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Resumen

Los cambios fisiopatológicos en el sistema nervioso autónomo cardíaco, especialmente en su rama simpática, contribuyen al inicio y mantenimiento de las arritmias ventriculares. En el actual protocolo, mostramos cómo caracterizar los ganglios estrellado murine para mejorar la comprensión de los procesos moleculares y celulares subyacentes.

Resumen

El sistema nervioso autónomo es un conductor substancial de la electrofisiología cardiaca. Especialmente el papel de su rama comprensiva es una materia en curso de la investigación en la patofisiología de las arritmias ventriculares (VA). Las neuronas en los ganglios estrellados (SG)   – estructuras bilaterales en forma de estrella de la cadena simpática –   son un componente importante de la infraestructura simpática. Los SG son una blanco reconocida para el tratamiento vía la desnervación comprensiva cardiaca en pacientes con el VA terapia-refractario. Mientras que el remodelado neuronal y la activación glial en el SG se han descrito en pacientes con el VA, los procesos celulares y moleculares subyacentes que potencialmente preceden el inicio de la arritmia se entienden solamente escaso y se deben aclarar para mejorar la modulación autonómica. Los modelos de ratón nos permiten estudiar la remodelación neuronal simpática, pero la identificación del SG murino es un desafío para el investigador inexperto. Así, los estudios biológicos celulares y moleculares profundizados del SG murine están careciendo para muchas enfermedades cardiacas comunes. Aquí, se describe un repertorio básico para la disección y el estudio de la SG en ratones adultos para análisis a nivel de ARN (aislamiento de ARN para análisis de expresión génica, hibridación in situ), nivel de proteína (inmunofluorescente de montaje entero de tinción), y el nivel celular (morfología básica, medición del tamaño celular). Presentamos soluciones potenciales para superar los desafíos en la técnica de preparación, y cómo mejorar la tinción a través del temple de la autofluorescencia. Esto permite la visualización de neuronas, así como células gliales a través de marcadores establecidos con el fin de determinar la composición celular y los procesos de remodelación. Los métodos aquí presentados permiten caracterizar el SG para obtener más información sobre la disfunción autonómica en ratones propensos al VA y pueden complementarse con técnicas adicionales que investigan los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso autónomo en el corazón.

Introducción

El sistema nervioso autónomo cardíaco es un equilibrio estrechamente regulado de componentes simpáticos, parasimpáticos y sensoriales que permite al corazón adaptarse a los cambios ambientales con la respuesta fisiológica adecuada1,2. Las alteraciones en este equilibrio, por ejemplo, un aumento de la actividad simpática, se han establecido como un factor clave para la aparición, así como el mantenimiento de las arritmias ventriculares (AV)3,4. Por lo tanto, la modulación autonómica, lograda a través de la reducción farmacológica de la actividad simpática con betabloqueantes, ha sido una piedra angular en el tratamiento de pacientes con AV durante décadas5,6. Pero a pesar de las intervenciones farmacológicas y basadas en catéteres, un número relevante de pacientes todavía sufre de VArecurrente 7.

La entrada simpática al corazón está mediada principalmente a través de cuerpos celulares neuronales en los ganglios estrellados (SG), estructuras bilaterales en forma de estrella de la cadena simpática, que transmiten información a través de numerosos nervios intratorácicos desde el tronco encefálico hasta elcorazón 8,9,10. La brotación nerviosa del SG después de la lesión se asocia con el AV y la muerte súbita cardíaca11,12,destacando el SG como objetivo de la modulación autonómica13,14. Una reducción de la entrada simpática al corazón se puede lograr temporalmente a través de la inyección percutánea de anestésicos locales o permanentemente mediante la extirpación parcial de la SG a través de la toracoscopia asistida por video15,16. La denervación simpática cardíaca presenta una opción para los pacientes con AV refractaria a la terapia con resultados prometedores14,16,17. Hemos aprendido de la SG explantada de estos pacientes que la remodelación neuronal y neuroquímica, la neuroinflamación y la activación glial son sellos de remodelación simpática que podrían contribuir o agravar la disfunción autonómica18,19. Aún así, los procesos celulares y moleculares subyacentes en estas neuronas siguen siendo oscuros hasta la fecha, por ejemplo, el papel de la transdiferenciación neuronal en un fenotipo colinérgico20,21. Los estudios experimentales presentan nuevos enfoques para tratar el AV, por ejemplo, la reducción de la actividad nerviosa simpática a través de la optogenética22,pero la caracterización en profundidad de la SG todavía falta en muchas patologías cardíacas que van de la mano con el AV. Los modelos de ratón que imitan estas patologías permiten estudiar la remodelación neuronal que potencialmente precede a la aparición de arritmias12,23. Éstos se pueden completar por otros análisis morfológicos y funcionales para la caracterización autonómica del corazón y del sistema nervioso. En el presente protocolo, proporcionamos un repertorio básico de métodos que permiten diseccionar y caracterizar el SG murino para mejorar la comprensión del AV.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Hamburgo (ORG870, 959) y la Agencia Estatal de Renania del Norte-Westfalia para la Naturaleza, el Medio Ambiente y la Protección del Consumidor (LANUV, 07/11) y se ajustan a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (2011). Los estudios fueron realizados usando los ratones masculinos y femeninos (envejecidos 10-24 semanas) C57BL/6 (número común 000664, laboratorios de Jackson) y los ratones homocigóticos (db/db) o heterozigóticos (db/het; control) para la mutación espontánea de la diabetes (DbdeLepr; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, número de stock 000642, Jackson Laboratories). Los autores han utilizado los protocolos disponibles sin variaciones para ratones de hasta 60 semanas de edad.

1. Localización y disección de ganglios estrellado murinos

NOTA: A pesar de que las descripciones y dibujos están disponibles en su mayoría en especies más grandes, algunas publicaciones han descrito previamente la ubicación del SG en ratas24 y ratones25 utilizando métodos anatómicos y líneas de reportero fluorescente, respectivamente.

  1. Preparar 50 mL de solución salina tamponada por fosfato (PBS) helada (3-4 °C) heparinizada (20 unidades/mL, ver Tabla de Materiales)tamponada con fosfato. Realizar la disección del SG a temperatura ambiente (RT).
  2. Anestesiar profundamente el ratón por inhalación de isoflurano al 3%-5% de acuerdo con las directrices institucionales y locales. Verificar la anestesia adecuada por pérdida del reflejo de abstinencia del pedal. Decapitar ratones o realizar dislocación cervical.
    NOTA: La dislocación cervical incorrecta puede dar lugar a la rotura de la espina dorsal y al daño de los recipientes torácicos que llevan a la sangría que dificulta la preparación o la ruptura de la cadena comprensiva, de modo que los SG no estén en su posición correcta. Por lo tanto, es fundamental que el personal experimentado realice la dislocación cervical o decapitar a los animales en la sedación profunda.
  3. Rocíe la piel con etanol y abra el tórax con dos incisiones a lo largo de las líneas axilares anteriores usando tijeras mayo y escopas de patrón estrecho. Cortar el diafragma y retirar la parte delantera de la caja torácica.
  4. Retire el paquete corazón-pulmón agarrando la aorta y la vena cava justo encima del diafragma usando fórceps de Londres y cortando todos los vasos y tejido conectivo cerca de la columna vertebral de abajo con las tijeras del estrabismo.
  5. Enjuague el tórax a fondo con PBS heparinizado usando una pipeta desechable de plástico hasta que se eliminen todos los rastros de sangre.
  6. Coloque el torso bajo prismáticos de preparación de estereomicroscopio y asegure una buena iluminación en el tórax con fuentes de luz externas.
  7. Localice la primera costilla y los músculos longus colli.
    NOTA: Los SG están situados bilateralmente, paralelos a la columna vertebral en la rama entre la primera costilla y la columna vertebral, en un surco lateral a los músculos longus colli24. El lado plano del SG se encuentra adyacente a los músculos longus colli. Dependiendo de la preparación, partes de la cadena simpática ya podrían ser visibles como fibras blancas y oblicuas paralelas a la columna vertebral. Éstos se pueden remontar a lo largo del SG.
  8. Use suavemente la punta de las pinzas Dumont #5/45 para exponer el tejido conectivo lateral al músculo longus colli.
  9. Gire las pinzas alrededor de 180 ° y use el lado plano para agarrar el SG y sacarlo con una presión mínima.
  10. Repita con el segundo SG.
  11. Coloque ambos SG en un plato (6 cm de diámetro) lleno de PBS frío e inspeccione con el aumento adecuado. Si es necesario, elimine el exceso de vasos, el tejido graso y los nervios más grandes.
    NOTA: Los ganglios autonómicos están rodeados por una cápsula de tejido conectivo que consiste en fibras de colágeno y fibroblastos26,27. La permeabilidad de estas cápsulas parece variar entre especies, diferentes tipos de ganglios de26 años y28años. Retire tanto tejido conectivo como sea posible usando dumont #5/45 fórceps y, si es necesario, tijeras de resorte.
  12. Dependiendo del objetivo del experimento, continúe con la sección 2, 3 o 5 de este protocolo.

2. Protocolo de inmunohistoquímica de montaje completo

NOTA: Este protocolo está adaptado de las tinciones cardíacas de montura entera4,29. Realice los pasos de incubación para cada SG en un pozo de una placa de 96 pozos y use de 100 μL (para soluciones que contienen anticuerpos) a 200 μL (para todas las demás soluciones) de la solución para garantizar una cobertura completa. Comprobar regularmente la cobertura y correcta inmersión del SG con prismáticos. Retire los líquidos manualmente con una pipeta de 200 μL con una punta adicional de 10 μL encima de la punta de 200 μL. Esto evitará la aspiración del SG en la punta de la pipeta. Use soluciones recién preparadas y líquidos estériles para prevenir el crecimiento bacteriano.

  1. Fije el SG para la histología para 2 h en el RT en el paraformaaldehído metanol-libre del 4% (PFA) /PBS.
  2. Procese sg lo más rápido posible, pero se pueden almacenar durante 2-4 semanas a 4-6 °C en PBS con azida de sodio al 0,02% (p/v) en este punto.
  3. Preparar la solución de stock negro de Sudán (1% negro de Sudán w / v en etanol al 100%) para la reducción de la autofluorescencia y la mejora de la relación señal/fondo30. Disolver durante 2-3 h en un agitador magnético en RT.
    NOTA: Utilice la solución común durante un máximo de 6-8 semanas, deseche antes cuando aparezca la sedimentación.
  4. Prepare la solución de trabajo negro de Sudán centrifuminando la solución común durante 30 min a toda velocidad (13,000 x g)para eliminar los desechos y diluir el stock en etanol al 70% hasta una concentración final de 0.25% de negro de Sudán.
  5. Tratar la SG con lejía de Dent para mejorar la permeabilización de anticuerpos31. Prepare recientemente la lejía de Dent mezclando metanol (MeOH), solución de peróxido de hidrógeno al 30% (p/p) enH2O y dimetil sulfóxido (DMSO) en una proporción de 4:1:1. Añadir 200 μL por SG y colocar la placa en una coctelera orbital durante 1 h en RT.
  6. Realice una serie de MeOH descendente para la rehidratación incubando durante 10 minutos cada una en una coctelera orbital: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
  7. Realizar la permeabilización incubando SG dos veces durante 60 min cada una en PBS/1% Triton-X-100 a RT.
  8. Elimine la solución de permeabilización del SG y agregue la solución de trabajo negro de Sudán. Incubar durante 2 h en RT en una coctelera orbital.
  9. Mientras tanto, prepare una solución de bloqueo agregando al 5% de albúmina sérica bovina (BSA) de grado receptor y al 0,1% de Tritón-X-100 en PBS un recipiente de 15 mL y déjelo disolver en un agitador de rodillos durante aproximadamente 5-10 min. Decantar a través de un filtro de papel pre-plisado para eliminar los escombros.
  10. Retire el negro sudanés con mucho cuidado inclinando la placa y pipeteando cuidadosamente desde el lado vertical.
    NOTA: No es posible ver el SG en Sudán negro. Utilice una fuente de luz fuerte y trabajar lentamente. A partir de este paso, los SG se tiñen de negro, mejorando la visibilidad. Si se ve algún tejido conectivo adicional que rodea a SG en este punto, retírelo usando las fórceps de Dumont #5/45 y las tijeras de resorte.
  11. Añadir 200 μL de PBS/0,1% Tritón-X-100 (PBS-T) y lavar durante 5 min a RT en una coctelera orbital.
  12. Retirar el PBS-T aspirando con una pipeta y repetir 2 veces.
  13. Quitar PBS; añadir 200 μL de solución de bloqueo e incubar a 4 °C durante la noche en una coctelera orbital.
  14. Al día siguiente, prepare las soluciones agregando anticuerpos primarios en la solución de bloqueo. Adaptar las concentraciones de anticuerpos a partir de los protocolos establecidos.
    NOTA: Incluya un SG como control de anticuerpos sin anticuerpos primarios (incubado con anticuerpos preabsorbidos por antígeno o IgG, si está disponible, o tampón de bloqueo).
  15. Realizar incubación primaria de anticuerpos durante 36-48 h a 4 °C en una coctelera orbital. Para las mediciones del tamaño celular y la tinción de neuronas simpáticas, use anticuerpos contra la tirosina hidroxilasa (consulte la Tabla de materiales para obtener recomendaciones sobre anticuerpos).
    NOTA: Coloque la placa de 96 pozos en una cámara húmeda (por ejemplo, caja de plástico forrada con toallas de papel ddH2O humedecido) para evitar la evaporación en este punto.
  16. Retire la solución de anticuerpos cuidadosamente y agregue 200 μL de PBS-T. Coloque la placa en una coctelera orbital durante 30 min.
  17. Retire PBS-T y repita el paso de lavado 5 veces adicionales.
  18. Prepare la solución de trabajo de anticuerpos secundarios centrifuminando los anticuerpos secundarios fluorescentes marcados con Alexa durante 1 minuto a toda velocidad (13,000 x g)antes de su uso. Diluir los anticuerpos secundarios apropiados de acuerdo con los anticuerpos primarios 1:500 en la solución de bloqueo y añadir a SG. Añadir 1 μg/mL de bisbenzimida H33342 tricloruro (tinción de Hoechst) si se desea tinción nuclear. Incubar durante 12-24 h a 4 °C en una coctelera orbital.
  19. Retire la solución de anticuerpos con cuidado y agregue 200 μL de PBS-T. Coloque la placa en una coctelera orbital durante 30 min.
  20. Retire PBS-T y repita el paso de lavado 5 veces adicionales. Para el último paso, utilice PBS sin Tritón.
  21. Para la incrustación, esparcir 50-100 μL de medio de montaje fluorescente (ver Tabla de Materiales)en un portaobjetos de vidrio y colocar en preparación prismáticos. Use las fórceps Dumont #5/45 para recoger SG de la placa de 96 pocillos y elimine el exceso de líquido sumergiendo un extremo en un papel de filtro (por ejemplo, almohadilla de secado Whatman) y colóquelo en la gota.
  22. Utilice las #5/45 de Dumont para corregir el posicionamiento con el aumento adecuado.
  23. Coloque suavemente una cubierta de vidrio (20 mm x 20 mm) junto al SG y descienda lentamente.
    NOTA: El uso de demasiado medio de montaje dará lugar al movimiento del SG o al enredo de los nervios. Si eso sucede, retire rápidamente el cubrebocas y repita los pasos 2.9-2.21.
  24. Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad durante la noche en RT. El almacenamiento del espécimen teñido es posible durante al menos 4-6 semanas a 4 °C.

3. Hibridación in situ de montaje completo

NOTA: La hibridación in situ de montaje completo del SG está adaptada del órgano de corti32 y del protocolo comercial de fluorescencia de ARN in situ (ver Tabla de Materiales). Obtener sondas para los genes de interés y tampones y soluciones del proveedor. Todos los pasos de incubación se realizan en RT, si no se menciona lo contrario. Use PBS estéril. Si está interesado en tinción de varios SG en un pozo, utilice al menos 150 μL de tampones y soluciones.

  1. Realice la disección del SG según lo descrito en los pasos 1.1-1.13.
  2. Fije SG durante 1 h en 200 μL de PFA/PBS libre de MeOH al 4% en un pozo de una placa de 96 pozos colocada en una coctelera orbital.
  3. Lave el SG tres veces durante 30 minutos cada una en Tween-20/PBS del 0,1% en un agitador orbital.
  4. Deshidratar SG en la serie MeOH/PBS por incubación posterior en MeOH/PBS al 50%, MeOH/PBS al 70% y MeOH/PBS al 100% durante 10 min cada uno en una coctelera orbital.
  5. Guarde SG a -20 °C en 100% MeOH durante la noche.
  6. Al día siguiente, precalentar la incubadora a 40 °C. Compruebe la temperatura con un termómetro.
  7. Rehidrate SG en series Inversas de MeOH/PBS (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) durante 10 min cada una.
  8. Lave sg tres veces durante 5 minutos cada una en PBS.
  9. Mientras tanto, comience a precalentar las sondas por incubación a 40 °C durante 10 min, seguido de enfriamiento durante 10 min.
  10. Incubar SG en 200 μL de Proteasa III durante 15 min.
  11. Opcional: Realice el tratamiento negro de Sudán para apagar la autofluorescencia de acuerdo con las secciones 2.3, 2.4 y 2.8 de este protocolo si se planean tinciones de inmunofluorescencia posteriores.
  12. Lavar sg en 200 μL de Tween-20/PBS 3x al 0,1% durante 5 min cada uno en una coctelera orbital.
  13. Opcional: Si se desea la tinción co-tinción con varias sondas, diluya la sonda Channel-2 (50x) y la sonda Channel-3 (50x) en la sonda Channel-1 (1x).
  14. Cubrir sg con 100 μL de sonda para el gen de interés e incubar durante la noche a 40 °C con ligera agitación. Coloque la placa de 96 pozos en una cámara húmeda a 40 °C para todos los pasos de incubación.
    NOTA: Incluya un SG como control negativo, utilizando una sonda contra un gen bacteriano (por ejemplo, dihidro-dipicolinato reductasa, Dapb)para comprobar si hay una unión no específica de los reactivos de amplificación en pasos posteriores.
  15. Lave sg en el tampón de lavado suministrado 3x durante 15 minutos cada uno en una coctelera orbital.
  16. Pre-caliente Amp1-3, HRP-C1, y HRP-Blocker a RT. Si se desea la tinción co-tinción con la sonda Channel-2 y/o Channel-2, HRP-C2 y HRP-C3 precalentos.
  17. Re-fije el SG por el minuto 10 en el RT en el 4% PFA/PBS en una coctelera orbital.
  18. Lavar sg en 200 μL de tampón de lavado suministrado 3x durante 5 min cada uno en una coctelera orbital en RT.
  19. Para la amplificación, incubar SG con 100 μL de Amp1 durante 35 min a 40 °C en un agitador orbital.
  20. Retire cuidadosamente cualquier líquido y lave la SG en 200 μL de tampón de lavado suministrado 3x durante 5 min cada uno a RT en una coctelera orbital.
  21. Incubar SG con 100 μL de Amp2 durante 35 min a 40 °C en una coctelera orbital.
  22. Repita el paso 3.18.
  23. Incubar SG con 100 μL de Amp3 durante 20 min a 40 °C en una coctelera orbital.
  24. Repita el paso 3.18.
  25. Incubar SG con 100 μL de Multiplex FL v2 HRP-C1 suministrado durante 20 min a 40 °C en una coctelera orbital.
  26. Repita el paso 3.18.
  27. Preparar el anticuerpo secundario conjugado con ópalo 1:1.000 en 200 μL de TSA-tampón suministrado e incubar SG durante 35 min a 40 °C en una coctelera orbital. Proteger de la luz durante la incubación y de este paso en.
  28. Repita el paso 3.18.
  29. Incubar SG en 100 μL de multiplexx FL v2 HRP-blocker suministrado durante 15 min a 40 °C en una coctelera orbital.
  30. Repita el paso 3.18.
  31. Opcional: Para la tinción co-tinción con la sonda Channel-2, repita los pasos 3.25-3.30 con multiplexx FL v2 HRP-C2 suministrado.
  32. Opcional: Para la tinción co-tinción con la sonda Channel-3, repita los pasos 3.25-3.30 con multiplexx FL v2 HRP-C3 suministrado.
  33. En caso de tinción inmunofluorescente posterior, realice los pasos 2.13-2.25 de este protocolo.
  34. Incubar en BSA/PBS al 1% durante 30 min en una coctelera orbital.
  35. Incubar SG durante 30 min en 1 μg/mL de tricloruro de bisbenzimida H33342 (tinción de Hoechst) en BSA/PBS al 1% si se desea tinción nuclear y/o añadir aglutinina de germen de trigo acoplada a Alexa (WGA, 1:500) en una coctelera orbital.
  36. Repita el paso 3.18.
  37. Incrustar como se describe en los pasos 2.19-2.22.

4. Imágenes y análisis de ganglios estrellados murinos

  1. Realice la microscopia confocal del SG encajado en la facilidad local de la proyección de imagen.
  2. Si se requieren mediciones de tamaño de celda, imagen SG teñida para tirosina hidroxilasa (ver Tabla de Materiales)a un aumento de 200x y tomar 4-6 imágenes aleatorias de cada SG.
  3. Analice imágenes utilizando el software ImageJ33 para estimar el tamaño de la celda (por ejemplo, con una tabla de lápiz, consulte Tabla de materiales). Utilice selección de manos libres, círculo de cada celda y haga clic en Analizar | Medida para obtener el área celular. Tenga cuidado de incluir sólo las células intactas, totalmente visibles que se encuentran bien dentro de la SG.
  4. Usando este método, realice la medida de aproximadamente 100 células por SG.
  5. Haga que un investigador ciego realice los pasos 4.2-4.3 si desea comparar sg de diferentes ratones. Utilice una distribución de frecuencias en un software estadístico para visualizar las diferencias de tamaño entre los grupos34.

5. Análisis moleculares de ganglios estrellados murinos

NOTA: Incluya controles dependiendo de su diseño experimental. Podría tratarse de SG con diferentes genotipos y antecedentes de enfermedad y/u otros ganglios autonómicos, como el ganglio cervical superior simpático (situado en la zona del cuello, ver descripción detallada en Ziegler et al.35)o ganglios parasimpáticos (como los ganglios intracardiacos, ver Jungen et al.4).

  1. Preparar un tubo de 2 mL con 500 μL de solución de tiocianato de fenol/guanidina (por ejemplo, Qiazol) por animal y tener nitrógeno líquido listo para el glaseado por choque o considerar soluciones comerciales para la protección del ARN (opcional, ver Tabla de Materiales)36. Trabaje rápidamente para el aislamiento del ARN.
  2. Realice la disección del SG según lo descrito en los pasos 1.1-1.13.
  3. Sumerja inmediatamente ambos SG directamente en un tubo con solución de tiocianato de fenol/guanidina y tubo de escarcha en nitrógeno líquido.
  4. Conservar a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
  5. Para la lisis tisular, deje que los tubos con SG se descongele hasta que la solución de tiocianato de fenol/guanidina esté licuada y agregue dos perlas de acero inoxidable de 7 mm. Enfríe las partes metálicas del homogeneizador de tejidos (molino de bolas o mezclador, por ejemplo, Tissue Lyser II) en hielo seco y centrífuga a 4 °C.
  6. Tubos centrífugos a 500 x g durante 1 min a 4 °C para que los SG estén en la parte inferior del tubo.
  7. Coloque tubos en las partes metálicas del Tissue Lyser y lise durante 1 min a 20 Hz.
  8. Repita los pasos 5.6 y 5.7 hasta 5 veces hasta que no se detecte ningún tejido intacto.
  9. Transfiera el líquido a un tubo fresco de 1,5 mL.
  10. Realice el aislamiento de ARN con un kit de aislamiento de ARN basado en columnas (por ejemplo, mini kit miRNeasy) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  11. Elute RNA en 20 μL de agua libre de ARNasa y medir la concentración utilizando un espectrofotómetro.
    NOTA: Para excluir la contaminación del ARN purificado con ADN genómico, proponemos realizar una reacción en cadena de la polimerasa con cebadores genómicos y 1 μL de ARN como plantilla, en lugar de menos el control de la transcriptasa inversa. Esto ahorrará una cantidad significativa de ARN. Si el ARN está contaminado, utilice cebadores de límite exón-intrón o cebadores de flanqueo de intrón para la posterior reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real.
  12. Utilice el ARN SG de 250 ng para realizar la síntesis del cDNA y utilice los protocolos establecidos. Aquí, se utilizó un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  13. Diluir a una concentración final de 2,5 ng/μL de ADNc y realizar una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real con las sondas adecuadas según los protocolos establecidos. Aquí, el ensayo de TaqMan (ver Tabla de Materiales)se realizó utilizando 10 ng de ADNc por reacción.
    NOTA: Realice el control sin plantilla para cada gen para excluir los resultados falsos positivos.
  14. Normalice la expresión génica de su gen de interés en un gen de mantenimiento de la casa (por ejemplo, Cdkn1b)para comparar la expresión génica relativa entre diferentes grupos de SG.

Resultados

La Figura 1 visualiza cómo identificar y diseccionar el SG. La Figura 1A muestra un dibujo esquemático de la ubicación, mientras que la Figura 1B presenta la vista hacia el tórax después de la eliminación del paquete corazón-pulmón. Los músculos longus colli izquierdo y derecho medial del SG y la caja torácica son puntos de referencia importantes para la orientación. La disección se realiza a lo largo de las líneas punt...

Discusión

La comprensión de los procesos celulares y moleculares en neuronas y células gliales del sistema nervioso simpático que preceden a la aparición del AV es de alto interés, ya que la parada cardíaca súbita sigue siendo la causa más común de muerte en todo el mundo5. Por lo tanto, en el manuscrito actual, proporcionamos un repertorio básico de métodos para identificar el SG murino , un elemento murino dentro de esta red , y realizar análisis posteriores a nivel de ARN, proteína y celular...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Hartwig Wieboldt por su excelente asistencia técnica, y al Centro de Microscopía de Imágenes UKE (Umif) del Centro Médico Universitario Hamburgo-Eppendorf por proporcionar microscopios y apoyo. Esta investigación fue financiada por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

Referencias

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