriormente, corte el extremo de los testículos para eliminar completamente los testículos (Figura 2B). Para la orquidectomía masculina, todas las preparaciones son similares a las de las hembras hasta la parte de la incisión. Al agarrar los testículos, a veces se obtiene la grasa que se asemeja a los testículos. Sin embargo, después de restaurar la grasa, es posible tratar de encontrar los testículos nuevamente (Figura 2B).
      NOTA: Tanto para hombres como para mujeres, es importante minimizar el tamaño de la incisión en el abdomen para evitar daños excesivos que pueden conducir a la mortalidad. A veces, los intestinos también pueden aparecer a través de la incisión junto con las gónadas, así que asegúrese de que se devuelvan correctamente dentro de la incisión antes del cierre. El conocimiento previo sobre la ubicación de los ovarios y los testículos en el abdomen medaka es esencial.
7. Suturar la incisión de manera similar en hombres y mujeres(Figura 3).
   1. Coloque el hilo de nylon al lado del área de la incisión y apuñale la piel desde el lado derecho de la incisión a través de la cavidad interna del cuerpo usando fórceps ultrafinas para tomar el hilo con fórceps finos (Figura 3; 1-2).
   2. Apuñalar la piel desde el lado izquierdo de la incisión a través de la cavidad externa del cuerpo para sacar el hilo ( Figura 3; 3-4).
   3. Cierre la abertura de la incisión y haga dos nudos y corte el hilo excesivo (Figura 3; 4-6).
      NOTA: La sutura debe estar adecuadamente apretada, y el hilo restante en el pez debe ser lo suficientemente largo como para evitar el aflojamiento de la sutura. Todo el procedimiento desde la anestesia hasta la sutura comúnmente toma hasta 6 minutos. Más tiempo puede conducir a la mortalidad.
   4. Coloque los peces en el agua de recuperación y déjelos durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario.
      NOTA: Los peces gonadectomizados generalmente muestran un comportamiento normal después de 1-2 horas en el agua de recuperación. Por lo tanto, dependiendo del propósito del experimento, se puede tomar muestras de los peces después de este intervalo de tiempo.

3. Procedimiento de muestreo de sangre

1. Prepare las herramientas: una aguja de vidrio, un capilar de silicona, un tubo de plástico con un orificio, un tubo de plástico vacío de 1,5 ml, una minicentrífuga y cinta.
2. Anestesiar el pescado usando una solución anestésica al 0,02% como se describe en el paso 2.1 y colocar el pez bajo un microscopio de disección en posición vertical(Figura 4A). Coloque el pez sobre una superficie brillante para facilitar la visualización de la vena de punción caudal.
3. Instale el cajón de sangre conectando una aguja de vidrio al capilar de silicona (Figura 4B). Rompa la punta de la aguja con pórceps de punta ancha y cubra el interior de la aguja con solución anticoagulante mediante succión y soplado.
   NOTA: Se recomienda el uso de una ventosa y un capilar de silicona con al menos 50 cm de longitud para medidas de seguridad para evitar cualquier contacto directo de la sangre al succionar. Además, asegúrese de que la abertura de la punta de la aguja sea lo suficientemente grande como para permitir la extracción de sangre.
4. Dirija la aguja hacia el área del pedúnculo del pez, apunte a la vena del pedúnculo caudal(Figura 5A)y extraiga la sangre con la boca hasta que se llene al menos una cuarta parte del volumen total de la aguja(Figura 5B).
   NOTA: Es importante dejar de succiones antes de retirar la aguja del cuerpo del pez.
5. Suelte la aguja y coloque un trozo de cinta adhesiva en la proximidad del lado afilado de la aguja. Coloque la tapa con un orificio en un tubo de recolección y coloque la aguja dentro del tubo a través del orificio con la punta de la aguja en el exterior (Figura 5C).
6. Coloque los peces en el agua de recuperación y déjelos durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario.
   NOTA: Para realizar una segunda muestra de sangre del mismo pez, tome muestras de sangre una semana después de la primera muestra de sangre.
7. Flash gire hacia abajo la sangre recolectada durante 1-2 segundos con 1,000 x g a temperatura ambiente para recolectar la sangre en el tubo.
8. Proceda directamente a las aplicaciones posteriores o almacene la sangre a -20 ° C hasta su uso.
   NOTA: Consulte el estudio anterior para la extracción de esteroides sexuales de la sangre total⁴⁸.

Resultados

Este protocolo describe cada paso para realizar gonadectomía y muestreo de sangre en un teleósto modelo de tamaño pequeño, el medaka japonés. La tasa de supervivencia de los peces después de la ovariectomía (OVX) en las hembras es del 100% (10 de cada 10 peces), mientras que el 94% (17 de 18 peces) de los machos sobrevivieron después de la orquidectomía. Mientras tanto, después de que se realizó el procedimiento de muestreo de sangre, todos los peces (38 peces) sobrevivieron.

Discusión

Como se informó en la literatura anterior, la gonadectomía y el muestreo de sangre se han utilizado durante mucho tiempo en otras especies modelo para investigar cuestiones relacionadas con el papel de los esteroides sexuales en la regulación del eje BPG. Sin embargo, estas técnicas parecen ser susceptibles sólo para animales más grandes. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño del modelo de teleósto comúnmente utilizado, el medaka japonés, proporcionamos un protocolo detallado para la gonadectomía y el muestreo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry